莲子心提取物毛细管电泳指纹图谱研究.pdf

1、中国医药生物技术 2009 年 10 月第 4 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2009, Vol. 4, No. 5 345 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2009.05.005 论著 莲子心提取物毛细管电泳指纹图谱研究 林文津，徐榕青，张亚敏，许郑伟 【 摘要 】 目的 建立中药材莲子心提取物毛细管电泳（ HPCE）指纹图谱。 方法 制备莲心碱对照品溶液和 10 批莲子心提取物供试品溶液。采用毛细管区带电泳模式压力进样，分析 10 批莲子心提取物供试品所有的峰数、 峰值和峰位等参数以及色谱图，建立 HPCE 指纹

2、图谱，并利用“中药指纹图谱相似度评价系统（ 2004A） ”软件分析其指纹图谱的相似度。 结果 选定 15 个共有峰作为构成莲子心提取物指纹图谱稳定的特征峰，建立 HPCE 指纹图谱。相似度评价分析结果表明 10 批莲子心提取物 HPCE 指纹图谱相似度均在 0.900 1.000 之间，表明其指纹图谱整体面貌基本一致。 结论 建立的莲子心提取物 HPCE 指纹图谱稳定、可靠，可作为莲子心提取物的特征指纹图谱， 为莲子心提取物的定性鉴别及内在质量评价提供了新的参考依据。 【 关键词 】 莲子心； 电泳，毛细管； 色谱法； 中草药 中国医药生物技术 , 2009, 4(5):345-349 莲

3、子心始载于神农本草经 ，列为上品，为常用中药材，历来被认为是药食之佳品，在传统中医药中占有重要地位。 中国药典 （ 2005 年版）收载莲子心为睡莲科植物莲 Nelumbo mucifera Gaertn. 成熟种子中的干燥幼叶及胚根，其味甘性寒，入心、肾二经，具有清心安神、交通心肾、涩精止血的功效，用于热入心包、神昏谵语、心肾不交、失眠遗精、血热吐血1。莲子心主要成分为异喹啉类生物碱，目前，莲子心生物碱分离鉴定和含量分析方面的研究报道较多2-3，亦有多糖4、黄 酮5、非酚性生物碱和非生物碱类6研究的报道，但尚未见有毛细管电泳指纹图谱方面的研究报道据中国生物医学文献数据库（ CBM） 、重庆维

4、普、清华同方等数据库检索。基于此，我们采用毛细管区带电泳（ capillary zone electrophoresis， CZE）法对莲子心提取物指纹图谱进行了初步研究，以期为有效控制莲子心提取物的质量提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器 P/ACE MDQ 高效毛细管电泳（ HPCE）仪为美国贝克曼库尔特有限公司产品，未涂层熔融石英毛细管（ 57 cm 50 m，有效长度 47.5 cm）为河北省永年锐沣色谱器件有限公司产品， AL204 电子天平为梅特勒 -托利多仪器（上海）有限公司产品， SK3310HP 超声波清洗器为上海科导超声仪器有限公司产品，艾科浦超纯

5、水系统为重庆颐洋企业发展有限公司产品。 1.1.2 试剂 莲子心饮片（批号 20080215）购自福建文鑫莲业食品有限公司， 10 批莲子心提取物由本实验室自行制备批号（样品号）分别为 20080414（ S1） 、 20080415（ S2） 、 20080416（ S3） 、20080417（ S4） 、 20080418（ S5） 、 20080421（ S6） 、20080422（ S7） 、 20080423（ S8） 、 20080424（ S9） 、20080425（ S10），莲心碱对照品购自 DELTA（甙尔塔）天然有机化合物信息中心（生产时间：200809） ，色谱纯甲醇购

6、自上海星可生化有限公司，硼酸和 NaOH 购自上海联试化工试剂有限公司。 1.2 方法 1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取莲心碱对照品 5.0 mg，置于 5 ml 量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，获得浓度为 1.0 mg/ml 的莲心碱对照品溶液。 1.2.2 供试品溶液的制备 取莲子心提取物样品粉末约 10 mg，精密称定，置于 10 ml 量瓶中，用 10 ml 甲醇超声 30 min 溶解后，定容至刻度并摇匀， 进样前用 0.45 m 微孔滤膜滤过， 取中段滤液。 1.2.3 HPCE 色谱条件 采用 CZE 模式，压力 0.5 磅 /平方英寸（ psi， 1 psi 6894.

7、76 Pa） 、维持 10 s 进样，分离电压 30 kV，柱温 25 ，二极管阵列检测器（ diode-array detector， DAD）检测波 基金项目：福建省科技计划重点项目（ 2007Y0013） 作者单位： 350001 福州，福建省医学科学研究所 /福建省医学测试重点实验室 通讯作者： 林文津 ， Email： 收稿日期： 2009-06-02 346 中国医药生物技术 2009 年 10 月第 4 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2009, Vol. 4, No. 5 长为 282 nm，运行缓冲液由 0.1 mol/L 硼酸、 0

8、.1 mol/L KOH 按 4:2 的比例配置（ pH 8.90） 。每次进样前依次用水和缓冲液各冲洗 2 min，分析时间 7 min。 1.2.4 HPCE 方法学验证 1.2.4.1 精密度实验 取 S1 号样品连续进样 5 次，计算莲子心指纹图谱 15 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，相对标准偏差（ RSD）均小于 0.5% 和 3.0%，表明精密度良好。 1.2.4.2 稳定性实验 取 S1 号样品分别在 0、2、 4、 8、 12 h 时进样测定，莲子心指纹图谱 15 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD 均小于 1.0% 和 3.0 %，说明供试品溶液在 12 h

9、内稳定性良好 。 1.2.4.3 重现性实验 取 S1 号样品 5 份，依“ 1.2.4.2” 中方法测定， 计算莲子心指纹图谱 15 个共有峰相对保留时间和相对峰面积， RSD 均小于 1.0% 和 3.0 %，表明该方法重现性良好。 2 结果 2.1 样品分离效果 采用验证优化后的 HPCE 工作条件，测定对照品溶液和供试品溶液，比较对照品及供试品溶液色谱图，确定第 14 号峰（峰值 t = 4.54）为莲心碱对照品峰（图 1） ，结果显示色谱峰峰形较好，可准确测定其保留时间、峰面积及峰高并进行指纹图谱分析。 图 1 莲子心提取物 HPCE 色谱图 Figure 1 Chromatogra

10、m of plumula nelumbinis extract by HPCE 2.2 指纹图谱的建立 对测得的 10 批莲子心提取物供试品所有的峰数、峰值和峰位等参数以及色谱图进行比较分析，从中选定 15 个共有峰作为构成莲子心提取物 指纹图谱稳定的特征峰（图 2） ，其中第 8 号峰为莲心碱对照品峰， 15 个共有峰的峰面积总和占总峰面积的 99% 以上。 图 3 为 10 批莲子心提取物指纹图谱的叠加图。 图 2 莲子心提取物 HPCE 指纹图谱特征峰 Figure 2 Characteristic absorption band of fingerprint spectrum of p

11、lumula nelumbinis extract by HPCE 图 3 10 批莲子心提取物 HPCE 指纹图谱叠加图 Figure 3 Layout chart of fingerprint spectrum of 10 batches plumula nelumbinis extract by HPCE 2.3 指纹图谱分析与评价 将各指纹图谱保留时间与莲心碱对照品（第 8 号峰）的保留时间进行比较，其比值为各指纹图谱的相对保留时间， 10 批莲子心提取物指纹图谱中各共有峰的相对保留时间见表 1；以莲心碱对照品峰（第 8 号峰）的峰面积作为 1，其他各共有峰的相对峰面积见表 2。 将测

12、试数据导入中国药典委员会推荐的“中药指纹图谱相似度评价系统（ 2004A） ”软件，校正后将图谱自动匹配，生成对照图谱，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。然后通过软件计算出莲子心提取物 HPCE 指纹图谱共有图谱，并与共有图谱比较，分析 10 批莲子心提取物的相似度，结果表明 10 批莲子心提取物相似度均在 0.900 1.000 之间，说明本实验莲子心提取物品质基本一致（表 3） 。 中国医药生物技术 2009 年 10 月第 4 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2009, Vol. 4, No. 5 347 表 1 10 批莲子心提取物 HPCE

13、指纹图谱共有峰的相对保留时间 Table 1 Relative retention time of fingerprint spectrum of 10 batches plumula nelumbinis extract by HPCE 样品号 Sample number 峰号 Peak number S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 均值 Mean RSD（ %） P1 0.466 0.469 0.467 0.463 0.465 0.463 0.464 0.464 0.461 0.461 0.464 0.55 P2 0.535 0.540 0.539 0.535

14、 0.535 0.532 0.534 0.534 0.531 0.530 0.535 0.59 P3 0.864 0.865 0.865 0.864 0.865 0.864 0.865 0.864 0.863 0.863 0.864 0.09 P4 0.875 0.876 0.876 0.875 0.876 0.875 0.876 0.875 0.874 0.875 0.875 0.08 P5 0.890 0.891 0.891 0.890 0.891 0.890 0.891 0.890 0.889 0.890 0.890 0.08 P6 0.907 0.908 0.907 0.908 0.9

15、09 0.906 0.908 0.907 0.906 0.907 0.907 0.10 P7 0.978 0.978 0.979 0.979 0.979 0.978 0.979 0.979 0.978 0.977 0.978 0.07 P8 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00 P9 1.013 1.013 1.013 1.014 1.014 1.013 1.014 1.013 1.013 1.013 1.013 0.05 P10 1.031 1.029 1.030 1.032 1.034

16、1.034 1.035 1.032 1.032 0.973 1.026 1.83 P11 1.067 1.064 1.064 1.066 1.069 1.069 1.070 1.066 1.068 1.069 1.067 0.20 P12 1.063 1.073 1.073 1.076 1.078 1.076 1.078 1.075 1.076 1.076 1.074 0.40 P13 1.099 1.096 1.097 1.101 1.104 1.103 1.106 1.100 1.101 1.102 1.101 0.28 P14 1.137 1.133 1.134 1.139 1.143

17、1.142 1.145 1.139 1.141 1.141 1.139 0.34 P15 1.224 1.224 1.225 1.229 1.231 1.227 1.229 1.227 1.228 1.227 1.227 0.19 表 2 10 批莲子心提取物 HPCE 指纹图谱共有峰的相对峰面积 Table 2 Relative peak area of fingerprint spectrum of 10 batches plumula nelumbinis extract by HPCE 样品号 Sample number 峰号 Peak number S1 S2 S3 S4 S5 S6

18、 S7 S8 S9 S10 均值 Mean RSD（ %） P1 0.077 0.056 0.050 0.088 0.092 0.069 0.097 0.074 0.091 0.092 0.079 20.71 P2 0.245 0.251 0.248 0.291 0.309 0.274 0.307 0.293 0.274 0.325 0.282 9.91 P3 0.037 0.036 0.035 0.043 0.037 0.037 0.041 0.040 0.042 0.037 0.039 7.17 P4 0.051 0.049 0.048 0.057 0.050 0.051 0.055 0.

19、056 0.057 0.050 0.052 6.62 P5 0.400 0.414 0.422 0.423 0.381 0.428 0.414 0.454 0.434 0.395 0.417 5.01 P6 0.063 0.060 0.056 0.063 0.068 0.060 0.062 0.054 0.064 0.052 0.060 8.17 P7 1.594 1.316 1.548 1.374 1.334 1.346 1.388 1.408 1.378 1.334 1.402 6.71 P8 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

20、1.000 1.000 1.000 0.00 P9 0.193 0.198 0.234 0.188 0.207 0.186 0.177 0.187 0.185 0.188 0.194 8.30 P10 0.189 0.198 0.182 0.182 0.179 0.144 0.151 0.171 0.166 0.175 0.174 9.51 P11 0.104 0.142 0.124 0.113 0.112 0.107 0.104 0.114 0.109 0.103 0.113 10.53 P12 0.246 0.237 0.231 0.264 0.300 0.239 0.279 0.258

21、0.258 0.300 0.261 9.53 P13 0.044 0.042 0.040 0.049 0.063 0.044 0.054 0.049 0.050 0.061 0.050 15.65 P14 0.198 0.196 0.198 0.233 0.250 0.207 0.237 0.225 0.219 0.254 0.222 9.77 P15 0.035 0.037 0.030 0.034 0.044 0.034 0.040 0.032 0.034 0.047 0.037 14.70 表 3 10 批莲子心提取物 HPCE 指纹图谱的相似度 Table 3 Similarity of

22、 fingerprint spectrum of 10 batches plumula nelumbinis extract by HPCE 样品号 Sample number S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 相似度 Similarity 0.961 0.963 0.962 0.967 0.918 0.973 0.955 0.964 0.958 0.927 3 讨论 我们在电泳条件优化过程中发现，选用硼砂与磷酸类缓冲液产生的电流较大，不适合在高电压下进行分析，而采用硼酸溶液与 KOH 溶液作为缓冲液，电流较小，所产生的焦耳热较小，可以适用于高电压分析；在硼酸溶液与

23、 KOH 溶液的配比比例方面，硼酸溶液所占的比例越高电流越小，但电流过小会影响样品的分离度，所以经优化后我们采用了 4:2 的比例；另外，随着分析电压的升高（ 20 30 kV） ，电流会有所增加（ 18.4 28.3 A） ，这不但能提高分离度，而且也缩短了分析时间，更便于快速检测分析。 在本实验中，为易于辨认和分析，莲子心提取物 HPCE 指纹图谱可分为 4 个区： I 区，保留时 348 中国医药生物技术 2009 年 10 月第 4 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2009, Vol. 4, No. 5 间 2.00 3.80 min，出现第 1

24、、 2 号 2 个特征峰，最强峰为第 2 号峰，其单峰面积占总峰面积 7.36%（ RSD = 7.57%） ， 其中的负峰为溶剂峰； II 区，保留时间 3.80 4.30 min， 出现第 3 6 号 4 个特征峰，最强峰为第 5 号峰，其单峰面积占总峰面积 8.95%（ RSD = 6.09%） ； III 区， 保留时间 4.30 4.80 min，出现第 7 11 号 5 个特征峰，最强峰为第 7 号峰，其次为第 8 号峰，单峰面积占总峰面积分别为 30.23%（ RSD = 5.96%）和 22.66%（ RSD = 2.10%） ； IV 区， 保留时间 4.80 6.00 mi

25、n，出现第 12 15 号 4 个特征峰，最强峰为第 12 号峰，单峰面积占总峰面积 6.80%（ RSD = 6.92%） 。另外，在指纹图谱中第 2、 5、 7、 8、 12 号 5 个强峰的峰面积约占总峰面积的 76.00%（ RSD = 1.22%） ，总体看来， 4 个区段中表观峰度最强的是 III 区，莲心碱对照品峰就出现在该区，其次是 II 区、 I 区和 IV 区。 现今，按照暂行的中药注射剂图谱研究的技术要求，制定指纹图谱所需的技术参数主要有三个：首先，必须根据参照物的迁移时间计算指纹峰的相对保留时间，标定共有指纹峰；其次，以参照物的峰面积作为 1，计算各共有指纹峰面积与参照

26、物峰面积的比值，各共有指纹峰面积比值必须相对固定；最后，供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的 10%。 对获得的指纹图谱进行科学有效的评价是指纹图谱技术研究中的重要组成部分，是使用指纹图谱技术建立中药质量控制体系中的重要环节，也是指纹图谱得以广泛应用的前提。合格品的相似度一般要求在 0.9 1.0。本实验方法学考察结果显示，研究方法的精密度、稳定性、重复性均良好，指纹峰的相对保留时间和相对峰面积稳定， 10 批供试品相似度均在 0.90 以上，共有峰面积大于 95%，符合指纹图谱 研究的技术要求。综上，本实验建立的莲子心提取物 HPCE 指纹图谱稳定、可靠，可作为莲子心

27、提取物的特征指纹图谱；制备的莲子心提取物化学成分比较稳定、一致，为莲子心提取物的定性鉴别及内在质量评价提供了新的参考依据。 参考文献 1 Chinese Pharmacopoeia Commission. The Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China. Volume 1, 2005. Beijing: Chemical Industry Press, 2005:193. (in Chinese) 国家药典委员会 . 中国人民共和国药典 . 2005 年版一部 . 北京 : 化学工业出版社 , 2005:193. 2 Chen CG, Do

28、ng L. Research progress on extraction and separation of liensinine. J Chem Ind Eng, 2008, 29(2):21-25. (in Chinese) 陈昌国 , 董兰 . 莲心碱提取分离的研究进展 . 化学工业与工程技术 . 2008, 29(2):21-25. 3 Li WL, Chen JH, Yin YF, et al. Analysis of alkaloids in semen nelumbinis by accelerated solvent extraction-high performance l

29、iquid chromatography-diode array detection-electrospray ioninztion-time of flight-mass spectrometry. Chin J Anall Chem, 2008, 36(1):79-82. (in Chinese) 李文龙 , 陈军辉 , 殷月芬 , 等 . 加速溶剂萃取 -高效液相色谱 -电喷雾飞行时间质谱联用分析莲子心中生物碱 . 分析化学 , 2008, 36(1): 79-82. 4 Yu YZ, Wu YL, Pan YJ. Extraction, isolation and antioxidan

30、t activity of the polysaccharides from embryo of the seeds of Nelumbo nucifera Gaertn. J Zhejiang Univ (Sci Ed), 2008, 35 (1):48-51. (in Chinese) 俞远志 , 吴亚林 , 潘远江 . 莲子心多糖的提取、分离和抗氧化活性研究 . 浙江大学学报 (理学版 ), 2008, 35 (1):48-51 5 Xia JH, Tao R, Fan NB, et al. Ultraviolet Spectrophotometric determination of

31、content of total flavonoid in plumula nelambinis. J Nanjing Univ Traditional Chin Med, 2008, 24(2):116-118. (in Chinese) 夏稼红 , 陶冉 , 范乃兵 , 等 . 紫外分光光度法测定莲子心总黄酮的含量 . 南京中医药大学学报 . 2008, 24(2):116-118. 6 Tao R, Pan Y, Jiang YP, et al. Studies on the nonphenolic alkaloids and non-alkaloid constituents of p

32、lumule of Nelumbo Nucifera. J Nanjing Univ Traditional Chin Med, 2008, 24(3):173-175. (in Chinese) 陶冉 , 潘扬 , 蒋亚萍 , 等 . 莲子心非酚性生物碱和非生物碱类成分的研究 . 南京中医药大学学报 . 2008, 24(3):173-175. Study on fingerprint spectrum of plumula nelumbinis extract by HPCE LIN Wen-jin, XU Rong-qing, ZHANG Ya-min, XU Zheng-wei 【 A

33、bstract】 Object To establish the fingerprint spectrum of plumula nelumbinis extract by HPCE. Methods Prepared the liensinine reference substance solution and 10 batches plumula nelumbinis extract solution. Using capillary zone electrophoresis (CZE) patterns and pressure sample introduction, analyzed

34、 the peak number, peak value, peak position, and the chromatogram of all the 10 batches plumula nelumbinis extract, established the HPCE fingerprint spectrum, and evaluated the similarity of fingerprint spectrum of 10 batches plumula nelumbinis by the software of the similarity evaluation system of

35、Traditional Chinese Medicine fingerprints (edition 2004A). 中国医药生物技术 2009 年 10 月第 4 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2009, Vol. 4, No. 5 349 Results Fifteen common peaks were identified as the stable characteristic peaks of fingerprint spectrum of plumula nelumbinis extracts, and established the H

36、PCE fingerprint spectrum. The similarities of 10 batches plumula nelumbinis extract were between 0.900 and 1.000, indicated that the global features of the HPCE fingerprint spectrum were coincidental essentially. Conclusions The established HPCE fingerprint spectrum of plumula nelumbinis extracts wa

37、s stable and credible, and could be used as characteristic fingerprint spectrum for plumula nelumbinis extract. And it will be a new reference for qualitative identification and quality evaluation of plumula nelumbinis extract. 【 Key words】 Plumula nelumbinis; Electrophoresis, capillary; Chromatogra

38、phy; Drugs, Chinese herbal Author Affiliation: Fujian Institute of Medical Sciences, Fujian Key Laboratory of Medical Measurement, Fuzhou 350001, China Corresponding Author: LIN Wen-jin, Email: Chin Med Biotechnol, 2009, 4(5):345-349 中国生物制品学杂志稿约 中国生物制品学杂志为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新研究进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊， 1988 年创刊，月刊。 本刊主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域，如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床医学等方面的研究、生产、使用和质控等学术文章。在选择来稿时注重学术性、前沿性和实用性。优先报道基金项目及各种基金赞助课题的文章，并适当照顾边远地区和基层单位。设有基础研究、治疗制品、预防制品、诊断制品、实验技术与方法、临床观察、研究简报、综述、述评、会议快讯、消息动态等栏目。 主管：国家卫生部 主办：中华预防医学会 E-mail： http:/ 电话（传真） ： 0431-87923344，0431-87910140