1、文章编号 : 1007 - 8738 (2003) 03 - 232 - 03脑啡肽和多巴胺在大鼠实验性脑震荡脑组织中的表达及意义彭瑞云 1 , 高亚兵 1 , 王德文 1 , 肖兴义 2 , 陈浩宇 1 , 吴小红 1 , 刘 杰 1 , 徐龙河 1 , 胡文华 1(1 军事医学科学院放射医学研究所 , 北京 100850 ; 2解放军第 205 医院急诊科 , 辽宁 锦州 121001)收稿日期 : 2002 - 06 - 10 ; 修回日期 : 2002 - 09 - 09基金项目 : 全军”十五”医药卫生科研基金面上项目资助 (No. 01MB003)作者简介 : 彭瑞云 (19662
2、) , 女 , 河南商丘人 , 副研究员 , 医学博士 .Tel. (010) 66931236 , Email :RuiyunPeng18 yahoo. com. cnExpression and signif icance ofenkephalin and dopamine in experimen2tal rat cerebral concussion tissuePEN G R ui2yun1 , GA O Ya2bing1 , W A N G De2wen1 ,X IA O Xing2yi2 , CHEN Hao2yu1 , W U Xiao2hong1 ,L IU Jie1 , X
3、 U L ong2he1 , HU Wen2hua11Institute of Radiation Medicine , Academy of Military MedicalSciences , Beijing 100850 ; 2205th Hospital of PLA , Jinzhou121001 , ChinaAbstractAIM : To explore the expression and significance of enkephalin anddopamine in rat cerebral concussion tissue. METHODS : 80 Wistarm
4、ale rats were used to make animal model of cerebral concus2sion, which were sacrificed on 1 , 3 , 7 , 14 and 30 days afterpostconcussion and the brain tissues were taken out. The ex2pression patterns of enkephalin and dopamine were studied inthe course of cerebral concussion by immunohistochemical s
5、tain2ing. RESULTS : The clinical manifestation with typical cerebralconcussion character was seen in rat group with 100 g bodyweight. The mainly pathologic changes were cerebral vascularconstriction and dilatation , congestion and edema of cerebraltissue and neuronal degeneration and necrosis. Expre
6、ssion ofenkephalin was increased on day 1 after injury and theenkephalin positive area was in the plasma of endothelial cellsin cerebral cortex , hippocamp and cerebellum. The expressionof enkephalin reached the peak on day 7 after injury , and thepositive area was also seen in the plasma of neurons
7、 in cerebralcortex , hippocamp and cerebellum. From 14 days after injury ,the expression of enkephalin decreased gradually , but until30 days after injury it was still higher than that of controls.Expression of dopamine increased in 7 days after injury and thepositive area was seen in the plasma of
8、endothelial cells and inthe vessel wall in cerebral cortex , hippocamp , thalamus andcerebellum , and had no notable changes at other time points.CONCL USION: The mainly pathologic changes after cerebralconcussion were blood circulatory disorder and denaturation andnecrosis of parenchymal cells. Enk
9、ephalin and dopamine mayparticipate in the pathophysiological course of cerebral injury af2ter cerebral concussion , and play an important role in the bloodvessel injury , regulation of blood2brain barrier and the denatura2tion and necrosis of nerve cells.Keywords : cerebral concussion ; enkephalin
10、; dopamine ; im2munohistochemical staining摘要目的 : 探讨大鼠实验性脑震荡脑组织中脑啡肽和多巴胺的表达及其意义。 方法 : 采用 Wistar 雄性二级大鼠复制脑震荡动物模型 , 于伤后 1、 3、 7、 14 及 30 d 活杀。取脑组织 , 经免疫组化染色等技术 , 研究脑震荡发生发展中脑啡肽和多巴胺的变化规律。 结果 : 体质量 100 g 大鼠组出现典型的脑震荡临床表现 , 其病理改变为脑血管收缩与扩张、脑组织淤血与水肿、神经元变性、凋亡与坏死。脑啡肽于伤后 1 d 表达增强 , 阳性部位见于大脑、小脑和海马区的血管内皮细胞胞质中 ; 于伤后
11、7 d 达高峰 , 阳性部位仍见于大脑皮层、海马区和小脑神经元中。 14 d 后表达逐渐减少 , 30 d 仍高于正常水平。多巴胺于伤后 7 d , 在大脑、海马区、丘脑及小脑各部分血管内皮细胞、血管壁的表达明显增多 , 但各时间点无明显变化。 结论 : 脑震荡后可出现以血液循环障碍和实质细胞变性和坏死为主的病理改变。脑啡肽和多巴胺参与了脑震荡发生时脑损伤的病理生理过程 , 可能对脑血管损伤、血脑屏障功能和神经细胞变性、坏死起重要的调节作用。关键词 : 脑震荡 ; 脑啡肽 ; 多巴胺 ; 免疫组化中图分类号 : R971+ . 9 文献标识码 : A脑震荡是一种轻型的颅脑损伤 , 临床症状多表
12、现为短暂的意识障碍 , 因其客观指标较少 , 常为临床诊断和治疗带来难度。在基础研究方面 , 其病变规律和机制尚未完全阐明。本研究中 ,我们探讨了脑啡肽 (enkephalin , EN K) 和多巴胺(dopamine , DA)在脑震荡发生机制中的作用。1 材料和方法1. 1 材料 Wistar 雄性二级大鼠 80 只 , 体质量 (200 20) g ,由军事医学科学院实验动物中心提供并统一饲养。鼠抗脑啡肽和抗多巴胺单克隆抗体 ( mAb) , 为 SAN TA CRUZ 公司产品 , 购自中山生物工程公司。 Bio2羊抗鼠 IgG为 Vector Labo2ratories产品。辣根过
13、氧化物酶标记的抗生蛋白链菌素 ( HRP2SA)为美国 Zymed 公司产品。1. 2 方法232 ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2003 , 19 (3)1. 2. 1 大鼠脑震荡模型的建立 大鼠颅脑损伤发生装置自行 设计和制作 1 。将实验动物随机分为对照组 (15 只 ) 和 4 个实验组 , 即 50 g 打击组 (30 只 ) 、 100 g 打击组 (30 只 ) 及 200 g打击组 (5 只 ) 。将所有实验组 (65 只 ) 动物固定于自制木板上。于清醒状态 , 以 3 种不同质量 (50 g、 10
14、0 g 和 200 g) 的砝码 , 由高度 1 m 处 , 一次性打击每只大鼠的双耳及双眼中心部位 (颅脑顶部 ) , 造成脑震荡。对照组大鼠未打击。1. 2. 2 脑组织的病理学检查 动物于伤后即刻观察其行为的变化。于伤后 1、 3、 7、 14 和 30 d , 腹腔注射 20 g/ L 戊巴比妥钠麻醉后 , 采用 40 g/ L 多聚甲醛灌注固定和 100 ml/ L 缓冲福尔马林固定脑组织。取大脑颞叶、海马、丘脑及小脑进行石蜡包埋切片 , HE 染色及光镜检查 2 。同时对 40 g/ L 多聚甲醛灌注固定的脑组织进行冰冻切片 , 供做检测脑啡肽和多巴胺的免疫组化染色。1. 2. 3
15、 脑啡肽和多巴胺的免疫组织化学染色 (L SAB 法 ) 检测参照 梁英杰等 3 报道的方法进行。不同之处是 , 脑啡肽表达的检测采用脑组织冰冻切片。阳性结果染呈棕黄色 , 胞核复染呈浅蓝色。实验中同时设置一抗对照 (用 TBS 代替一抗 ,其余各步骤不变 )及白片对照 (仅加底物 ) 。2 结果2. 1 脑震荡大鼠模型的临床表现 200 g 打击组大鼠的口鼻出血 , 于 2 5 min 全部死亡。 100 g 打击组大鼠即刻出现惊厥、痉挛 , 5 10 s 出现行为抑制 , 3 5 min 后恢复 , 4/ 30 只大鼠于 15 min 内死亡 , 存活动物精神差。 50 g 打击组大鼠7/
16、 30只动物出现抽搐 , 3 8 s 后出现行为抑制 , 2 5 min 恢复 , 3/ 30 只动物死亡。以上表明 , 3 组中只有 100 g 打击组动物出现典型的脑震荡的临床表现。2. 2 脑组织的病理学改变 脑血管扩张、淤血 ; 脑实质水肿。神经元呈不同程度缺血性改变 : 胞体变小 , 胞质嗜酸性 , 胞核呈三角形、梭形、棱形等改变 , 严重可见坏死 , 并可见单核细胞和泡沫样细胞显著增多 , 海马神经元以 、及 区椎体细胞多见 , 严重者颗粒细胞亦见变性。2. 3 脑啡肽与多巴胺表达的免疫组化染色结果 脑啡肽的表达 : 对照组大鼠脑组织中 , 可见大脑、小脑及海马区的血管内皮细胞呈阳
17、性 , 而神经细胞胞质中未见阳性 (图 1A) 。100 g 打击组伤后 1 d , 上述部位脑啡肽的表达增加 , 于伤后 7d 达高峰 , 阳性部位还见于大脑皮层、海马区及小脑神经元中(图 1B) 。伤后 14 d , 上述部位的血管内皮细胞表达的阳性程度减弱 , 而小脑浦肯野细胞呈阳性 , 神经元中的表达达高峰。伤后 30 d , 上述部位脑啡肽的表达进一步减少 , 但仍高于正常水平。多巴胺的表达 : 对照组大鼠脑组织各部位血管壁中偶见多巴胺 , 部分小脑浦肯野细胞、丘脑神经元呈弱阳性(图 2A) 。 100 g 打击组伤后 7 d , 大脑、海马区、丘脑及小脑各部分的血管内皮细胞及血管壁
18、均呈强阳性 , 表现为多巴胺表达阳性的血管明显增多 (图 2B) 。但其他各时间点未见明显变化。图 1 大鼠大脑海马组织中脑啡肽表达Fig 1 The expression of enkephalin in rat hippocampus (L SAB , 400)A : Control group. Expression of enkephalin was positive in the plasma ofendothelial cells of part blood vessols ; B : 100 g group in 7 days after in2jury. Expression
19、of enkephalin was strongly positive in the plasma of en2dothelial cells and neurons.图 2 大鼠大脑组织中多巴胺表达Fig 2 The expression of dopamine in rat cerebral cortex(L SAB , 400)A : Control group. Expression of dopamine was positive in the plasma ofendothelial cells of part blood vessels ; B : 100 g group in
20、7 days after in2jury. Expression of dopamine was strongly positive in the plasma of en2dothelial cells.3 讨论长期以来 , 脑震荡一直认为是无明显病理改变、仅有脑血管痉挛、扩张等血流改变引起的脑组织缺血缺氧性疾病。是否发生脑震荡客观指标不多 , 常引起严重的社会问题 4 。临床上因脑震荡而死亡的病例很少 , 因此很难见到脑震荡发生时的病理改变。我们通过撞击大鼠头部建立了脑震荡模型 ,发现脑震荡发生时脑组织的病理变化特点 , 为脑震荡的诊断提供了客观指标 , 并可为其治疗和预后判定提供指导。脑
21、啡肽类神经递质是 1975 年后逐渐被发现的一类新的神经递质 , 具有多方面的生理效应 , 可调节认知、学习、记忆和其他方面等神经系统的生理功能 4 ,5 。脑啡肽类神经递质在脑缺血或缺氧性损伤方面有着重要的病理生理意义 6 。有学者发现 , 急性缺血性脑血管病及有机溶剂中毒时 , 脑组织332ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2003 , 19 (3)中脑啡肽及其 mRNA 的含量明显升高 , 并且有可能由 NMDA受体系统所介导 , 因此认为脑损伤后脑啡肽量的增加可能参与继发性缺血的病理变化 7 ,8 。然而在实验性脑
22、震荡中 , 脑组织中脑啡肽表达的动态变化规律报道不多 , 本研究发现 ,脑啡肽于伤后 1 d 表达增强 , 阳性部位见于大脑、小脑和海马血管内皮细胞胞质中 , 于伤后 7 d 达高峰 , 阳性部位还见于上述部位。 14 d 后逐渐减少 , 30 d 仍高于正常水平。表明脑啡肽参与脑震荡发生时脑损伤的病理生理过程 , 可能对脑血管损伤、血脑屏障功能和神经细胞变性、坏死起重要的调节作用。对其详尽机制尚待深入研究。多巴胺是哺乳动物脑内重要的儿茶酚胺类神经递质 , 在脑内独立存在。 DA 及其受体在维护神经系统正常的生理功能中起重要作用。早先将 DA 受体分为 D1 和 D2 两个亚型 ,最近将其分为
23、 D1、 D2、 D3、 D4 和 D5 等 5 个亚型 9 。 DA 虽是重要的神经递质 , 但在某些病理条件下也可引起神经毒性作用。近年研究表明 , DA 在缺血性脑损伤中扮演着重要的角色。关于 DA 在实验性脑震荡所致脑损伤中的表达报道少见 ,我们采用免疫组织化学染色技术 , 发现 DA 于伤后 7 d , 大脑、海马区、丘脑及小脑各部分的血管内皮细胞和血管壁呈阳性 ,但其他各时间点未见明显的变化 , 表明 DA 也参与了脑震荡发生时脑损伤的病理生理过程 , 可能对神经细胞的变性、坏死起重要的调节作用。关于 DA 参与脑震荡脑损害的调控机制目前尚不清楚。有学者在研究缺血缺氧性脑损伤的分子
24、调控机制时 , 提出了其损伤机制的自由基假说、 Ca2 + 假说和兴奋毒性假说等众多理论。其主要观点可归纳为以下 3 点 : DA产生神经毒性代谢产物 2自由基 10 ; DA 通过其受体介导的信号转导机制产生神经毒性作用 11 ; DA 增强兴奋性氨基酸的毒性 12 。认为缺血时 DA 的酶促氧化和自身氧化而导致自由基的产生 , 被认为是 DA 神经毒性的重要原因。参考文献 : 1 刘 杰 , 彭瑞云 , 陈浩宇 , 等 . 大鼠实验性脑震荡模型装置的建立J . 军事医学科学院院刊 , 2002 , 26 (3) : 1822184. 2 龚志锦 , 詹溶洲 , 主编 . 病理组织制片和染色
25、技术 M . 上海 : 上海科学技术出版社 , 1994 : 1202159.3 梁英杰、凌启波 . 一种快速高敏感的免疫组织化学染色法 J . 中华病理杂志 , 1993 , 22 (6) : 3692370.4 高 娜 , 王阿敬 , 杨渝珍 . 脑啡肽对大脑海马神经细胞 IL26 基因表达的影响 J . 中国组织化学与细胞化学杂志 , 1999 , 8 ( 2) :1272130. 5 高 扬 , 王建中 , 林嘉友 . 中枢相关脑区神经免疫调节功能活动的下调信号 J . 细胞与分子免疫学杂志 , 2001 , 17(5) : 5222623.6 朱粹青 , 王光辉 , 唐崇仁 . 用原
26、位杂交法研究大鼠脑损伤后胆囊收缩素和脑啡肽 mRNA 量的变化 J . 上海医科大学学报 , 1995 ,22 (4) : 2662268.7 Gandarias J MD , Echevarria E , Casis E , et al . Effects of acute xy2lene exposure on the enkephalinergic neurom odulatory system in ratsJ . Ind Health , 1995 , 33 : 126. 8 Gandarias J MD , Echevarria E , Martinez2Garcia F , et
27、 al . Brain met2enkephalin immunostaining after subacute and sunchronic exposure tobenzeneJ . Bell Envi ron Contam Toxicol , 1994 , 52 :1632170. 9 Missale C , Nash SR , Robinson SW , et al . Dopamine receptors :from structure to functionsJ . Physiol Rev , 1998 , 78 :1892225.10 Lei B , Adachi N , Nag
28、aro T , et al . The effects of dopamine deple2tion on the H2O2 production in the rat striatum following transientmiddle cerebral artery occlusion J . B rai n Res , 1997 , 764 : 2992302. 11 Capeda C , Colwell CS , Itri JN , et al. Dopaminergic modulation of NMDA2induced whole cell currents in neustri
29、atal neurons in slices: contribution ofcalcium conductancesJ . J Neurophysiol , 1998 , 79 :82294. 12 Barria A , Muller D , Derkach V , et al . Regulatory phosphorylationof AMPA type glutamate receptors by CaM2K during long2termpotentiationJ . Science , 1997 , 276 : 204222045.(上接第 224 页 )在缺血缺氧刺激时 , 会
30、发生血管增殖 , 其间有许多血管生长因子参与 , 而 V EGF 是其中一种高特异性促血管内皮细胞有丝分裂的细胞因子 , 但一些研究表明 , 此时内源性的 V EGF的表达常常不足以尽快建立侧枝循环 , 或恢复内皮细胞的完整性 4 , 给予外源性 V EGF 后 , 新生血管明显增加 , 侧枝血流供应改善 , 内皮细胞依赖的功能和结构明显恢复。在心血管系统 , V EGF 基因治疗在动物研究和临床实践中都证实外源性 V EGF 能促进缺血区侧枝循环的建立 , 并能改善缺血区血流 5 ,6 。本研究成功地构建了 V EGF 与 EGFP 的真核共表达载体。在此实验中 , 我们使用 EGFP 作为
31、报告基因 , 与以往实验相比较 , 操作更为简便 , 观察结果更为直观。本实验采用的脂质体转染法 , 具有广谱、高效及操作简单等优点。实验结果显示 , 转染重组质粒 p IRES22EGFP2hV EGF 后 , 内皮细胞与心肌细胞中均可见特异性的 EGFP , 免疫组化结果显示在内皮细胞与心肌细胞内均有 V EGF 的表达。以上结果为今后以外源性 V EGF 基因在体转染心肌细胞奠定了实验基础 , 也为心肌缺血的治疗提供了一条有效途径。参考文献 :1 Leung DW , Cachianes G , Kuang WJ , et al . Vascular endothelialgrowth
32、factor is a secreted angiogenic mitogen J . Science , 1989 ,246 (4935) : 130621309. 2 Vincenti V , Cassano C , Rocchi M , et al . Assignment of the vascularendothelial growth factor gene to human chromosome 6p21. 3 J .Ci rculation , 1996 , 93 (8) : 149321495.3 de Vries C , Escobedo JA , Ueno H , et
33、al . The fms2like tyrosine ki2nase , a receptor for vascular endothelial growth factor J . Science ,1992 , 255 (5047) : 9892991. 4 马 骊 , 王小宁 , 张智清 , 等 . VEGF165 cDNA 在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究 J . 细胞与分子免疫学杂志 , 2001 , 17(1) : 24228.5 Mack CA , Patel SR , Schwarz EA , et al . Biologic bypass with theuse of a
34、denovirus2mediated gene transfer of the complementary de2oxyribonucleic acid for vascular endothelial growth factor 121 im2proves myocardial perfusion and function in the ischemic porcine heartJ . J Thorac Cardiovasc S urg , 1998 , 115 (1) : 1682176. 6 Losordo DW , Vale PR , Symes J F , et al . Gene therapy for myocar2dial angiogenesis : initial clinical results with direct myocardial injec2tion of phVEGF165 as sole therapy for myocardial ischemiaJ . Ci r2culation , 1998 , 98 (25) : 280022804.432 ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2003 , 19 (3)
