1、基金项目 :四川省教育厅重点自然科学研究项目 (2002A118) 1收稿日期 :20032122261作者简介 :边清泉 (1965 ) ,男 ,副教授 ,主要从事天然植物分离和测定的研究 12003 年 4 月第 22 卷 第 2 期 绵阳师范学院学报Journal of Mianyang Normal University Apr. 2003Vol. 22 No. 2 红车轴草提取物中异黄酮含量的高效液相色谱分析法的研究边 清 泉(绵阳师范学院化学与化学工程系 ,四川绵阳 621000)摘 要 : 建立了一种红车轴草提取物中异黄酮含量的高效液相色谱分析方法。采用日本岛津公司 LC - 6
2、AHPLC系统 ,Shim - pack VP - DOS柱 (150mm 416mmID ,5 m) ,流动相 MeOH - CH3CN - H2O(体积比 317 113 5) ,流速019mL min - 1 ,检测波长 260nm ,柱温 30 ,进样量 10 L ;样品制备方法以 110mol1L - 1 HCI 甲醇溶液在 85 条件下水解 116h ,HPLC法测定异黄酮的含量 ;该法的 RSD 为 1131 %(n = 5) ,平均回收率为 9615 %。关键词 : 高效液相色谱法 ; 红车轴草 ; 异黄酮 ; 含量测定中图法分类号 : O657172 文献标识码 : A 文章
3、编号 : 16722612x(2003) 02200522040 引言红车轴草提取物中主要含有大豆黄素 (Daidzein) 、染料木素 ( Genistein) 、刺芒柄花素 ( Formononetin) 和鹰嘴豆芽素 A(Biochanin A)及相应的甙等 8 种主要异黄酮成分 1 ,3 (见表 1) 。文献 1 - 4 报道这些成分具有抗肿瘤、胃溃疡、胃癌、乳腺癌、肠癌和骨质疏松症等作用。随着对红车轴草研发的深入 ,其主要成分所具有的植物雌激素样作用和抗癌作用 ,成为人们关注的重点。目前关于红车轴草提取物及其制品盅各有效成分测定方法的报道很少 ,为促进红车轴草的开发和有效成分的充分利
4、用 ,加强提取分离和产品开发的质控 ,笔者利用高效液相色谱法对其含量测定方法进行了研究。表 1 红车轴草提取物中异黄酮类成分NO1 成 分 R1 R2 R3 Mt1 大豆黄素 (Daidzein) H H H 2542 大豆黄甙 (Daidzin) H H Glu 4163 染料木素 ( Genistein) H OH H 2704 染料木甙 ( Genistin) H OH Glu 4325 刺芒柄花素 (Formononetin) CH3 H H 2686 刺芒柄花甙 (Formonontin) CH3 H Glu 4307 鹰嘴豆芽素 A(Biochanin A) CH3 OH H 28
5、48 黄檀甙 (sissotrin) CH3 OH Glu 4461 仪器与试验材料岛津 LC - 6A 高效液相色谱仪系统。包括 LC - 6A 输液泵 ,SPD - M10A 检测器。 CLASS - VP510 色谱工作站。 CTO - 6A 色谱柱温箱 ;SZ - 93 型自动双重纯水蒸馏器 , KQ - 250DE 型医用数控超声波清洗器。溶剂过滤器及实验室常规仪器。25大豆黄素、染料木素、刺芒柄花素对照品 (Sigma 公司 ,纯度 98 %、 98 %、 97 %) ,红车轴草提取物为本实验室 分离制备 ,甲醇、乙晴为色谱纯 (上海陆都化学试剂厂 ) ,其它试剂为 AR 级。实验
6、用水为二次重蒸馏水。2 方法与结果211 色谱条件色谱柱 :Shim - pack VP - ODS (416mm 150mm ,5 m) ;柱温 : 35 ;检测波长 : 260nm ;流动相 :MeOH -CH3CN - H2O(体积比 317 113 5) ;流速 019mL min - 1 ;灵敏度 :01050AUFS。212 样品溶液的制备精密称取红车轴草提取物样品 2010mg ,加 110mol L - 1盐酸甲醇溶液 80mL ,于 85 水浴中回流水解116h ,冷却后用甲醇定容至 100mL ,摇匀后 0145 m 滤膜过滤 ,取续滤液 ,待测。213 对照溶液的制备精密
7、称取大豆黄素 、染料木素、刺芒柄花素对照品适量 ,加甲醇溶解 ,制成每毫升 0116 ,0112 ,0124mg 的对照溶液贮备液。精密吸取 1mL 对照品贮备液 ,置 10mL 量瓶中 ,甲醇定容至刻度 ,即为对照品溶液。214 样品的测定分别精密吸取对照品溶液与待测样品溶液各 10 L 按 211 项下行色谱 ,以峰面积按外标法计算含量 (大豆黄素、染料木素、刺芒柄花和鹰嘴豆芽素与其相应的甙换算因子分别为 :1164 ,1160 ,1160 ,1157。刺芒柄花素相对于鹰嘴豆芽素的换算因子为 01627) ,结果见表 2。色谱图见图 2。表 2 红车轴草提取物中异黄酮含量测定结果 ( %)
8、大豆黄甙 染料木甙 芒柄花甙 大豆黄素 黄檀甙 染料木素 刺芒柄花素 鹰嘴豆芽素 合 计0175 0172 5186 3163 1126 2185 15131 3118 331563 方法学考察311 线性关系将对照品溶液分别在 211 项下进样 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14 L ,测定峰面积 ,以峰面积为纵坐标 ,对照品进样量 ( g)为横坐标绘制标准曲线 ,结果见表 3。表 3 3 种组分工作曲线名 称 线性范围 ( g) 回归方程 r大豆黄素 01032 - 01224 y = 8137 106x + 2908 019993染料木素 01024 - 01168 y = 4
9、114 106x + 295 019994刺芒柄花素 01048 - 01336 y = 5194 106x + 14052 019999312 精密度试验对照样品溶液在 211 项下重复进样 5 次 ,大豆黄素、染料木素、刺芒柄花素峰面积的 RSD 分别为 :0136 %、 018 %、 0118 %。313 样品溶液稳定性试验将样品溶液在室温下贮存 ,分别于 0、 2、 4、 8、 16、 24h 测定 ,结果样品溶液在 24h 内基本稳定 ,四组分的RSD 为 114 %、 017 %、 019 %、 116 %。35边 清 泉 红车轴草提取物中异黄酮含量的高效液相色谱分析法的研究314
10、 重复性试验同一批样品分别称取 5 份 ,测含量为 32100 %、 33162 %、33142 %、 34122 %、 33154 % ,RSD 为 1131 %。315 加样回收率试验精密称取已知含量的样品 ,分别加入一定量的对照品 ,按 212 项下方法测定 ,计算回收率。大豆黄素、染料木素、刺芒柄花素的平均回收率分别为 9917 %、 9016 %、9912 %。 RSD 分别为 018 %、 114 %、 118 %(n = 5) 。图 1 样品中 8 种组分的光谱图C: 1 大豆黄甙 3 芒柄花甙 4 大豆黄素 7 刺芒柄花素D : 2 染料木甙 5 黄 檀 甙 6 染料木素 8
11、鹰嘴豆芽素4 讨论411 色谱条件的选择本试验以红车轴草提取物中主要组分水解产物四种甙元相互分离为指标 ,确定色谱条件。用 MeOH - CH3CN- H2O(体积比 317 113 5) 可将四种甙元与其它峰较好地分离 (R 115) ,且流动相配比简单。试验中考察了改变流动相三种成分比例的情况 ,结果表明增加 MeOH比例保留时间减少 ,但 R 值变小 ,增加 CH3CN 比例 ,R 值变大 ,峰形变差。检测波长确定 ,样品各组分紫外扫描图谱如图 1。染料木素与鹰嘴豆芽素及对应甙的 max为 260nm ,大豆黄素与刺芒柄花素及对应甙的 max为 249( 1) nm。为充分地考虑到各组分
12、的灵敏度 ,选择最佳测定波长为 260( 1) nm。412 样品预处理条件的选择本方法样品水解完全是提高测定结果准确度的关键。影响样品水解的条件主要有酸度、水解温度和水解时间三因素 ,通过对三因素水平正交试验可确定样品分析时的最佳处理条件为 :盐酸浓度 1mol L - 1 ,水解温度 85 ,水解时间图 2 样品水解前后 HPLC色谱图A 水解前 B 水解后1 大豆黄苷 2 染料木苷 3 芒柄花苷 4 大豆黄素 5 黄檀苷 6 染料木素 7 刺芒柄花素 8 鹰嘴豆芽素116h。该条件下处理样品 ,4 种甙以 7 - 0 - 糖甙形式存在的峰位消失 ,4 种甙元含量不再增加 (见图 2) 。
13、样品水解完全 ,回收率均大于 9912 %(RSD 118 %) ,符合分析方法要求。413 红车轴草提取物的质量控制根据文献 1 - 4 报道 ,红车轴草提取物因其独特疗效和药理功能 ,越来越广泛地应用于临床 ,也是一种极有前途的天然保健食品。然而其质量控制和分析方法的报道不多。本文采用酸水解样品后以 HPLC 法测定有效成份甙元含量 ,再经换算为异黄酮的含量。本方法解决了直接测定时需要对照品种类多 ,分离困难 ,分析时间长等缺点 ,为红车轴草提取物及其制品的质量控制提供了一种简便、快速、准确的分析方法。45绵阳师范学院学报 2003 Vol. 22 No12参考文献 :1 江苏新医学院 1
14、 中药大辞典 1 上海 :科学技术出版社 ,1977 ,1012 101312 曾虹燕 ,周朴华 ,候团章 1 红车轴草有效成分的研究进展 1 中草药 ,2001 ,32(2) :18913 辽宁林业土地研究所 1 东北草木植物志 1 第五卷 1 北京 :科学出版社 ,197614 徐艳春 ,魏璐雪 ,周玉新 ,等 1 红车轴草中异黄酮的指纹图谱研究 1 中国中药杂志 ,2002 ,27(3) :19615 张立 1RP - HPLC法测定大豆提取物中大豆苷元、染料木素、大豆苷、染料木苷的含量 1 中草药 ,2001 ,32(2) :1181HPLC Analysis of Isoflavon
15、e in the Extraction of Trifolium PratenseBian Qing2quan(Department of Chemistry and Chemical Engineering , Mianyang Normal University , Mianyang , Sichuan 621000)Abstract : A quick、 simple、 precise method to analyze the isoflavone in the extraction of trifolium pratense is setup. LC - 6A HPLC system
16、 is employed with Shim - pack VP - DOS column (150mm 416mmID ,5 m) and a mobilephase of MeOH - CH3CN - H2O (a cubage ratio of 317 113 5) ; the flow rate is 0. 9mL1min - 1 ; the detection wavelength is 260nm ; the column temperature is 30 ; the filling amount is 10 L. The sample is prepared by dissolving it in1. 0mol. L - 1HCI methanol solution for 1. 6h , then the isoflavone is determined by HPLC. The RSD is 1. 31 % (n = 5)and the average recovery rate is 9615 %.Key words : HPLC ; trifolium pratense ; isoflavone ; determination55边 清 泉 红车轴草提取物中异黄酮含量的高效液相色谱分析法的研究
