1、2013年全国中医肿瘤学术年会论文集温煦而致脾虚愈甚。因此，在治疗过程中应该脾肾兼调，故通过健脾来益气生血，滋肾温阳来填精生筒。加味四逆汤旨在补肾温阳、益气健脾，从而益气生血，改善化疗后血小板减少。方中附子哺1先煎可大振阳气，有温阳补虚，固汗止痛之效；附子与干姜、甘草及生姜合用可降低毒性，温阳散寒，降逆止呕，以消阴翳；且制附子配伍肉桂可补肾温阳、填精补髓，适用于化疗后真阳虚衰，或体弱久病入络，并伴癌痛的患者；砂仁与炒谷芽、炒麦芽合用可温补脾胃，益气和中，补养后天气血生化之源；方中其它药物又可补肝肾，益精血，补中气，本方采用标本兼治的原则，益气固本以陪其真元。本实验结果表明，虽然中药组对升血小板
2、并未有统计学意义，但是中药高剂量组与阳性对照组比差异未见显著性，且随着剂量的升高，中药组的疗效增加，因此，继续增加中药的剂量可能可以达到白介素-11的效果，具有一定的应用价值，观察各组白细胞及血红蛋白的数值，不难发现中药组具有一定的升白细胞和血红蛋白的能力，且与中药的浓度相关。血红蛋白在造模成功后14天，即恢复正常PO05，说明小鼠血红蛋白生长周期至正常。各组结果中中药组与阳性对照组比亦未见明显差异，说明本实验研究方剂：加味四逆汤其疗效并不比白介素一1l差，而就其价格方面来说，中药的价格远远低于白介素一1l的价格，因此具有良好的临床实用性；从安全性上来分析，治疗各组中，中药高剂量组存活的小鼠数
3、量最多，而阳性对照组存活的小鼠数量最少，但由于本研究中标本量较小，因此只能说明中药组的安全性可能高于阳性对照组。参考文献(略)新加良附方联合5-Fu对裸鼠胃癌移植瘤BaxBcl-2表达的影响许晶1侯丽23武苗1宋延平4田劭丹2，3赵林涛41陕西中医学院2北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科3教育部、北京市重点实验室(中医内科学)4陕西省中医药研究院药理室The e_慨ofX：hjJaJangfil Fonn ua oom bJned 5-Fu on Baxand Bcl-2 Expr醯n ofGaS：r-J：CancEfXenografts血NudeM be摘要：目的：观察新加良附方联合5一Fu
4、对人胃癌细胞(SGC一7901)裸鼠移植瘤生长抑制作用及对肿瘤组织Bcl一2及Bax蛋白表达的影响。方法：建立移植性人胃癌细胞(SGC-7901)裸鼠移植瘤模型，随机分为模型对照、5一FU组及新加良附方高、中、低剂量组、联合给药组。连续给药lo天。计算肿瘤抑制率，检测BaxBcl一2蛋白表达。结果： 联合给药组抑瘤率为7007，与模型对照组比较有统计学意义(P005)；与5-Fu组和新加良附高剂量比较联合给药组抑瘤率明显升高，有统计学意义(P005)；联合给药组上调肿瘤组织Bax蛋白表达，下调Bcl一2蛋白表达，与模型对照组比较，有统计学意义(P005，P001)；与5-Fu组和新加良附高剂量
5、组比较，联合给药组Bax蛋白表达升高明显(P005)，Bcl一2蛋白表达下降明显(P005)。结论：联合给药组抑瘤率高于单独给药组，在下调Bcl一2、上调Bax表达方面优于单独给药组，显示两药协同作用的优势。关键词：新加良附方联合5一Fu；人胃癌细胞(SGC一7901)；Bcl一2；Bax3912013年全国中医肿瘤学术年会论文集A B ST R A C T】O bjeCt娓To observe tlle effect of Xinjialiangfu(XJLF)Formula on humangastric cancer(SGC-7901)tumor growth in nude mice
6、and its impact on Bcl2 and Baxexpression in tumor tissueM edloda The animal model of SGC一7901 xenografted nude micewas established，and all the mice were randomly divided into 6 groups；namely model controlgroup，5一Fu group，XJLF Formula highdose group，XJLF Formula mediumdose group，XJLFFormula lowdose g
7、roup and drug combination groupAfter 10 days of continuous treatment，tumor inhibition rate was calculated and the expression of Bax and Bcl一2 was detected byimmunohistochemistry techniquesR g弘b：The tumor inhibition rate of drug combinationgroup was 7007，which was significantly increased compared to
8、the model control group(PO05)，5-FU group(P005)and XJLF highdose group(P005)，respectivelyMeanwhile，the Bax expression was significantly up-regulated and the Bcl一2 expression was significantlydown-regulated in drug combination group，compared to the model control group(PO05，PO01)，5FU group(P005，PO05)an
9、d XJLF Formula high-dose group(P005，PO05)，respectively C on血s函n：The tumor inhibition rate of drug combination group is higher thanXJLF Formula highdose group and 5一FU groupAlso combination group has stronger effectcompared to model control group in terms of down-regulation of Bcl-2 expression andup-
10、regulation of Bax expression，which indicates a benefit of XJLF and 5一Fu combination缸eatment畎EY W O R D SXinjialiangfu Formula and 5一FU combination；human gastriccancer(SGC7901)；Bcl2：Bax目前，我国胃癌发病率与死亡率仍居高不下。在胃癌综合治疗中，中医药占有重要地位。通过临床病例回顾分析及对经典方剂筛选，新加良附方(高良姜、香附、穿山龙)治疗胃癌有一定临床效果，并且前期实验已证实，新加良附方含药血清体外具有抑制人胃癌细
11、胞生长的作用，并且认为其机制之一为诱导胃癌细胞凋亡，但尚未进行联合用药的研究。因此，在此基础上，选用移植性人胃癌(SGC一7901)裸鼠动物模型，以肿瘤抑制率和凋亡相关蛋白为观测指标，进一步探讨新加良附方联合5一Fu抗胃癌的效应与机制研究，为临床胃癌的综合治疗提供依据。材料与方法一、实验材料1实验细胞与动物11实验细胞人胃癌细胞SGC一7901购于第四军医大学，细胞用含10dx牛血清的1640培养液常规培养，按实验所需细胞密度接种，以025胰蛋白酶+004的EDTA消化细胞12实验动物BALBC无胸腺裸鼠，SPF级，45周龄，60只，雌雄各半，购于中国人民解放军第四军医大学实验动物中心提供，许
12、可证号：SCXK(沪)2012-0002，合格证号：20070005441312，在第四军医大学动物实验中心屏蔽系统辅以洁净层流柜环境中饲养。人胃癌(SGC-7901)细胞系，购于第四军医大学实验动物中心。2实验药物药物：按照中药新药制备工艺制备，新加良附方(浸膏或干燥原粉)由陕西星华制药有限公司提供；阳性药：注射用5一氟尿嘧啶(5-Fu)由上海旭东海普药业有限公司生产，国药准字：H31020593，产品批号110608，有效期至2013年4月。3仪器与试剂3922013年全国中医肿瘤学术年会论文集31实验试剂：1640培养液购Gibco自公司；小牛血清购自杭州四季青公司；32实验仪器：超净工
13、作台swCJIF(美国BIOLOGICAL公司)；C02恒温培养箱(美国SHELDON公司)；TDZ4AWS台式低速自动平衡离心机：低温冰箱(日本SANYO公司)二、实验方法1复苏与培养液氮罐中取出含有SGC一7901细胞的冻存管，放入37。C水浴内，使其溶化吸取细胞悬液并加入培养液(10胎牛血清的RPMll640培养液)，人胃癌细胞株SGC一7901置于含10胎牛血清的RPMll640培养基中，在37饱和温度，5C0z条件下培养传代。待细胞长满单层，用025胰酶消化，培养液吹打离心1000rmin，5min，去上清液收集细胞，传代培养或接种。2接种将收集的细胞用PBS稀释，镜下细胞计数，调整
14、细胞悬液浓度至1 X 10 7个细胞ml，每只裸鼠以02ml接种于颈背部，待肿瘤长至1000mm3时移植。3分组待已接种裸鼠肿瘤体积约在100300mm3之间时，据性别，肿瘤体积大小将造模成功的裸鼠分成六组，模型对照组、5一Fu阳性对照组、新加良附大剂量组、新加良附中剂量组、新加良附小剂量组、联合给药组(即新加良附中剂量+5Fu组)，每组10只，称重标号。4给药剂量时间及方法模型对照组：以生理盐水每天02mLlOg灌胃；5一FU组：按17mgd一1kg一1体质量腹腔注射，每周2次。新加良附方各剂量组：高剂量组以每天lOgd-1kg-1灌胃给药，相当于成人剂量的20倍；中剂量组以每天59d一1k
15、g一1灌胃给药，相当于成人剂量的10倍；小剂量组以每天259dlkg一1灌胃给药，相当于成人剂量的5倍。联合给药组：即新加良附中剂量组与5一Fu联合给药，新加良附中剂量与5一Fu剂量同上，连续给药10天。5肿瘤抑制率在实验过程中观察小鼠一般情况，用药结束2天后处死裸鼠，取瘤称重，并按如下公式计算肿瘤抑制率：抑制率()=卜(治疗组平均瘤重对照组平均瘤重)100。6免疫组织化学标本制备及BaxBcl-2蛋白检测免疫组化法：取每裸鼠的肿瘤组织并将肿瘤组织标本，用10多聚甲醛在室温或4条件下固定48h，在60。C以下环境内经脱水、透明、浸蜡及包埋制成蜡块，烤片过夜，经过二甲苯三缸脱蜡，100、100无
16、水乙醇及95、95、85、75酒精梯度脱水，苏木素染色冲洗后，5H202孵育内源性过氧化氢酶，后滴加一抗，37。C孵育过夜，甩干残夜，滴加二抗，15min后，甩去残夜，滴加DAB显色液AB瓶，镜下观察反应，滴加终止液，中性树胶封片。各步骤结束后PBS缓冲液冲洗3遍。以上操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。结果判断：BaxBcl一2蛋白阳性反应为棕黄色或棕褐色颗粒，定位于胞浆及胞膜。各组每个指标选肿瘤组织10个组织切片，每片选3个视野，用成都泰盟BI一2000图像分析系统作图像分析，测定光密度(IoD)值，取平均值。三、统计学处理所有数据用均数标准差(又s)表示，采用SPSSl30统计软件进行数据
17、处理。进行单因素方差分析，方差具有齐性时用SNK检验，方差不齐用TamhaneS T2检验进行各组间比较。P005表示差异有显著性。结果1肿瘤抑制率3932013年全国中医肿瘤学术年会论文集新加良附方及联合用药组对瘤重的影响：新加良附用药各组肿瘤重量明显低于模型对照组。与模型对照组瘤重比较，5一Fu组及新加良附高剂量组及联合给药组有统计学意义(尸005)。与5一Fu组瘤重比较，联合用药组肿瘤重量降低，有统计学意义(尸005)；与新加良附高剂量组相比，联合用药组肿瘤重量降低，有统计学意义(P005)；说明新加良附方可抑制胃癌裸鼠移植瘤生长，并与用药剂量呈相关性。联合用药后，肿瘤重量较新加良附各剂
18、量组，5一Fu组，模型组都有明显降低，提示两药合用具有协同抗肿瘤作用。结果见表1。表1实验各组瘤重(g)与抑瘤率()注：与模型组相比，8P005；与新加良附高剂量组比较，bp005；与5-Fu组比较，。P005。2凋亡蛋白表达新加良附方及联合用药组对BaxBcl2表达的影响结果显示，新加良附方各剂量组均可抑制Bcl一2表达，上调Bax表达。与模型组相比，5-Fu组、新加良附方高剂量组及联合给药组Bax蛋白表达升高明显(尸(005)，5一Fu、新加良附方高、中剂量组及联合给药组Bcl一2蛋白表达下降明显(尸005)；与5一Fu组相比，联合给药组Bax蛋白表达升高明显(尸005)，Bcl一2蛋白表
19、达下降明显(P005)；与新加良附方高剂量组相比，联合给药组Bax蛋白表达升高明显(PO05)，Bcl一2蛋白表达下降明显(尸005)；提示两药合用对调节Bcl一2、Bax表达具有协同作用。结果见表2。表2实验各组BaxBcl2检测10D值比较(又s)注：与模型组比较，8P005，6P001；与新加良附高剂量组比较，。P005；与5-Fu组比较，6P005。3免疫组化染色胃癌组织细胞Bcl-2、Bax蛋白表达结果显示，Bcl一2阳性染色位于细胞浆，呈清晰棕黄色弥漫性分布，Bax阳性染色位于细胞浆，呈清晰棕黄色弥漫性分布，部分细胞也可见染色。讨论胃癌依据其临床表现归属于中医“反胃”、“噎嗝”、“
20、痞满”、“胃脘痛”等病证范畴，长期临床观察与回顾分析发现，胃癌患者多有胃脘部疼痛(疼痛有时、固定不移)，遇寒加重，得温则舒，胃部肿块，脘腹胀满，食欲减退，嗳气或呕吐，形体消瘦等症状，3942013年全国中医肿瘤学术年会论文集舌质常青紫，脉象多细涩，符合中医“寒凝血瘀、集结胃府、阻滞气机”的病机变化过程，临床以具有“温中散寒、活血化瘀、理气止痛”功效的新加良附方治疗显示较好的治疗效应。良附方出白良方集腋，由高良姜、香附两味药物组成，依据临床经验及课题组前期研究结果，在良附丸基础上加入穿山龙组成新加良附方。其中高良姜味辛、大热，温中暖胃，散寒止痛；香附味辛、微苦、性平，行气止痛；穿山龙性平、温、味
21、甘、苦，有祛风除湿止痛、舒筋活血通络、止咳化痰等功效，三药结合，温阳散寒、理气化痰、活血止痛。穿山龙粗提物及其主要活性成分薯蓣皂苷元对多种瘤株如肺癌、胃癌、乳腺癌均有明显的抑制效应，高良姜主要成分槲皮素有抑制多种肿瘤细胞增殖、促进癌细胞分化、诱导癌细胞凋亡等效果。课题组基础研究显示新加良附方对多种瘤株如肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌均有明显的抑制效应，机制研究显示其可降低肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)表达与微血管密度(MvD)表达，并能下调Bcl一2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，以上研究表明，新加良附方具有较好抗肿瘤效应，预示有进一步深入研究的价值。细胞凋亡受多种基因调控，Bcl一2基因主要
22、生物学功能是延长细胞寿命，增加细胞对各种凋亡刺激因素的抵抗力，Bcl一2基因家族最重要的是Bcl一2及Bax基因，Bcl-2即B细胞淋巴瘤白血病基因一2(B-cell lymphomaleukemia一2，bcl一2)，它是一种跨膜蛋白，是调节凋亡过程的重要基因，它本身无促进增殖作用，也无促进细胞恶性转化作用，但它可以在无生长因子或神经营养因子存在的条件下通过抑制凋亡、延长细胞存活时间，增加细胞染色体畸变和病毒感染机会，导致细胞恶变和促进肿瘤的发生发展。分布于线粒体外膜上的Bcl一2蛋白，具有稳定线粒体膜的功能。在细胞发生凋亡时，Bcl一2蛋白通过作用于线粒体引起线粒体膜通透性的改变，诱发细胞
23、凋亡。Bcl-2的功能受其表达水平的影响，低水平表达可以保护细胞免受凋亡，超表达则促使凋亡发生。Bax为Bcl一2基因家族中的促凋亡基因，Bcl一2和Bax可在细胞内形成异源二聚体，Bax本身可形成同源二聚体，细胞凋亡主要取决于同源二聚体和异源二聚体的比例，如BaxBcl一2大于Bcl一2Bax细胞就发生凋亡，如BaxBcl一2小于Bcl一2Bax细胞凋亡被抑制，因此Bcl-2与bax比例决定细胞凋亡程度。胃癌临床疗效的提高得益于中西医结合的综合治疗，因此，课题组进一步对其进行研究，观察新加良附方联合5一Fu对人胃癌细胞系增殖影响和诱导凋亡作用。研究结果表明，与模型组比较，新加良附方能明显抑制
24、胃癌裸鼠移植瘤的生长，且与用药剂量呈正相关；联合用药组的瘤重与新加良附高剂量组与5一FU组比较降低，抑瘤率明显升高；新加良附方可下调Bcl一2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，联合用药组与5-Fu组相比，Bax蛋白表达升高明显，Bcl一2蛋白表达下降明显；与新加良附方高剂量组相比，联合给药组Bax蛋白表达升高明显，Bcl一2蛋白表达下降明显，获得了新加良附方联合5一Fu抗胃癌具有优势相关证据，提示两药合用具有协同抗肿瘤作用，因此新加良附与化疗药物的联合应用可望降低化疗药物剂量而达到相同的疗效，为胃癌治疗提供更为有效的方法。健脾补肾方对Lewis肺癌移植瘤小鼠EGFR和VEGF表达的实验研究王希胜肖红艮陕西中医学院附属医院摘要：目的研究健脾补肾方对Lewis肺癌移植瘤小鼠中肿瘤组织生长侵润、转移方面的影响，分析EGFR和VEGF的表达，进一步为健脾补肾方临床运用提供理论依据。方法造模成功后分为5组，A组：空白对照组；B组：荷瘤对照组；C组：中药组(健脾补肾方)；D组：西药组(顺铂)；E组：综合组(健脾补肾方+顺铂)。治疗后处死小鼠，取瘤体、胸腺、脾脏。测量其重量，计算抑瘤率，脏器指数，免疫组化法检测EGFR和VEGF的表达情况。395
