1、第28卷第2期 2010年4月 石河子大学学报(自然科学版) Journal of Shihezi University(Natural Science) Vo128 No2 Apr2010 文章编号：1007-7383(2010)02019404 小凹蛋白一1和钙受体在人的脐静脉 内皮细胞的表达 王振焕 ，陈雄英 ，胡清华 ，钟华 ，邓峰美 ，何芳 (1石河子大学医学院新疆地方与民族高发病重点实验室，石河子832002； 2华中科技大学同济医学院卫生部呼吸系疾病重点实验室，武汉430030) 摘要：为探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中小凹蛋白一1与细胞外钙受体表达及定位，为进一步功能研究提
2、供理论 依据，采用Westernblot和RtPCR及免疫荧光技术检测HUVEC中小凹蛋白一1与细胞外钙受体mRNA和蛋白表 达及定位。结果显示：(1)形态学观察和免疫细胞化学法测因子抗原，95 以上的细胞呈阳性着色，证实细胞为 HUVEC。(2)RTPCR检测到HUVEC中459bp和260bpmRNA表达，Westernblot测到HUVEC中22KD和 150160KD蛋白表达。(3)免疫荧光检测到小凹蛋白一1与细胞外钙受体定位于人脐静脉内皮细胞膜。由此可知， 人的HUVEC中有小凹蛋白一1与细胞外钙受体表达，两者是否共定位及其功能有待进一步研究。 关键词：细胞外钙受体；小凹蛋白一1；脐
3、静脉内皮细胞 中图分类号：R363 文献标识码：A Expressions of Extracellular Calcium-sensing Receptor and Caveolin一1 in Human Umbilical Vein Endothelial Cells WANG Zhenhuan 。CHEN Xiongying ，HU Qinghua ，ZHONG Hua ， DENG Fengmei 。H E Fang (1 Medical College of Shihezi UniversityMinistry of Education Key Laboratory of Xinji
4、ang Endemic and Ethnic Diseases，Shihezi 832002，China； 2 Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Techno1ogyKey Laboratory of Pulmonary Disease of Ministry of Health of China，Wuhan 430030，China) Abstract：To investigate the expression of caveolin-1 and extracellular calcium receptor(C
5、aR)and loealiza tion in human umbilica1 vein endothelial cells(H UVECs)，which provide a theoretical basis for further CO localization and functional studiesMethods：The expressions of caveolin一1 and CaR mRNA and protein in HUVECs were detected by Westernblot and RtPCR，and their localizations were inv
6、estigated by immuno fluorescenceResults：(1)We identified HUVECs in which over 95 of cells were positive staining by morphology and immunocytochemistry measuring vm factor antigen(2)The expression of 459bp， 260bpmRNA and 22KD150160KD protein were detected in HUVEC by Westernblot detected and RT PCR。r
7、espectively(3)Caveolin一1 and CaR were localization in HUVEC membrane by immunofluores cenceConclusions：Our observations demonstrated that there were caveolin一1 and CaR in HUVECs，and they were localization in the cell membraneWhether they were COlocalization and the relation between the 收稿日期：20091027
8、 基金项目：国家自然科学基金项目(30860099) 作者简介：王振焕(1982一)，女，硕士生，专业方向为心血管病理生理学。 通讯作者：何芳(1964一)，女，教授，从事心血管病理生理学研究。 第2期 王振焕，等：小凹蛋白一1和钙受体在人的脐静脉内皮细胞的表达 expression and its function should be further studied Key words：extracellular calcium receptor；cavelin一1；human umbilical vein endothelial cells 钙受体(extracellular calciu
9、m sensing recep tor，CaR)为G蛋白偶联受体(G-proteincoupled re ceptor，GPCR)超家族c亚族的成员，其基本结构与 一般GPCR相同，由1078个氨基酸组成，在维持全 身钙稳态和调节血管张力方面起着重要的作用。小 凹蛋白一1(Caveolin一1，Cav一1)是Caveolae表面的标 志蛋白和结构蛋白，由178个氨基酸组成分子量为 2124kDa。Caveolae及其Cav一1在细胞内吞、调节 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)功能、信 号传导等方面起着重要作用1，而NOS又与血管功 能密切相关。已在培养的甲状旁
10、腺细胞证实CaR 和Cav-1形成复合物并共定位于胞膜，Cav一1可调 节CaR的功能。 本研究拟在Roy C等2 在人的动脉内皮细胞 中发现存在CaR的基础上，以脐静脉内皮细胞(hu man umbilical vein endothelial cells，H UVECs)为 研究对象，用RTPCR、WesternBlot及免疫荧光方 法检测HUVEC细胞内Cav一1、CaR mRNA和蛋白 表达及两者的定位，证实Cav一1与CaR在HUVEC 中的存在及定位，为进一步研究Cav一1和CaR在 HUVEC中共定位、相互作用及在心血管疾病发生、 发展中的作用提供理论依据。 1材料与方法 11
11、材料 健康孕妇剖宫产的新鲜脐带(来自华中科技大 学同济医学院附属同济医院)；胰酶；EDTA；M199 (Thermo)：胎牛血清(Gibco)；ECM(Sciencellg)； 明胶(Sigma)；Spermine(Sigma)；逆转录试剂盒与 PCR试剂盒(ToYOBO)；Cavl一抗(cell signa ling)；CaR一抗(Affinity BioReagents，ABR)；la-ac tin(Santa)；FITC标记的羊抗小鼠及TRITC标记 的羊抗兔二抗(Immunology Consultants Laborato ry)；ECL发光试剂盒(Thermo)；引物由Invitr
12、ogen 公司合成。 12 方法 121 HUVEC的培养与鉴定 依据本研究室以前的研究方法培养HUVEC， 并对其进行细胞形态学及对细胞内因子进行免疫 细胞化学染色鉴定是否为HUVEC。取25代细 胞用于实验。 122 Westernblot检测HUVEO细胞Cav一1和 CaR蛋白表达 弃去培养基，用预冷的PBS冲洗后，加入裂解 液，提取细胞总蛋白，BCA试剂测定蛋白含量，用 40V，30min后改为90V，50rain的5 浓缩胶与 1O 分离聚丙烯酰胺胶的电泳，250mA电流进行 PVDF膜的半干转90min，然后用5的脱脂牛奶封 闭1h，分别加入Cav一1的一抗和CaR的一抗，室温
13、摇床上孵育2h后放入4冰箱孵育过夜。次日用 TBST洗膜3次各20min，加入相应的二抗摇床上 孵育15h，TBST洗膜3次各20min；ECL化学发 光试剂显色，显影定影处理，获得实验结果。 123 RTPCR检测HUVEC细胞中Cav-1和CaR 的mRNA表达 引物由Invitrogen公司合成。Cav一1的上游引 物是：5 r_GAA GTC GGG TAT TAC AAC G-3 ，下 游引物是：3 一GAG GAG AAG AGG GAC GAG一 5 ；CaR的上游引物是：5-CGG GAA CAG GGC AAC ATC一3 ，下游引物是：3 r_AAT GGC GAA CGA
14、 CAG ACG-5 。 用Trizol法提取细胞的mRNA，每孔中加入 lmLTrizol，室温静置10 min，将裂解物移入离心管 中。加入02mL氯仿，振荡15s，冰上静置5min。 12000rmin离心，4。C，15min。吸取上层液体约 05mL于新管中，加入05 mL冷异丙醇，混匀后静 置10min。12000 rmin离心，4C，15min。弃上清，加 入lmL75 乙醇洗涤沉淀7500rmin离心，4“C， 5min。倾去乙醇，室温干燥，用适量DEPC水溶解 RNA，一70C保存。然后分别按逆转录试剂盒与 PCR试剂盒对mRNA进行逆转与多聚酶联反应，反 应体系为25gL，反
15、应条件为94，3min；(94for 30s，50for 30s，72for 30s)；72。C，10min。并对其 产物用含05mgL溴化乙锭的2 琼脂糖凝胶电泳。 124免疫荧光检测HUVEC中CaR与Cav一1定 位 接种于玻片上的细胞孵育24h后，用PBS溶液 洗细胞两次，加一2O冰甲醇lmL，一2O固定 20min。室温下用含02 Triton的PBS洗2次。 加入05 Triton，室温下破膜15min。含02 Triton的PBS洗5min，5 BSA封闭40min。保持 湿度，按1：125的浓度加一抗，置4孵育过夜。 石河子大学学报(自然科学版) 第28卷 按1：200加入相应
16、的FITC标记的羊抗小鼠及 TRITC标记的羊抗兔二抗，室温避光孵育1h，含 02 Triton的PBS洗5rain。按1：1000加核染 料DAPI室温避光孵育15rain，含02 Triton的 PBS洗5min，荧光显微镜观察并记录结果。 125统计学处理 实验数据用 S表示，组间比较用单因素方 差分析，均数问的比较采用t检验。所有数据采用 SPSS130统计软件包进行分析，以P005表示差 异有统计学意义。 2 结果 21 HUVEC细胞的培养与鉴定 取新鲜脐带用胰酶消化法收集原代HUVEC 卜 一 D(caR) 图1 HUVEC中Cav一1及CaR蛋白表达 Fig 1 The pro
17、tein expression of Oav一1 and CaR in HUVEC 24免疫荧光结果 用免疫荧光技术检测HUVEC中Cav一1与 CaR的表达及定位情况，图3图5分别为同一视 于培养瓶，置于37，5 CO。恒温培养箱内孵育 24h后，在倒置显微镜下观察融合的HUVEC呈典 型的铺路石或鹅卵石样排列；对细胞内因子进行 免疫细胞化学染色，95 以上的细胞呈阳性着色，证 实细胞为HUVEC。 22 HUVEC中CaR及Cav一1蛋白表达 用Western blot检测HUVEC中CaR及Cav一 1蛋白的结果(图1)。 23 HUVEC中CaR及Cav一1 mRNA表达 用半定量RT
18、PCR检测HUVEC中CaR和 CavlmRNA的结果(图2)，其目的片段分别为 459bp和260bp。 500bp 400bp 300bp 200bp lOObp 1-一459bp 。 (CaR) 260bp fcav-1) 图2 HUVEC中cav1及CaR mRNA表达 Fig 2 The mRNA expression of Cav1 and CaR in HUVEC 野观察到的DNA染料(DAPI)标记的蓝色荧光细 胞核，TRITC标记的Cavl红色荧光定位于胞膜， FITC标记的CaR绿色荧光定位于胞膜和胞浆。 图3 DNA染料(DAPI)蓝色荧光 显示胞核(荧光显微镜X 40)
19、 Fig 3 DAPI blue fluorescence showed the nucleus I fluorescence microscope X 40) 3 讨论 图4 HUVEC中Oav1的免 疫荧光(荧光显微镜40) Fig4 Immunofluorescence(IF) of Cav-1 in HUVEC(fluorescence 图5 HUVEC中CaR的免疫荧 光(荧光显微镜40) Fig 5 Immunofluorescence(IF)of CaR in HUVEC(fluorescence microscope X 4 0) microscope40) Ca 在细胞内或细
20、胞外要执行功能必须首先 达到或维持一定浓度，而且在细胞内外维持一定的 浓度差。细胞内钙离子浓度(intracellular Ca concentration，Ca 一 )由各种信号分子、钙泵及钙 通道等多种因素精确调控，但Ca 。的调节机制 则长期不明，研究证实第二信使Ca 也可作为第一 信使通过激活细胞CaR使Ca 增加进而激活 eNOS促使NO生成增加，CaR作用可由G蛋白a 亚基介导，但也与CaR相互作用的蛋白有关，Cav一1 是与CaR相互作用的蛋白之一 。CaR广泛分布 于各种不同组织，起着除钙稳态调节以外重要的细 胞内作用 ，如在成纤维细胞，有促细胞增殖作用， 在角质化细胞和人结肠
21、上皮细胞有诱导细胞分化的 作用，在前列腺癌细胞有保护细胞抗凋亡的作用，在 第2期 王振焕，等：小凹蛋白一1和钙受体在人的脐静脉内皮细胞的表达 垂体细胞CaR参与了促肾上腺皮质激素(ACTH) 和促黑色素细胞激素(aMSH)的释放，在胰岛素瘤 原代培养的细胞，CaR可引起胰岛素的释放，在肝 细胞和胃窦细胞分别引起胆汁和胃泌素的分泌。 至今已克隆到Cav一1家族中的三个成员：Cav一1 (两种变异体a和J3)，Cav一2和Cav一3，Cav一1和2形 成稳定的异源寡聚体，在内皮细胞、平滑肌细胞、成 纤维等细胞中含量丰富，而Cav一3是在肌肉中特异 表达 。Caveolae是细胞信号传导中心，与信号
22、传 导有关的受体、激酶及联接蛋白质等在Caveolae区 域高度富集，因而，Caveolae和Caveolin的异常又 和许多疾病如动脉粥样硬化、高血压、肿瘤等密切相 关 引。 随着人们生活水平的提高，心血管系统疾病也 逐年增加，CaR和Cav一1在心血管系统疾病发生、发 展中的作用尚未阐明，因此这方面的研究工作也是 迫不及待的，Lars等 研究发现Cav一1与慢性阻塞 性肺疾病病人的血流动力学有着一定的关系， Weston等8 用药理学、免疫印记和免疫共沉淀等技 术证明在鼠的肠系膜动脉和猪的冠状动脉内皮细胞 有CaR mRNA和蛋白的表达，并认为CaR可能在 维持血管张力中起重要作用。在某些
23、类型细胞的研 究中已证实CaR和Cav一1可形成复合物，并存在相 互作用，如在培养的人骨肉瘤细胞株(Saos2)中有 CaR及CavlmRNA和蛋白质的表达，并证实CaR 和Cav一1形成复合物并共定位于胞膜并且Cav一1可 上调CaR的功能 。ECa 。通过CaR调节许多 不同类型细胞的功能。在HUVEC是否表达了一 个功能性的CaR未见报道。本实验在以原代培养 的HUVEC为研究对象，从蛋白及mRNA两个水 平证实HUVEC中的Cav一1和CaR的存在。实验 中发现，CaR及Cav一1在HUVEC的膜上均有表达 且Cav一1表达甚是丰富，免疫荧光证实Cavl定位 于胞膜而CaR定位于胞膜与
24、胞浆中，两者功能上的 联系，有待进一步的阐明。该研究结果不仅对深入 了解CaR和Cav一1在血管系统中的生理和病生理 作用有重要作用，还将对心血管疾病防治提供一条 新途经。 参考文献： 1Cohen A W，Hnasko R，Schubert W，et a1Role of caveolae and caveolins in health and diseaseJPhysiol Rew，2004，84 (4)：13411379 2Ziegelstein RC，Xiong Y，He C，et a1Expression of a func tional extraeellular calcium-s
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