1、 大鼠-内啡肽 (-内啡肽)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 产品编号：E0806r 本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断! 预期应用 ELISA法定量测定大鼠血清、血浆或其它相关生物液体中-内啡肽含量。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗-内啡肽抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗-内啡肽抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的-内啡肽呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板：
2、一块（96孔） 2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释100 pg/ml，50 pg/ml，25 pg/ml，12.5 pg/ml，6.25 pg/ml，3.12 pg/ml，1.56 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。 如配制100 pg/ml标准品：取0.5ml 200 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3. 样品稀释液：120ml/瓶。 4.
3、检测稀释液A：110ml/瓶。 5. 检测稀释液B：110ml/瓶。 6. 检测溶液A：1120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如 1ul 检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 7. 检测溶液B：1120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。 8. 底物溶液：110ml/瓶。 9. 浓洗涤液：130ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液：110ml/瓶（2N H2
4、SO4）。 标本的采集及保存 1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。 2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8 C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。 3. 其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。 注：以上标本置4保存应小于1周，-20或-80均应密封保存，-20不应超过3个月，-80不应超过6个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血
5、标本不宜进行此项检测；高血脂的标本不需进行特殊处理，可直接检测。 操作步骤 实验开始前，请提前配制好所有试剂；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，均应用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。建议各实验室在操作前先进行预实验以建立最佳稀释倍数。 1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应120分钟。 为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。 2.
6、 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37,60分钟。 3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。 4. 每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液） 100ul，37，60分钟。 5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。 6. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的
7、梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。 7. 依序每孔加终止溶液 50ul，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。 8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后立即进行检测。 注： 1. 每次实验留一孔作为空白调零孔（不同于空白孔），该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。 2. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。 3. 洗板不正确可以导致不准确的
8、结果。在加入检测溶液B或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，洗板拍干后请立即加入后步试剂，应避免微孔干燥掉。 4. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。 5. 在储存和温育时避免强光直接照射。 6. 未使用完的酶标板或者试剂，请于 2-8保存。标准品、检测溶液 A 工作液、检测溶液 B工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。 7. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。 洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标
9、板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水 纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需 要，重复此过程数次。 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠-内啡肽，且与其它相关蛋白无交叉反应。 计算 以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线（推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3），根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的 OD
10、 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项 1. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。 2. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。 3. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。 4. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。 5. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。 6. 底物请避光保存。 检测范围：1.56 pg/ml - 100 pg/ml 最低检测限：1 pg/ml 说明 1. 只有全部使用USCNLIFE试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联
11、的，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守USCNLIFE试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。 2. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。 3. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。 4. 试剂盒保存：-20（较长时间不用时，仅适用于部分试剂，具体见标签）；2-8（频繁使用时）。 5. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 6. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 7. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 8. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。 9. 有效期：6个月
