1、食 品 研 究 与 开 发2 0 0 8 年 3 月第 2 9 卷 第 3 期3 8( 2 ) : 8 5 - 8 8 2 2 陈 书 明 , 王 勤 , 成 玉 梅 , 等 . 灵 芝 含 氮 多 糖 对 动 物 机 体 红 细 胞 内S O D 活 性 的 影 响 J . 中 国 食 用 菌 , 1 9 9 4 , 1 3( 3 ) : 2 6 - 2 7 2 3 刘 静 , 阳 帆 , 李 珊 珊 , 等 . 灵 芝 多 糖 G L P 的 抗 疱 疹 病 毒 作 用 机 理 J . 中 国 病 毒 学 , 2 0 0 5 , 2 0( 4 ) : 3 6 2 - 3 6 5 2 4 O
2、 h K W , L e e C K , K i m Y S , e t a l . A n t i h e r p e t i c a c t i v i t i e s o f a c i d i cp r o t e i n b o u n d p o l y s a c c h a r i d e i s o l a t e d f r o m G a n o d e r m a l u c i d u m a l o n ea n d i n c o m b i n a t i o n s w i t h a c y c l o v i r a n d v i d a r a b i
3、 n e J . J E t h n o p h a r m a -c o l o g y , 2 0 0 0 , 7 2 : 2 2 1 - 2 2 7 2 5 K i m Y S , E o S K , O h K W , e t a l . A n t i h e r p e t i c a c t i v i t i e s o f a c i d i c p r o -t e i n b o u n d p o l y s a c c h a r i d e i s o l a t e d f r o m G a n o d e r m a l u c i d u m a l o n
4、 ea n d i n c o m b i n a t i o n s w i t h i n t e r f e r o n s J . J E t h n o p h a r m a c o l o g y , 2 0 0 0 ,7 2 : 4 5 1 - 4 5 8 2 6 罗 俊 , 林 志 彬 . 灵 芝 三 萜 类 化 合 物 药 理 作 用 研 究 进 展 J . 药 学 学报 , 2 0 0 2 , 3 7 ( 7 ) : 5 7 4 - 5 7 8 2 7 杨 海 龙 , 吴 天 祥 , 章 克 昌 . 灵 芝 酸 的 分 子 结 构 与 生 物 活 性 的 关 系 J .食
5、 品 与 生 物 技 术 , 2 0 0 2 , 2 1( 3 ) : 2 4 9 - 2 5 3 2 8 王 明 宇 , 林 志 彬 . 灵 芝 三 萜 类 成 分 在 体 内 外 对 小 鼠 免 疫 性 肝 损伤 的 影 响 J . 中 国 医 药 学 杂 志 , 2 0 0 0 , 3 5( 1 2 ) : 8 0 9 - 8 1 2 2 9 王 斌 , 胡 岳 山 , 李 杰 芬 . 灵 芝 三 萜 对 小 鼠 脾 脏 树 突 状 细 胞 增 殖 的影 响 J . 中 药 材 , 2 8( 7 ) : 5 7 7 - 5 7 9 3 0 余 素 萍 , 张 劲 松 , 唐 庆 九 ,
6、等 . 不 同 发 酵 阶 段 的 灵 芝 菌 丝 三 萜 类成 分 与 抗 肿 瘤 作 用 的 相 关 性 研 究 J . 菌 物 学 报 , 2 0 0 4 , 2 3 ( 4 ) :5 4 8 - 5 5 4 3 1 刘 祖 同 , 罗 信 昌 . 食 用 蕈 菌 生 物 技 术 及 应 用 M . 北 京 : 清 华 大 学出 版 社 , 2 0 0 2 : 1 6 6 3 2 王 明 珠 , 黄 瑞 珊 , 吴 其 威 , 等 . 灵 芝 G L - 2 的 液 态 发 酵 及 形 态 学 特性 的 研 究 J . 上 海 交 通 大 学 学 报 , 1 9 9 4 , 2 8( 2
7、 ) : 1 3 8 - 1 4 1 3 3 李 平 作 , 徐 柔 , 章 克 昌 . 灵 芝 胞 外 多 糖 深 层 发 酵 培 养 基 的 优 化 J .无 锡 轻 工 大 学 学 报 , 1 9 9 8 , 1 7( 4 ) : 2 6 - 3 0 3 4 王 谦 , 李 育 岳 , 杨 晓 先 , 等 . 灵 芝 深 层 培 养 及 应 用 研 究 J . 食 用 菌学 报 , 1 9 9 4 , 1( 2 ) : 3 7 - 4 0 3 5 F a n g Q H , Z h o n g J J . S u b m e r g e d f e r m e n t a t i o n
8、 o f h i g h e r f u n g u s G a n o -d e r m a l u c i d u m f o r p r o d u c t i o n o f v a l u a b l e b i o a c t i v e m e t a b o l i t e s - g a n -o d e r i c a c i d a n d p o l y s a c c h a r i d e J . B i o c h e m E n g J , 2 0 0 2( 1 0 ) : 6 1 - 6 5 3 6 F a n g Q H , Z h o n g J J .
9、E f f e c t o f i n i t i a l p H o n p r o d u c t i o n o f g a n o d e r i ca c i d a n d p o l y s a c c h a r i d e b y s u b m e r g e d f e r m e n t a t i o n o f G a n o d e r m al u c i d u m J . P r o c e s s B i o c h e m , 2 0 0 2 , 3 7 : 7 6 9 - 7 7 4 3 7 L e e K M , L e e S Y , L e e
10、H Y . B i s t a g e c o n t r o l o f p H f o r i m p r o v i n g e x -o p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n f r o m m y c e l i a o f G a n o d e r m a l u c i d u m i n a na i r - l i f t f e r m e n t o r J . J B i o s c i B i o e n g , 1 9 9 9 , 8 8( 6 ) : 6 4 6 - 6 5 0 3 8 L e e H ,
11、 S o n g M , Y u Y , e t a l . P r o d u c t i o n o f G a n o d e r m a l u c i d u mm y c e l i u m u s i n g c h e e s e w h e y a s a n a l t e r n a t i v e s u b s t r a t e : r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s a n d b i o k i n e t i c s J . B i o c h e m E n g J , 2 0 0 3 , 1 5 : 9
12、 3 - 9 9 3 9 Y a n g F C , L i a u C B . T h e i n f l u e n c e o f e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s o np o l y s a c c h a r i d e f o r m a t i o n b y G a n o d e r m a l u c i d u m i n s u b m e r g e d c u l -t u r e s J . P r o c e s s B i o c h e m , 1 9 9 8 , 3 3( 5 ) : 5 4 7
13、- 5 5 3 4 0 Y a n g F C , L i a u C B . E f f e c t s o f c u l t i v a t i o n c o n d i t i o n s o n t h e m y c e l i a lg r o w t h o f G a n o d e r m a l u c i d u m i n s u b m e r g e d f l a s k c u l t u r e s J . B i o p r o -c e s s E n g i n e e r i n g , 1 9 9 8 , 1 9 : 2 3 3 - 2 3 6
14、4 1 F a n g Q H , T a n g Y J , Z h o n g J J . S i g n i f i c a n t o f i n o c u l a t i o n d e n s i t yc o n t r o l i n p r o d u c t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e a n d g a n o d e r i c a c i d b y s u bm e r g e d c u l t u r e o f G a n o d e r m a l u c i d u m J . P r o c e s s
15、B i o c h e m , 2 0 0 2 ,3 7 : 1 3 7 5 - 1 3 7 9 4 2 T a n g Y J , Z h o n g J J . R o l e o f o x y g e n s u p p l y i n s u b m e r g e d f e r m e n t a t i o no f G a n o d e r m a l u c i d u m f o r p r o d u c t i o n o f g a n o d e r m a p o l y s a c c h a r i d ea n d g a n o d e r i c a
16、 c i d J . E n z y m e M i c r o b T e c h n o l , 2 0 0 3 , 3 2 : 4 7 8 - 4 8 4收 稿 日 期 : 2 0 0 7 - 0 7 - 2 4王 亚 利1, 洪 厚 胜1, 张 庆 文1, 刘 军2( 1 . 南 京 工 业 大 学 制 药 与 生 命 科 学 学 院 , 江 苏 南 京 2 1 0 0 0 9 ; 2 . 四 川 理 工 学 院 生 物 工 程 系 , 四 川 自 贡 6 4 3 0 0 0 )基 因 工 程 技 术 在 醋 酸 菌 改 良 中 的 应 用摘 要 : 醋 酸 发 酵 过 程 乙 醇 脱
17、 氢 酶 ( A D H ) 、 乙 醛 脱 氢 酶 ( A L D H ) 酶 系 起 着 重 要 作 用 , 主 要 影 响 着 醋 酸 菌 的 产 酸 速 率 和耐 酸 性 , 介 绍 了 醋 酸 菌 的 耐 热 机 制 和 耐 酸 机 制 。 阐 述 了 基 因 d n a K J 与 g r o E S L 等 基 因 克 隆 技 术 在 耐 高 温 醋 酸 菌 构 建上 的 应 用 , 醋 酸 耐 酸 因 子 a a r A 、 a a t A 以 及 A D H 、 A L D H 、 辅 酶 Q ( P Q Q ) 和 不 饱 和 脂 肪 酸 、 顺 乌 头 酸 酶 等 对 酸
18、 度 的 耐 受情 况 , 通 过 过 量 表 达 上 述 影 响 因 子 提 高 醋 酸 菌 的 耐 酸 性 。 展 望 了 在 国 家 8 6 3 等 项 目 引 导 下 研 究 机 构 和 企 业 加 强 醋 酸发 酵 的 基 础 研 究 以 便 于 构 建 高 活 性 的 醋 酸 菌 。关 键 词 : 醋 酸 菌 ; 耐 酸 ; 耐 温 ; 基 因 工 程A P P L I C A T I O N O F G E N E T E C H N O L O G Y O N T H E M O D I F I E D A C E T I C A C I D B A C T E R I AW
19、A N G Y a - l i1, H O N G H o u - s h e n g1, Z H A N G Q i n g - w e n1, L I U J u n2!作 者 简 介 : 王 亚 利 ( 1 9 7 6 - ) , 男 ( 汉 ) , 硕 士 , 研 究 方 向 : 微 生 物 液 态 深 层 发 酵 与 食 品 生 产 。综 述1 9 0食 品 研 究 与 开 发2 0 0 8 年 3 月第 2 9 卷 第 3 期( 1 . C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e a n d P h a r m a c e u t i c a l
20、 E n g i n e e r i n g , N a n j i n g U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y , N a n j i n g 2 1 0 0 0 9 ,J i a n g s u , C h i n a ; 2 . B i o e n g i n e e r i n g D e p a r t m e n t , S i c h u a n T e c h n o l o g y U n i v e r s i t y , Z i g o n g 6 4 3 0 0 0 , S i c h u a n , C h i n
21、a )A b s t r a c t : T h i s r e v i e w e x a m i n e s t h e e n z y m e s s u c h a s A D H a n d A L D H w e r e p l a y i n g i m p o r t a n t r o l e s i n a c e t i ca c i d f e r m e n t a t i o n , p a r t i c u l a r l y o n c o n t r o l i n g t h e p r o d u c t i v i t y a n d a c i d
22、t o l e r a n c e . T h e r e c e n t l y i n v e s t i g a t i o n s ,m o r e i m p o r t a n t g e n e s t e c h n o l o g y w e r e u s e d o n g e t t i n g n e w m o d i f i e d b a c t e r i a . C l o n e a n d o v e r e x p r e s s t h e g e n e sr e s p o n s i b l e f o r a c e t i c a c i
23、d t h e r m o r e s i s t a n t a n d r e s i s t a n c e s u c h a s d n a K J / g r o E S L / a a r A / a t a A a n d A D H / A L D H a sw e l l a s P Q Q t o g e t h i g h l y t o l e r a n t a c i d b a c t e r i a . I t r e p o r t s C h i n a a l r e a d y p a i d t o p d o l l a r o n t h e r
24、 e s e a r c h o f h i g he f f i c i e n c y v i n e g a r f e r m e n t a t i o n a n d b u i l t n e w a c e t i c a c i d b a c t e r a , s u c h a s 8 6 3 h a s a l r e a d y s t a r t e d t o s u p p o r t o r tt h i s p r o j e c t , t h e r e w i l l b e g r e a t i m p r o v e m e n t i n C
25、 h i n a s v i n e g a r f e r m e n t t e c h n o l o g y a n d e q u i p m e n t w i t h f a c t o r i e sa n d a c a d e m y w o r k t o g e t h e r .K e y w o r d s : a c e t i c a c i d b a c t e r i a ; a c e t i c a c i d r e s i s t a n c e ; t h e r m o r e s i s t a n t ; g e n e t e c h n
26、 o l o g y酿 造 食 醋 是 人 们 生 活 中 不 可 缺 少 的 酸 性 调 味 品 ,根 据 A C N i e l s e n 调 查 , 全 球 酿 造 醋 的 总 产 量 约 为 3 5 0万 t( 1 0 0 g / L , H A C ) 美 国 食 醋 消 费 量 最 多 , 约 为 1 1 0 万 t( 1 0 0 g / L , H A C ) , 我 国 醋 总 产 量 约 为 8 0 万 t ( 1 0 0 g / L ,H A C ) 。 醋 酸 菌 是 醋 酸 发 酵 的 主 要 工 业 用 菌 , 醋 酸 菌 直接 影 响 着 酿 造 食 醋 的 产
27、量 和 风 味 , 醋 酸 发 酵 主 要 有 固态 和 液 态 两 种 不 同 的 工 艺 , 液 态 深 层 酿 醋 工 艺 因 占 地小 、 发 酵 周 期 短 、 易 实 现 管 道 化 自 动 化 、 产 酸 速 率 快 、 可生 产 高 酸 度 酿 造 醋 等 优 点 而 日 益 受 到 众 多 生 产 厂 家 的青 睐 。醋 酸 菌 最 适 发 酵 温 度 为 3 0 , 液 态 深 层 发 酵 因 为采 用 纯 种 、 强 制 通 风 发 酵 产 生 比 固 态 发 酵 更 多 的 热 量 ,夏 季 温 度 远 超 过 了 3 0 , 都 给 液 态 醋 酸 发 酵 工 业 带
28、 来了 很 大 的 困 难 , 发 酵 温 度 高 会 导 致 醋 酸 发 酵 速 率 急 剧下 降 , 温 度 控 制 不 当 甚 至 造 成 减 产 、 停 产 等 严 重 后 果 ,而 高 酸 度 的 酿 造 醋 则 具 有 减 少 储 存 空 间 、 便 于 运 输 和方 便 食 品 加 工 业 使 用 等 诸 多 优 点 1 。众 多 研 究 者 已 经 采 取 紫 外 诱 变 、 离 子 束 注 入 等 方法 改 良 了 醋 酸 菌 的 耐 高 温 、 高 酸 等 性 状 2 - 5 , 但 这 种 自 然筛 选 的 方 式 工 作 量 大 且 成 功 率 低 , 基 因 工 程
29、技 术 已 经 广泛 的 利 用 到 了 食 品 工 业 中 , 日 本 等 国 也 已 经 利 用 基 因 技术 定 向 的 改 良 了 醋 酸 菌 种 耐 高 酸 、 高 温 的 特 性 , 而 该 技术 在 国 内 醋 酸 菌 改 良 领 域 的 研 究 仍 属 空 白 。 文 章 介 绍 了影 响 醋 酸 菌 发 酵 的 酶 系 、 当 前 国 际 上 利 用 基 因 工 程 修饰 、 改 良 传 统 醋 酸 发 酵 菌 的 耐 高 温 、 高 酸 的 研 究 现 状 , 以促 进 国 内 基 因 工 程 技 术 在 醋 酸 菌 改 良 上 的 应 用 。1 醋 酸 菌 发 酵 机 理
30、 及 影 响 其 发 酵 性 能 的 因 素1 . 1 醋 酸 菌 发 酵 的 机 理醋 酸 菌 在 脱 氢 酶 系 的 作 用 下 把 乙 醇 转 化 为 乙 酸 ,乙 醇 脱 氢 酶 ( A D H ) 和 乙 醛 脱 氢 酶 ( A L D H ) 是 醋 酸 发 酵 过程 中 起 主 要 作 用 的 酶 , 辅 酶 P Q Q 等 对 酶 系 尤 其 是A D H 的 跨 膜 运 输 起 着 重 要 的 促 进 作 用 , 1 9 5 4 年 科 学 家成 功 的 从 醋 酸 杆 菌 中 分 离 了 乙 醇 脱 氢 酶 ( A D H ) 和 乙 醛脱 氢 酶 ( A L D H )
31、, P r i e u r 和 N a k a y a m a 等 研 究 了 醋 酸 菌 对乙 醇 氧 化 机 制 时 也 验 证 了 乙 醇 氧 化 过 程 需 要 这 两 种 酶系 统 的 催 化 。 日 本 的 正 井 博 之 成 功 的 分 离 了 在 酸 度1 0 0 g / L 以 上 还 能 继 续 繁 殖 产 酸 的 醋 酸 菌 A c e t o b a c t e rp o l y o x o g e n s s p . n o v , 测 定 该 菌 种 的 A D H 与 A L D H 活 性后 发 现 其 比 活 性 分 别 为 3 0 与 2 0 , 远 远 高
32、 于 低 酸 度 发酵 时 候 醋 酸 菌 的 平 均 比 活 性 1 , 通 过 分 批 发 酵 实 验 发现 醋 酸 菌 的 产 酸 速 率 与 这 两 种 酶 特 别 是 A D H 酶 的 比活 性 有 极 大 的 相 关 性 , 研 究 还 发 现 P Q Q 等 辅 酶 在 醋 酸菌 的 耐 高 酸 发 酵 中 发 挥 着 重 要 的 作 用 6 - 9 。1 . 2 影 响 醋 酸 菌 发 酵 的 因 素1 . 2 . 1 温 度 对 醋 酸 菌 发 酵 的 影 响醋 酸 菌 必 须 在 适 宜 的 生 长 环 境 中 才 能 发 挥 最 大的 活 性 , 温 度 过 高 , 醋
33、 酸 菌 会 提 前 老 化 , 醋 酸 发 酵 速 率降 低 , 甚 至 导 致 醋 酸 菌 死 亡 而 产 生 大 量 的 泡 沫 , 液 态酿 醋 工 业 目 前 普 遍 采 用 3 0 为 恒 定 的 发 酵 温 度 。F r e g a p a n e 等 1 0 研 究 了 不 同 发 酵 温 度 对 半 连 续 米 醋 发酵 过 程 醋 酸 速 率 和 酸 醇 转 化 率 等 发 酵 的 影 响 , 他 们 认为 较 高 的 发 酵 温 度 能 提 高 醋 酸 的 生 成 速 率 , 实 验 结 果表 明 发 酵 温 度 从 2 6 3 2 时 产 酸 速 率 对 应 的 从(
34、1 . 2 1 0 . 0 7 ) g /( L h ) 上 升 到 ( 1 . 6 9 0 . 0 8 ) g / ( L h ) , 在 发酵 温 度 到 3 4 时 产 酸 速 率 明 显 下 降 。醋 酸 菌 的 耐 高 温 性 与 醋 酸 菌 的 脂 类 、 G - C 含 量 、 热休 克 蛋 白 、 D N A 聚 合 酶 等 因 素 有 关 。 一 般 嗜 热 菌 的D N A 双 螺 旋 结 构 中 氢 键 的 数 量 大 于 嗜 温 菌 D N A 氢键 的 数 量 , 嗜 温 菌 D N A 的 G - C 碱 基 对 含 量 一 般 为4 4 . 9 % , 嗜 热 菌
35、 D N A 的 G - C 碱 基 对 含 量 为 5 3 . 2 % ,G - C 含 量 越 高 , D N A 分 子 的 解 链 温 度 也 越 高 。 S h u 等 1 1 分 离 了 耐 高 温 发 酵 的 A c e t o b a c t e r s p . I 1 4 - 2 醋 酸 菌 , 经 检测 发 现 该 菌 株 D N A 中 的 G - C 碱 基 的 含 量 高 达 5 1 . 7 % 。综 述1 9 1食 品 研 究 与 开 发2 0 0 8 年 3 月第 2 9 卷 第 3 期N d o y e 等 1 2 - 1 3 从 南 非 醋 酸 发 酵 工 厂
36、 成 功 筛 选 了 两 株 编号 为 C W B I - B 4 1 8 和 C W B I - B 4 1 8 可 在 4 0 高 温 发 酵的 醋 酸 菌 , 通 过 1 6 S r D N A 核 酸 测 序 后 确 定 其 属 于 醋 酸菌 属 , 分 析 了 温 度 对 其 乙 醇 脱 氢 酶 ( A D H ) 和 乙 醛 脱 氢 酶( A L D H ) 的 影 响 , 随 温 度 的 上 升 A D H 和 A L D H 的 活 性都 呈 现 下 降 趋 势 , 实 验 测 定 菌 株 D N A 中 G - C 的 含 量高 达 5 6 % , 分 析 认 为 这 可 能
37、 是 该 菌 株 可 以 耐 高 温 的 原因 之 一 。 但 郭 春 雷 等 1 4 统 计 分 析 了 8 0 多 种 超 高 温 菌 的基 因 组 G - C 含 量 和 1 6 S r R N A 中 G - C 含 量 后 认 为 高温 菌 的 耐 热 性 与 基 因 组 G - C 含 量 没 有 直 接 关 系 , 而 与1 6 S r R N A 中 G - C 含 量 呈 现 明 显 的 正 相 关 , 1 6 S r R N A1 8 h e l i x 的 二 级 结 构 分 析 也 显 示 高 温 菌 生 长 温 度 与 1 6 Sr R N A 热 稳 定 性 正 相
38、 关 。 G a w a n d e 等 1 5 研 究 了 E . c o l i 热休 克 蛋 白 和 R N A 聚 合 酶 在 热 胁 迫 时 表 达 量 的 变 化 , 发现 u s p A 和 g r p E 热 休 克 蛋 白 及 R N A 聚 合 酶 在 细 胞 受到 外 界 环 境 胁 迫 时 会 开 始 表 达 与 合 成 。1 . 2 . 2 醋 酸 浓 度 对 醋 酸 菌 发 酵 的 影 响高 浓 度 醋 酸 的 存 在 不 利 于 菌 体 的 生 长 , 严 重 的 抑制 了 醋 酸 菌 的 产 酸 能 力 。 醋 酸 发 酵 的 产 酸 速 率 和 产 酸浓 度
39、是 衡 量 醋 酸 菌 种 的 优 劣 的 主 要 指 标 , 改 良 高 产 酸速 率 且 能 产 高 酸 的 醋 酸 菌 种 是 醋 酸 菌 种 选 育 的 技 术 关键 。 高 浓 度 的 醋 酸 对 醋 酸 菌 的 发 酵 有 抑 制 作 用 甚 至 导致 醋 酸 菌 的 死 亡 , 优 良 的 醋 酸 菌 不 仅 应 该 具 有 生 产 速率 快 , 还 要 具 备 在 高 含 量 的 醋 酸 环 境 中 死 亡 率 低 且 继续 发 酵 产 生 醋 酸 , 能 耐 高 浓 度 的 醋 酸 浓 度 , 这 也 是 研 究者 一 直 为 之 努 力 的 方 向 。众 多 科 学 家 对
40、 微 生 物 耐 酸 机 制 进 行 了 研 究 , 表 明其 耐 酸 主 要 是 由 细 胞 膜 组 分 如 膜 蛋 白 和 膜 脂 肪 酸 等 的变 化 引 起 , 研 究 也 表 明 F1F0- A T P 酶 对 细 胞 内 p H 值 、 细胞 浓 度 变 化 和 胞 内 碱 性 物 质 的 产 生 有 调 节 作 用 6 。C h e v i l l e 等 1 6 研 究 了 E . c o l i 的 R N A 聚 合 酶 因 子 在 受到 外 部 环 境 应 激 时 会 被 激 活 并 合 成 , 发 现 经 长 期 的 酸性 诱 导 可 以 增 强 其 生 长 的 耐 酸
41、 性 , 诱 导 后 E . c o l i 膜 蛋白 双 向 凝 胶 电 泳 表 明 了 a s r 蛋 白 表 达 增 加 。2 基 因 工 程 改 良 醋 酸 菌基 因 工 程 是 菌 种 改 良 和 选 育 中 最 具 魅 力 、 最 有 潜力 的 技 术 , 它 不 仅 可 以 在 基 因 水 平 对 微 生 物 靶 基 因 进行 精 确 修 饰 , 还 可 以 把 分 离 到 的 目 的 基 因 导 入 到 受 体菌 的 特 定 靶 位 从 而 实 现 有 目 的 的 菌 种 改 良 , 目 前 研 究者 已 经 利 用 基 因 工 程 对 醋 酸 菌 的 耐 高 温 、 耐 高
42、酸 等 特性 进 行 了 改 造 。2 . 1 基 因 工 程 技 术 在 耐 高 温 醋 酸 菌 改 良 中 的 应 用利 用 醋 酸 菌 中 脂 类 、 G - C 含 量 、 热 休 克 蛋 白 、 D N A聚 合 酶 等 与 耐 高 温 有 关 的 因 素 进 行 定 向 的 构 建 和 表达 , 可 以 实 现 醋 酸 菌 的 耐 高 温 发 酵 。 目 前 研 究 较 多 的 醋酸 菌 耐 热 机 制 是 热 休 克 家 族 的 d n a K 、 d n a J 和 G r p E 等蛋 白 , d n a K 是 一 组 重 要 的 热 激 伴 侣 蛋 白 7 0 ( H s
43、 p 7 0 ) , 它包 含 一 个 N 末 端 A T P a s e 和 一 个 C 末 端 区 域 , d n a K 在体 外 能 溶 解 热 变 性 的 蛋 白 聚 集 物 , 在 活 体 内 能 与 胁 迫诱 导 的 未 折 叠 多 肽 结 合 阻 止 其 聚 集 变 性 , 在 胁 迫 减 轻后 有 活 性 的 酶 又 被 释 放 出 来 , 达 到 保 护 酶 结 构 的 作 用 。D n a J 是 在 E . c o l i 中 发 现 的 一 种 调 节 蛋 白 , 它 能 活 化D n a K 的 A T P a s e 活 性 , 协 同 完 成 对 底 物 蛋 白
44、 的 A T P 依赖 的 结 合 和 释 放 , G r p E 作 为 核 苷 酸 交 换 因 子 能 催 化A T P 取 代 A D P 的 反 应 , 它 们 一 起 调 节 分 子 伴 侣 的 活性 , 在 细 胞 受 到 热 、 U V 等 外 部 环 境 变 化 时 实 现 胁 迫 应答 。 但 S u g i m o t o 等 1 7 的 研 究 却 发 现 仅 仅 是 G-细 菌 的d n a K 需 要 d n a J 和 G r p E 的 协 助 完 成 热 激 反 应 , G+菌 细胞 在 A T P 水 解 和 变 性 时 d n a K 不 与 d n a J
45、 和 G r p E 协 同工 作 实 现 热 激 反 应 , 检 测 发 现 其 A T P a s e 区 域 中 缺 少 了G-菌 中 普 遍 存 在 的 2 3 个 氨 基 酸 的 片 段 。A k i k o 等 1 8 - 1 9 分 别 研 究 了 醋 酸 菌 中 的 G r o e s 、 G r o e l 、d n a K 和 d n a J 热 休 克 蛋 白 在 转 录 过 程 对 温 度 变 化 和 酒精 、 酸 度 变 化 的 响 应 , 研 究 表 明 G r o e s 和 G r o e l 组 成 了一 个 操 纵 子 g r o E S L , 该 操 纵
46、 子 属 于 强 启 动 子 , 易 调 控 ,经 热 诱 导 后 能 几 十 倍 的 快 速 转 录 , d n a K 在 d n a J 调 节蛋 白 的 协 助 下 完 成 对 温 度 的 胁 迫 。 实 验 中 分 别 过 量 表达 d n a K J 及 g r o E S L 操 纵 子 可 以 增 加 醋 酸 菌 对 温 度 和酒 精 的 耐 受 性 , 即 使 在 4 2 高 温 下 改 良 过 的 醋 酸 菌 在低 酸 度 下 都 可 以 正 常 的 生 长 , 实 验 对 d n a K J 和 g r o E S L操 纵 子 进 行 了 克 隆 和 测 序 。也 有
47、研 究 者 认 为 除 了 上 述 因 子 对 醋 酸 菌 的 耐 热 性起 着 根 本 作 用 外 , 金 属 离 子 、 膜 A T P 酶 等 因 素 与 其 耐热 性 的 产 生 也 有 一 定 的 关 系 。 随 着 对 醋 酸 菌 耐 热 机 制研 究 的 深 入 , 耐 热 醋 酸 工 程 菌 的 开 发 和 利 用 将 会 为 高温 醋 酸 发 酵 工 业 开 辟 新 的 广 阔 前 景 。2 . 2 基 因 工 程 技 术 在 耐 高 浓 度 酸 醋 酸 菌 改 良 中 的 应 用基 于 科 学 家 对 微 生 物 耐 酸 机 制 的 研 究 , 人 们 利 用基 因 工 程
48、 技 术 定 向 的 改 变 细 胞 膜 组 分 如 膜 蛋 白 和 膜 脂肪 酸 等 达 到 醋 酸 菌 在 高 浓 度 醋 酸 存 在 下 可 以 继 续 产 酸的 目 的 。 随 着 对 醋 酸 杆 菌 基 因 组 以 及 相 关 功 能 基 因A D H 、 A L D H 、 P Q Q 和 质 粒 等 研 究 的 深 入 , 人 们 还 可 以利 用 基 因 技 术 按 照 自 己 的 意 愿 增 加 A D H 的 成 分 和 耐酸 性 的 质 粒 基 因 从 而 完 成 高 性 能 醋 酸 工 程 菌 的 构 建 。S t e i n e r 等 2 0 通 过 双 向 凝 胶
49、 电 泳 分 析 了 醋 酸 菌 耐 酸过 程 蛋 白 质 表 达 的 变 化 情 况 , 半 自 动 的 电 脑 分 析 显 示随 着 醋 酸 盐 的 加 入 ( 其 他 的 热 、 渗 透 等 胁 迫 除 外 ) 至 少综 述1 9 2食 品 研 究 与 开 发2 0 0 8 年 3 月第 2 9 卷 第 3 期有 5 0 种 蛋 白 质 被 显 著 的 诱 导 表 达 , 表 明 了 在 酸 度 胁 迫时 候 蛋 白 质 的 表 达 发 生 了 很 大 的 变 化 。F u k a y a 等 2 1 分 离 了 对 酸 度 有 抗 性 的 醋 酸 敏 感 性 突变 体 , 并 用 其 做 克 隆 醋 酸 抗 性 D N A 片 段 的 寄 主 , 对 分离 出 p A R 1 6 1
