1、反向 PCR2SSOP 技术行 HLA2AB分型与临床应用冯明亮 季 芸 马 俊 陆 琼 稽月华 张工梁 杨 颍(上海市血液中心免疫遗传研究室 上海 200051)摘要 建立快速、准确的 DNA 分型技术并用于临床移植前 HLA2AB 配型 ,以弥补血清学分型技术的局限性。采用反向聚合酶链反应 2序列特异寡核苷酸探针杂交技术 (反向 PCR2SSOP) 进行DNA 分型 ,可检出 HLA2A ( 3 0101 - 8001)和 B ( 3 07021 - 8201) 等等位基因。结果表明 ,发现利用反向 PCR2SSOP 技术对所有样本分型均获成功 ,无假阳性和假阴性结果出现 ;美国洛杉矶加州
2、大学 (UCLA)质控细胞 DNA 分型结果与 UCLA 公布的测序结果一致 ;血清学与基因分型相比 ,血清学结果 HLA2A 错检率 6. 4 %和 HLA2B 错检率为 7. 4 %。 2 例白血病病人分别有一个 HLA 抗原血清学方法不能检出。结论提示 ,反向 PCR2SSOP 技术用于 HLA 分型分辨率高 ,简单快速 ,结果直观、准确 ,分型结果较血清学方法更加精确 ,可适用于临床应用。关键词 反向 PCR2SSOP HLA2AB 分型 配型中国图书资料分类法分类号 R446. 6HLA 位于人类第 6 号染色体短臂 6p21. 3 区域 ,具有高度的多态性。它在抗原识别和递呈、免疫
3、应答与调控等方面 ,起着非常重要的作用 ,是影响造血干细胞移植成败和器官移植物长期存活的关键因素之一 1 ,其中 HLA2A ,B ,DR 的影响较大。目前 ,常规采用血清学分型方法用于 HLA2AB 分型 ,但是由于抗血清之间存在交叉反应性及高质量的抗血清较难得到 ,从而导致血清学分型结果不尽如人意 ,造成分型错误及空白较多 2 。本研究采用反向 PCR2SSOP ( reverse polymerase chain reaction2sequencespecific oligo probe) 方法 3 作 HLA2A ,B ,DR 分型 ,并用于移植前配型。现国内 HLA2DR 基本采用D
4、NA 分型 ,故本文不作详细讨论。反向 PCR2SSOP 方法即通过 5端标记有生物素的特异引物扩增 HLA2A ,B 第二 ,第三外显子高变区域 ,再与根据这些高变区序列设计的交联于尼龙膜上的寡核苷酸探针杂交 ,可检测截至于 1998 年11 月 WHO 序列文库中的 A 座位 107 个等位基因 ,B 座位 238 个等位基因。材料与方法检测样本54 例 HLA 配型标本和 6 例脐血标本 ,用微量淋巴细胞毒试验做 HLA2AB 分型 ,采用购自 OneLAMDA 公司的单克隆抗体血清盘 4 。质控细胞由美国洛杉矶加州大学 (UCLA) 配型中心提供16 份质控细胞 ,提供的分型结果均通过
5、测序完成。引物和探针引物混合物 (含 Taq 酶 ) 和杂交条 (探针 ) 来自英国 D YNAL 公司 , A 座位扩增产物 Exon 2 和Exon 3分别为 480 bp 和 314 bp ,B 座位扩增产物Exon 2和 Exon 3 分别为 376 bp 和 355 bp ,其中 A座位 35 条探针 ,B 座位 56 条探针。基因分型利用反向 PCR2SSOP 技术对所有样本及 UCLA质控标本进行 HLA2AB 基因分型。基因组 DNA 采用快速硫氰酸胍法 (本室研制 ) ,DNA 浓度为 400 ngP50 l。PCR 扩增 :扩增体系 60 l ,引物混合物 30 l ,DN
6、A 15 l , 6. 0 mmolPL MgCl2 15 l ; 完成于PE9600 PCR 仪 ,参数 :95 15 秒 ,60 45 秒 ,72 15 秒 35 个循环 ;72 5 分钟 ;置于 15 。膜杂交 50 30 分钟 ;抗生物素抗体 2辣根过氧化物酶 ( HRP)与膜交联 ,室温 15 分钟 ; HRP 催化底物四甲基联苯胺在室温下显色。借助电脑进行结果分析。2000 - 10 - 27 收稿 ;2001 - 06 - 29 接受953中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology 2001 ; 9 (4) 1995-2004 T
7、singhua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.结 果利用反向 PCR2SSOP 技术对 UCLA 提供的质控细胞进行 HLA2AB 分型 ,结果见表 1 和 2。实验结果与 UCLA 公布结果完全一致 ,符合率 100 %。Table 1 Comparison of HLA2A genotyping results of UCLAcontrol cell using reverse PCR2SSOP with the published resultsCellNo.UCLA published results Rever
8、se PCR2SSOP results A 3 A 3 A 3 A 31029 2601 7401 2601P02 7401 - 031030 31012 7401 31012 7401 - 031031 0205 3201 0205P08 32011032 0201 31012 0201P07P15NP18P20P24P29310121033 0201 3001 0201P07P15NP18P20P24P2930011034 11011 3303 1101 - 03 3301P031035 2402101 3301 2402101P09NP17 3301P031036 68012 3001
9、68012P06 30011037 02011 3001 02011P012P07P18 + 30011038 2402101 3401 2402101P09N + 34011039 03011 3001 03011 - 013P03N + 30011040 03011 11011 03011P012P03NP04 1101 - 031041 0101 7403 0101P02 7401 - 031042 03011 7403 03011 - 013P03NP04 7401 - 031043 0101 7403 0101P02 7401 - 031044 0203 2407 0203 2407
10、配型和脐血标本用反向 PCR2SSOP 技术进行分型 ,结果见表 3 ,其中 39 例血清学分型结果与DNA 分型结果一致 ,血清学分型错检率 A 位点6. 4 %(7P108) ,B 位点 7. 4 % (8P108) 。样本 00087 ,00088 ,00089 和 00090 是脐血标本 ,由于血样保存的问题无法用血清学方法分型 ,未列入错检率统计范围。2237 和 2274 号 2 例白血病病人的样本 ,其中2237 号血清学未能检出 A24 ,而 2274 号血清学未能检出 B46。讨 论主要组织相容性复合物 (MHC) 涉及移植免疫 ,Table 2 Comparison of
11、HLA2B genotyping results of UCLAcontrol cell using reverse PCR2SSOP with the published resultsCell No. UCLA published results Reverse PCR2SSOP results B 3 B 3 B 3 B 31029 07021 1510 0702 15101030 4801 1503 4801 15031031 5001 1529 5001 15291032 39022 3516 3902P08 35161033 4201 7801 4201 7801P021034 5
12、106 3503 5106 3503P02P04P09P121035 4402 7801 4402 7801P021036 52012 3508 5201 35081037 4202 51011 4202 51011P012P03P09P141038 4002 1525 4002 15021039 4202 1516 4202 15161040 3508 1518 3508 15181041 44031 5701 4403P07 57011042 07021 44031 0702 4403P071043 07021 3701 0702 37011044 1502 3505 1502 3501P
13、07P11P23P17肿瘤免疫 ,疾病关联和免疫应答等诸领域。因此 ,在器官和造血干细胞移植前进行 HLA 配型非常重要。传统的的血清学分型方法由于 HLA 抗原的高度同源性 ,而出现较多的交叉反应 ,造成许多交叉反应组 (CREG) 内的抗原分辨困难 ,如 A19 组的 A30和 A31 ,B15 组的 B62 和 B75 ,B40 组的 B60 和 B61及 B22 组的 B54 ,B55 和 B56。鉴于血清学分型技术的局限性 ,因此寻找更加精确可靠 ,快速简捷 ,分辨率强的 HLA 分型方法 ,是移植免疫学和免疫遗传学的重要课题。目前 ,国际 上倾向用 DNA 分型方法取代传统血清学分
14、型 , 如 PCR2SSP 5 , PCR2SSOP 6 ,PCR2SB T 7 及 PCR2RFL P 8 等方法。本研究采用反向 PCR2SSOP 技术用于 HLA 分型 ,具有耗时短 ,从 DNA 抽提至分型结束只需 4 小时 ,而且操作简单 ,A ,B 和 DR 位点实验条件统一 ,同参数扩增 ,同温度杂交、洗膜和分辨率高等优点。从表 1 和 2 可见 ,16 份质控细胞反向 PCR2SSP的分型结果与 UCLA 公布的分型结果完全相符 ,说明反向 PCR2SSOP 技术 ,从方法学上讲是稳定的 ,结果是可靠的。由于 UCLA公布结果全部是采用063 中国实验血液学杂志 J Ex p
15、Hem atol 2001 ; 9 (4) 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.Table 3 Comparison of HLA2AB genotyping results using reverse PCR2SSOP with those using serology phenotypingSample No. Serology results Reverse PCR2SSOP results A B A 3 B 300087 ND ND 02xx ,11xx 1301 ,370100
16、088 ND ND 02xx , - 15xx ,580100089 ND ND 02xx ,24xx 1502 ,460100090 ND ND 11xx ,3301P03 4001P14 ,580100149 11 ,33 58 ,8101P2708 11xx ,3301P03 07xx ,5801P73 10 ,31 13 ,62 2601P02 ,3001 13xx ,15xx2222 2 ,11 55 ,57 02xx ,11xx 1501P12P19P33P34 ,58012237 3 11 , 8 ,54 11xx ,2402101P09NP17P05 0801 ,5401226
17、9 2 ,23 46 ,52 02xx ,3201 4601 ,52012274 3 2 ,24 61 , 02xx ,24xx 4002 ,46012298 2 ,30 7 ,59 02xx ,31012 0702 ,59012319 2 ,11 55 ,62 02xx ,11xx 1502 ,56012323 2 ,11 58 ,62 0203 ,11xx 1502 ,58012330 1 ,30 55 ,61 0101 ,31012 4002 ,5501P02P05D377 2 ,24 47 ,51 02xx ,24xx 3701 ,5101P03P09G535 3 ,24 48 ,81
18、01 03xx ,24xx 2711 ,4801D771 2 ,6602 44 ,75 02xx ,3401 1502 ,44xxG295 2 ,6601 59 ,70 02xx ,3401 5001 ,5901E605 11 ,26 35 ,78 11xx ,26xx 35xx , -Note : the bold2italics are misdetermining antigens by serological typing ; the corresponding serological specificity of B 3 1502 shouldbe B75 in samples 23
19、19 and 2323. ND : not detectedDNA 测序方法 ,每一个等位基因均能很清楚的分辨。用反向 PCR2SSOP 方法分型 ,由于个别等位基因扩增的 HLA2A ,B exon 2 和 3 可变区差异不大 ,从而无法分辨具体是哪一个等位基因 ,只能分辨出相应于血清学某一特异性的一组等位基因 ,如 1032和 1033 的 A 3 02 , 1039 和 1040 的 A 3 03 , 1034 的B 3 35 ,1037 的 B 3 51 等。这一问题的解决只能依赖于高分辨率的 PCR2SSP (序列特异引物 ) ,或 PCR2SB T(DNA 测序 )等方法。本研究所
20、检测的 60 例配型和脐血样本中 ,除了表 3 所列之外 ,其余血清学和 DNA 分型基本一致。本室目前常规采用的单克隆血清进行 HLA2AB 分型 ,较之自制血清盘错检率已大幅度下降 3 ,但错检率仍然存在 ,如 A 位点为 6. 4 % ,B 位点为 7. 4 % ,因此基因水平的分型有助于降低抗原漏检率和空白检出率 2 。另外 ,00087 ,00088 ,00089 和 00090 样本由于血样保存的问题 ,无法由血清学分型得到结果 ,说明 DNA 分型所需检测样本不受病人的疾病状态及保存时间的影响表 3 中 2237 和 2274 标本是血液病患者 ,家系分析可能漏检 HLA 抗原
21、,通过反向 PCR2SSOP 检测 2237 A 3 24xx 被血清学漏检 ,2274 B 3 4601 被血清学漏检。究其原因 ,可能是白血病患者 HLA 抗原表达较弱 ,以致血清学方法不能检出 ,抑或是这些抗原在表达时受到抑制 ,根本未有表达。这一现象应引起血液病和移植免疫工作者重视 ,在考虑造血干细胞移植配型策略以及移植免疫反应时 ,对这些血清学不能检出抗原的影响不能忽视 ,值得深入探讨。综上所述 ,反向 PCR2SSOP 用于 HLA 基因分型是可靠的 ,充分体现反向 PCR2SSOP 方法快速、敏感、准确的特点。该方法的建立 ,为 HLA 基因分型提供了一个极有价值的实验工具 ,值
22、得在广大配型工作者中推广使用 ,尤其是在造血干细胞库的建163反向 PCR2SS O P 技术行 HL A2AB 分型与临床应用 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.立中 ,有利于 HLA 分型结果的标准化。参 考 文 献1 Cho YW , Cecka J M , Terasaki PI. HLA matching effect :better survival rates and graft quality. Clin Transpl , 1994 ;435 - 4492 Bunce
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27、 , et al . HLA2B 3 27 typing byPCR2restriction fragment length polymorphism. TissueAntigens , 1997 ; 49 :283 - 286Typing of HLA2AB by Reverse PCR2SSOP and Clinical ApplicationFEN G Ming2Liang J I Yun MA J un L U Qiong J I Yue2HuaZHAN G Gong2Liang YAN G Ying( Depart ment of Im m unogenetics , S hangh
28、ai Blood Center S hanghai 200051)AbstractA rapid and accurate method of DNA typing for HLA was established to compensate the unsatisfactoryserological typing for HLA before transplantation. DNA typing for HLA using by reverse polymerase chainreaction with sequence2spcific oligo probe ( reverse PCR2S
29、SOP) could detect HLA2A ( 3 0101 - 8001 ) andB ( 3 07021 - 8201) . The results showed that HLA2AB alleles were successfully analysed in 60 matching subjectsand 16 control DNAs from UCLA by reverse PCR2SSOP without false negtive and false positive results. Theresults were concordance with those of UC
30、LA. The error rate of serological typing was 6. 4 % for HLA2A and7. 4 % for HLA2B. The serological typing missed HLA2A24 and HLA2B46 for two patients with leukemiarespectively. Our results suggest that DNA typing for HLA by reverse PCR2SSOP has proved to be a high2resolution , high2specificity , rapid and accurate technique , suitable for clinical application with a greater precisionthan serological typing.Key words reverse PCR2SSOP HLA2AB typing matching263 中国实验血液学杂志 J Ex p Hem atol 2001 ; 9 (4) 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
