1、人二胺氧化酶（DAO）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中二胺氧化酶（DAO）含量。概述二胺氧化酶（DAO）是一种催化二胺（组胺、腐胺和尸胺）氧化的酶，存在于哺乳类动物的黏膜或绒毛上层，其中大部分存在于小肠黏膜绒毛，极少部分存在于子宫内膜绒毛中。它可将腐胺氧化成氨基丁醛，并进一步环化成砒咯啉，是具有高度活性的细胞内酶，其活性与绒毛高度和黏膜细胞内的核酸和蛋白质合成密切相关，是反映小肠黏膜结构与功能的理想指标。DAO在分裂细胞中高度表达，并已观察到与一些人类肿瘤有关。CHASSANDE报道人DAO氨基酸序列由751氨基酸残基组成
2、，分别由其基因序列的五个外显子编码，第一外显子很短，不编码序列，其余四个外显子分别编码氨基酸序列1-523，524-618，619-663和664-751。通过与已知序列比较，揭示其活性位点由第二外显子编码，而其氨基吡咪结合位点在蛋白质的C-末端。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中DAO水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入DAO抗原、生物素化的抗人DAO抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的DAO呈正相关。用酶标仪在450nm波长下
3、测定吸光度（OD值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10U/m l，做系列倍比稀释后，分别稀释10U/m l，5U/m l，2.5U/m l，1.25U/m l，0.625U/m l，0.312U/m l，0.156U/m l，样品稀释液直接作为标准浓度0U/m l，临用前15分钟内配制。如配制5U/m l标准品：取0.5ml 10U/m l的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。2.样品稀释
4、液：120ml/瓶。3.检测稀释液A：110ml/瓶。4.检测稀释液B：110ml/瓶。5.检测溶液A：1120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。6.检测溶液B：1120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。7.底物溶液：110ml/瓶。8.浓洗涤液：130ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。9.终止液：110ml/瓶（2NH2SO4）。标本
5、的采集及保存1.细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20，且应避免反复冻融。2.血清：标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。3.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范
6、围。1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37,60分钟。3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。4.每孔加检测溶液B工作液（同检
7、测A工作液）100ul，37，60分钟。5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。6.依序每孔加底物溶液90ul，37避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。注：1.每次实验留一孔作为空白调零孔，
8、该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。2.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。3.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。4.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。自动洗板：
9、如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。特异性本试剂盒可同时检测重组或天然的人DAO，且与其它相关蛋白无交叉反应。计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项1.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。2.一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。3.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。4.如标本中待
10、测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。5.在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。6.底物请避光保存。检测范围：0.156U/m l -10U/m l说明1.在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。2.小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本/标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。3.试剂盒保存：部分试剂保存于-20，部分试剂保存于2-8，具体以标签上的标示为准。4.浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。5.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。6.中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。7.所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。8.有效期：6个月
