1、 论 著 文 章 编 号 : 1007 - 8738 (2005) 04 - 0456 - 03DnaJ类 分 子 伴 侣 PBP基 因 的 原 核 表 达 及 兔 抗 PBP抗 体 的 制 备刘 成 刚 , 朱 美 财 , 李 文 , 石 樱 , 占 志 , 王 荫 静 , 向 培 德 (空 军 总 医 院 临 床 分 子 生 物 学 中 心 , 北 京 100036)收 稿 日 期 : 2004 - 07 - 30; 修 回 日 期 : 2004 - 09 - 06基 金 项 目 : 解 放 军 总 后 勤 部 医 药 卫 生 基 金 资 助 项 目 (No. 01MA060)作 者 简
2、介 : 刘 成 刚 (1971 - ) , 女 (满 族 ) , 河 北 围 场 人 , 主 管 技 师 , 学 士 .Tel: (010) 66928266; Email: L iucg4336 sina. comProkaryotic expression of DnaJ2hom ol2ogous chaperon PBP and prepara tion ofrabb it an tibody aga in st PBPL IU Cheng2gang, ZHU M ei2cai, L I W en, SH I Ying,ZHAN Zh i, WAN G Yin2jing, X IANG
3、Pei2deCenter of Clinical Molecular B iology, General Hosp ital of A irForce, Beijing 100036, China Abstract A IM : To exp re ss D naJ 2hom o lo go u s chap e r2o n p e rip he rin2b ind ing p ro te in ( PB P ) gene in E. co li a nd p re2p a re the ra bb it an tibo dy aga in st PB P. M ETHOD S: ThePB
4、P cDNA w a s am p lified from the hum a n fe ta l b ra in tissueby R T2PCR. Afte r co nfirm ed by DNA se quenc ing, the PB P 2cDNA w a s c lo ne d in to exp re ssio n ve c to r p ET28a and thenthe PB P gene w a s e xp re ssed in E. co li unde r the IPTG in2duc tio n. The e xp re ssed p ro te in w a
5、s p u rifie d th ro ugh N i2N TAa ffin ity ch rom a to g rap hy co lum n. The ra bb it a n tibo dy a ga in stPB P w a s p rep a re d by imm un iz ing two N ew Ze a land w h itera bb its u sing the p u rified PB P a s imm uno gen, The tite r a ndsp e c ific ity o f the an tise ra w e re de te rm ine
6、d by W e ste rn b lo t.RESUL TS: The 720 bp PB P ge ne w a s am p lified, c lo ne d,a nd exp re ssed in E. co li. The exp re ssed p ro duc t e xiste d inthe ba c te ria l inc lu sio n bo dy and the sup e rna tan t o f the bac2te ria lysa te. The p u rifie d PB P rea che d e lec trop ho re tic p u ri
7、2ty. The ra bb it an tibo dy aga in st PB P w a s p rep a red a nd its ti2te r w a s a bo u t 1 1 600. W e ste rn b lo t ana lysis show ed tha tthe an tibo dy co u ld b ind to the e xp re ssed PB P p ro te in sp ec if2ica lly. CO NCL US IO N: The PB P p ro te in w a s e xp re sse d inE. co li and ra
8、 bb it a n tibo dy a ga in st PB P w a s p rep a re d suc2ce ssfu lly, w h ich la ys the fo unda tio n fo r fu rthe r study o n thestruc tu re and b io lo g ica l func tio n o f PB P. Keywords PB P; hea t2sho ck p ro te in; gene e xp re ssio n;po lyc lo na l a n tibo dy; ra bb it摘 要 目 的 : 在 原 核 系 统
9、中 表 达 DnaJ类 分 子 伴 侣 感 光 受体 外 周 蛋 白 结 合 蛋 白 ( PBP)基 因 , 并 制 备 兔 抗 PBP的 抗 体 鉴定 其 特 性 。 方 法 : 应 用 RT2PCR从 人 胎 脑 组 织 总 RNA中 扩 增PBP cDNA。 测 序 后 将 其 克 隆 到 表 达 载 体 pET228a中 , 并 在 大肠 杆 菌 中 以 IPTG诱 导 表 达 。 表 达 产 物 经 N i2NTA亲 和 层 析 柱纯 化 后 , 用 SDS2PAGE进 行 鉴 定 。 以 所 获 纯 化 的 PBP免 疫 新西 兰 白 兔 , 制 备 兔 抗 PBP抗 体 。 抗
10、体 的 效 价 及 特 异 性 用W estern blot进 行 测 定 和 分 析 。 结 果 : 扩 增 和 克 隆 出 了 720 bp的 PBP基 因 。 构 建 的 重 组 质 粒 pET28a2PBP在 大 肠 杆 菌 中 得到 高 表 达 , 诱 导 表 达 的 蛋 白 存 在 于 包 涵 体 和 细 菌 裂 解 上 清 中 ,纯 化 的 PBP经 SDS2PAGE鉴 定 呈 单 一 条 带 。 以 纯 化 的 PBP免疫 兔 , 制 备 了 兔 抗 PBP抗 体 。 W estern blot鉴 定 证 实 , 该 抗 体可 与 原 核 表 达 的 PBP特 异 性 结 合
11、, 抗 体 效 价 为 1 1 600。结 论 : 在 原 核 细 胞 中 表 达 了 具 有 生 物 学 活 性 的 PBP, 并 以 其为 免 疫 原 制 备 了 兔 抗 PBP的 抗 体 , 为 进 一 步 研 究 PBP的 结 构与 生 物 学 活 性 奠 定 了 基 础 。关 键 词 PBP; 热 休 克 蛋 白 ; 基 因 表 达 ; 多 克 隆 抗 体 ; 兔中 图 分 类 号 R392. 11 文 献 标 识 码 B分 子 伴 侣 的 研 究 是 近 年 生 物 学 领 域 的 重 要 内 容之 一 。 分 子 伴 侣 广 泛 分 布 于 原 核 与 真 核 生 物 中 , 在
12、应 激 与 非 应 激 状 态 下 对 维 持 细 胞 的 稳 定 均 发 挥 着 重要 作 用 , 如 参 与 细 胞 内 新 生 蛋 白 分 子 的 正 确 折 叠 、 装配 及 跨 膜 转 运 , 变 性 蛋 白 的 复 性 与 清 除 等 , 与 基 因 突变 所 致 蛋 白 结 构 的 变 异 最 终 导 致 病 理 改 变 有 关 1, 2 。感 光 受 体 的 外 周 蛋 白 结 合 蛋 白 ( peripherin2bindingp rotein, PBP)是 新 发 现 的 DnaJ类 分 子 伴 侣 3 , 它 能与 感 光 受 体 外 周 蛋 白 第 2结 构 区 域 特
13、 异 结 合 , 而 该区 域 基 因 的 突 变 是 引 起 家 族 性 视 网 膜 变 性 并 最 终 导致 失 明 的 重 要 原 因 , 因 此 , 深 入 探 讨 PBP的 结 构 与功 能 有 助 于 阐 明 其 生 理 作 用 , 对 弄 清 视 网 膜 变 性 的分 子 机 制 及 提 供 治 疗 方 法 具 有 重 要 意 义 。 本 研 究 中我 们 用 PCR法 克 隆 并 在 原 核 系 统 中 表 达 PBP基 因 ,建 立 了 表 达 蛋 白 的 纯 化 方 法 , 获 得 具 有 生 物 学 活 性的 PBP蛋 白 , 并 以 该 蛋 白 为 抗 原 免 疫 新
14、西 兰 白 兔 ,制 备 了 抗 PBP抗 体 , 为 进 一 步 研 究 PBP的 结 构 与 生物 学 功 能 提 供 了 重 要 的 实 验 手 段 。1 材 料 和 方 法1. 1 材 料 表 达 载 体 pET228a和 E. coli BL21 (DE3)为 Novagen公 司 产 品 。 PCR引 物 由 军 事 医 学 科 学 院合 成 。 Trizol试 剂 、 RT2PCR试 剂 盒 及 T4 DNA连 接 酶654 ISSN1007 - 8738细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 (Chin J CellMol Immunol) 2005, 21 (4)为 Gibc
15、o公 司 产 品 。 N co I、 B am H I DNA限 制 性 内 切酶 为 B iolabs公 司 产 品 ; 小 提 质 粒 试 剂 盒 为 Promega公 司 产 品 。 碱 性 磷 酸 酶 标 记 的 羊 抗 兔 IgG购 自 北 京中 山 生 物 试 剂 公 司 。 N i2NTA亲 和 层 析 柱 购 自 Nova2gen公 司 。 人 胚 胎 脑 组 织 由 本 医 院 李 文 提 供 。1. 2 方 法1. 2. 1 PBP基 因 的 RT2PCR扩 增 人 胎 脑 组 织 中 总RNA的 提 取 及 反 转 录 均 按 Gibco试 剂 盒 中 的 说 明 书操
16、作 , 反 转 录 引 物 为 试 剂 盒 中 提 供 的 O ligo dT。 反 转录 合 成 第 1链 后 , 取 2 L cDNA产 物 作 为 模 板 , 加 入PCR引 物 进 行 扩 增 。 引 物 Pa: 5 2CAT GCC ATG GTGGAT TAC TAT GAA GTTC23 , Pb: 5 2CGG GAT CCCTTG TTA TCC AAG CGC AGC AG23。 在 引 物 Pa的5端 添 加 了 内 切 酶 N co I的 识 别 位 点 , 在 引 物 Pb的3端 添 加 了 B am H I识 别 序 列 。 PCR的 反 应 条 件 为 :于 94
17、 变 性 5 m in, 54 退 火 30 s, 72 延 伸 1 m in,再 于 94 变 性 30 s, 共 35次 循 环 后 , 于 54 退 火30 s, 72 延 伸 5 m in。 然 后 取 5 L进 行 琼 脂 糖 凝 胶电 泳 鉴 定 。1. 2. 2 表 达 载 体 的 构 建 及 鉴 定 扩 增 的 PCR产 物进 行 酚 抽 提 , 将 其 与 pET28a 载 体 分 别 用 N co I、B am H I双 酶 切 , 进 行 低 熔 点 电 泳 , 回 收 片 段 进 行 酚抽 提 。 DNA 的 酶 切 、 连 接 、 转 化 均 参 照 Sambrook
18、等 4 报 道 的 方 法 进 行 。 转 化 的 受 体 菌 为 E. coliB l21De3。 对 转 化 菌 长 出 的 菌 落 进 行 小 提 质 粒 , 用 限制 性 内 切 酶 进 行 初 步 鉴 定 , 送 北 京 赛 百 盛 公 司 测 序 。1. 2. 3 PBP的 表 达 及 鉴 定 挑 取 单 个 阳 性 菌 落 接 种于 含 卡 那 霉 素 (10 g/L)的 2 YT培 养 基 中 , 于 37振 摇 过 夜 。 次 日 , 按 1%的 比 例 扩 大 摇 菌 至 吸 光 度(A ) 600达 0. 4 0. 6时 , 加 IPTG(1 mmol/L )诱 导 培
19、养4 h。 收 集 菌 体 沉 淀 悬 浮 于 裂 解 缓 冲 液 , 内 含 蛋 白酶 抑 制 剂 PMSF 1 200 (V V)、 胃 蛋 白 酶 A 20 mg/L、亮 抑 蛋 白 酶 肽 20 mg/L 及 抗 蛋 白 酶 1 100 (V V ) 中 , 置 冰 浴 中 超 声 破 菌 。 离 心 、 取 上 清 及 沉 淀 进 行SDS2PAGE鉴 定 。 并 用 薄 层 色 谱 扫 描 仪 检 测 目 的 蛋白 占 菌 体 蛋 白 的 百 分 率 。1. 2. 4 表 达 产 物 的 纯 化 及 分 析 取 破 菌 后 离 心 的 上清 加 于 N i2NTA亲 和 层 析 柱
20、 中 , 用 裂 解 缓 冲 液 洗 脱 10倍 柱 体 积 , 以 裂 解 缓 冲 液 + 20 mol/L咪 唑 冼 脱 3倍柱 体 积 去 除 杂 蛋 白 , 再 将 咪 唑 的 浓 度 升 至 400 mol/L洗 脱 目 的 蛋 白 。 以 SDS2PAGE鉴 定 纯 化 蛋 白 的 纯 度及 相 对 分 子 质 量 (M r )。1. 2. 5 兔 抗 PBP抗 体 的 制 备 将 以 上 获 得 的 PBP蛋 白 , 经 背 部 皮 内 多 点 注 射 于 成 年 雄 性 新 西 兰 白 兔 2只 , 1 mg/只 。 2 wk后 , 以 相 同 的 方 法 进 行 第 2次 免
21、疫 (抗 原 剂 量 减 半 ) , 之 后 每 隔 1 wk加 强 免 疫 1次 ,第 4次 加 强 免 疫 后 , 抽 耳 血 1 mL, 将 分 离 后 的 血 清作 1 100、 1 200、 1 400、 1 800、 1 1 600倍 比 稀 释 ,用 W estern blot测 定 抗 体 效 价 。 于 最 后 1次 免 疫 后 的8 d, 经 腹 主 动 脉 放 血 、 分 离 血 清 , 用 50%饱 和 度 硫酸 铵 盐 析 初 步 纯 化 , 透 析 后 , 再 通 过 PBP2Sepharose24B交 联 柱 纯 化 , 用 pH 2. 3, 50 mmol/L甘
22、 氨 酸 2HCl洗 脱 2倍 柱 体 积 , 收 集 洗 脱 峰 , 测 定 蛋 白 含 量 。1. 2. 6 抗 PBP抗 体 的 特 性 鉴 定 采 用 W estern blot。纯 化 的 抗 体 蛋 白 经 SDS2PAGE后 , 转 移 至 硝 酸 纤 维素 膜 上 , 依 次 加 入 1 200 (0. 96 g/L )纯 化 的 抗 体 (孵育 60 m in)及 1 2 500碱 性 磷 酸 酶 标 记 的 羊 抗 兔 IgG(孵 育 30 m in) , 以 硝 基 兰 四 唑 氮 (NBT)、 52溴 242氯 232吲 哚 2磷 酸 盐 (BC IP)显 色 。2 结
23、 果2. 1 人 PBP cD NA的 扩 增 及 克 隆 鉴 定 PBP基 因 的RT2PCR产 物 经 10 g/L琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 , 显 示 出 1条 720 bp 的 带 , 同 预 期 的 结 果 相 一 致 。 重 组 质 粒pET28a2PBP经 N co I和 B am H I双 酶 切 后 , 可 得 到 1条 720 bp的 带 和 1条 pET28a空 载 体 的 带 (图 1)。 测序 结 果 与 文 献 3 的 报 道 相 一 致 。图 1 PBP基 因 PCR产 物 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析Fig 1 Analysis of PCR p
24、 roduct of PBP gene by agarose gel elec2trophoresis1: DNA marker; 2: PCR p roduct of PBP gene.2. 2 重 组 质 粒 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 的 鉴 定 SDS2PAGE显 示 , 工 程 菌 株 经 IPTG诱 导 4 h后 , 在 M r 约为 30 103 处 可 见 1条 明 显 的 蛋 白 带 , 同 预 期 的 M r相 接 近 , 未 诱 导 的 工 程 菌 中 则 未 见 此 带 。 以 超 声 破菌 后 , 经 薄 层 色 谱 扫 描 分 析 显 示 , 在 上 清 和 包
25、 涵 体 沉淀 中 均 有 PBP的 表 达 , 表 达 量 分 别 占 菌 体 蛋 白 的38%和 45%。 表 达 的 PBP经 N i2NTA亲 和 层 析 柱 纯化 后 , 以 SDS2PAGE鉴 定 达 到 电 泳 纯 (图 2)。754ISSN1007 - 8738细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 (Chin J CellMol Immunol) 2005, 21 (4)图 2 纯 化 PBP的 SDS2PAGE分 析Fig 2 Analysis of purified PBP by SDS2PAGE1: Protein marker; 2: Engineering bact
26、eria without induction; 3: Engi2neering bacteria with IPTG induction; 4: Supernatant of bacteria lysate; 5:Inclusion body p recip itation ; 6: Purified PBP p rotein.2. 3 兔 抗 PBP抗 体 的 制 备 及 鉴 定 (1) 抗 体 效 价 :新 西 兰 兔 经 4次 免 疫 后 , 以 W estern blot测 定 兔 抗PBP抗 体 的 效 价 达 1 1 600时 , 仍 具 有 抗 体 活 性 。(2)特 异 性 :
27、 用 纯 化 的 兔 抗 PBP抗 体 对 原 核 表 达 的 目的 蛋 白 做 W estern blot分 析 表 明 , 在 M r 约 为 30 000处 出 现 1条 特 异 性 的 结 合 带 (图 3) , 表 明 所 制 备 的 抗体 具 有 较 好 的 抗 体 活 性 。图 3 兔 抗 PBP抗 体 特 异 性 的 W estern blot分 析Fig 3 Analysis of specificity of rabbit antibody against PBP byW estern blot1: Targer p rotein; 2: Protein marker.3
28、讨 论PBP是 用 酵 母 蛋 白 结 合 系 统 从 牛 视 网 膜 cDNA文 库 中 筛 选 到 的 能 与 感 光 受 体 外 周 蛋 白 结 合 的 蛋 白 ,该 蛋 白 有 241个 氨 基 酸 , M r 约 为 26 900, 等 电 点 为7. 4。 N端 1 - 74氨 基 酸 为 J区 , 氨 基 酸 序 列 比 较 显示 , PBP与 DnaJ类 分 子 伴 侣 有 很 高 的 同 源 性 , 在 对PBP的 研 究 中 发 现 该 蛋 白 不 仅 在 体 外 具 有 催 化 ATP酶 的 活 性 , 而 且 具 有 协 助 H sp70完 成 对 变 性 虫 荧 光素
29、 酶 复 性 的 功 能 6 ; 此 外 , 对 PBP基 因 不 同 片 段 在哺 乳 动 物 细 胞 中 表 达 的 研 究 中 显 示 , PBP在 非 应 激状 态 下 维 持 细 胞 的 正 常 生 理 功 能 发 挥 着 作 用 , 为 了进 一 步 研 究 PBP的 结 构 与 功 能 , 我 们 根 据 Northernblot分 析 的 显 示 3 , PBP基 因 广 泛 分 布 于 脑 等 神 经 组织 、 视 网 膜 感 光 受 体 及 其 上 皮 细 胞 等 的 特 点 设 计 了一 对 引 物 , 用 RT2PCR从 人 胚 胎 脑 组 织 中 扩 增 了 PBP基
30、 因 , 测 序 结 果 证 明 与 文 献 3 报 道 的 PBP全 长 基 因相 符 。 利 用 大 肠 杆 菌 高 密 度 生 长 的 优 势 和 易 于 表 达蛋 白 、 纯 化 简 单 等 特 点 , 将 该 基 因 克 隆 到 表 达 载 体pET228a中 , 并 在 大 肠 杆 菌 BL21 (DE3 )中 表 达 了PBP基 因 。 表 达 的 蛋 白 用 N i2NTA 亲 和 层 析 柱 纯 化后 , 将 其 作 为 制 备 兔 抗 PBP抗 体 的 免 疫 原 。本 实 验 中 所 以 选 择 pET作 为 表 达 载 体 , 因 其 具有 一 段 组 氨 酸 序 列
31、, 表 达 后 的 目 的 蛋 白 含 有 一 段 组氨 酸 , 可 以 和 N i2NTA亲 和 层 析 柱 上 的 镊 离 子 结 合 ,用 低 浓 度 的 咪 唑 轻 松 即 可 将 其 洗 脱 下 来 , 不 会 损 失其 生 物 学 活 性 , 且 一 次 纯 化 即 可 达 到 很 高 的 纯 度 。在 大 肠 杆 菌 中 表 达 的 PBP主 要 存 在 于 包 涵 体 中 , 但细 菌 裂 解 上 清 中 也 有 少 量 可 溶 性 的 PBP。 选 择 裂 菌上 清 进 行 纯 化 可 省 去 对 包 涵 体 变 性 、 复 性 的 过 程 , 简化 了 操 作 步 骤 ,
32、且 由 上 清 纯 化 的 PBP已 足 以 满 足 实验 的 需 要 。 另 外 , 我 们 在 PBP纯 化 的 实 验 中 发 现 ,咪 唑 对 蛋 白 质 具 有 一 定 的 变 性 作 用 , 如 不 及 时 除 去会 使 收 获 的 蛋 白 发 生 沉 淀 影 响 产 率 。我 们 以 纯 化 的 PBP作 为 免 疫 原 免 疫 家 兔 , 制 备了 兔 抗 人 PBP抗 体 , 并 用 自 制 的 PBP2Sephatose24B亲 和 层 析 柱 纯 化 了 抗 血 清 。 虽 然 抗 体 的 活 性 略 有 损失 , 但 经 W estern blot证 实 抗 体 的 特
33、 异 性 很 强 , 可 用于 进 一 步 的 研 究 和 应 用 。参 考 文 献 : 1 Ellis RJ. Molecular chaperones J . Annu Rev B iochem , 1991, 60:321 - 347. 2 Hartl FU. Molecular chaperones in cellular p rotein folding J . N a2ture, 1996, 381 (13) : 571 - 580. 3 Chuang JZ, Zhou H, Zhu MC, et al. Characterization of a brain2en2riched
34、chaperone, MRJ, That inhibits huntingtin aggregation and toxici2ty independently J . J B iol Chem , 2002, 277 (22) : 19831 - 19838. 4 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloningM . ColdSp ring Harbor Laboratory Press, 1989: 26 - 28. 5 Prip2Buus C, W eatermann B, Schm ittM, et al. Role of t
35、he m itochon2drial DnaJ homologue, Mdj1p, in the p revention of heat2induced p ro2tein aggregation J . Febs Letters, 1996: 142 - 146. 6 刘 成 刚 , 朱 美 财 , 占 志 , 等 . 感 光 受 体 外 周 蛋 白 结 合 蛋 白 对 虫荧 光 素 酶 体 外 折 叠 的 促 进 作 用 J . 基 础 医 学 与 临 床 , 2002, 22(6) : 570 - 574. 7 刘 缨 , 朱 美 财 , 王 荫 静 , 等 . DnaJ类 分 子 伴 侣 PBP的 基 因 克 隆及 亚 细 胞 定 位 研 究 J . 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 , 2003, 19 ( 6) :531 - 534.854 ISSN1007 - 8738细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 (Chin J CellMol Immunol) 2005, 21 (4)
