1、丁酸钠上调急性白血病细胞共刺激分子表达及其分子机制研究26 卷第 5 期 ChinJHematol,May2005,l,Il_血丁酸钠上调急性白血病细胞共刺激分子表达及其分子机制研究李薇王育丽康丽花王冠军【摘要】目的观察丁酸钠(sB)对急性 h 血病细胞共刺激分子表达的影响 ,并探讨其分子机制,方法以流式细胞术检测 NB4,HL-60,Kasumil,U937 和 Jurkat 细胞经 sB 处理前,后 CD86,CD80 分子表达,同种混合淋巴细胞反应观察免疫调节功能,NFKB 试剂盒检测 SB 对核内NFKB 含量的影响 ,结果经 sB 处理后 ,各自血病细胞株细胞 CD86 和 CD80
2、 分子表达与对照组比较均J 现不同程度上调,其中 0.5mmol/LSB 处理的 NB4 细胞组较李向对照组 CD86 阳性细胞率增高36.8 倍,NFKB 含量增加与 CD86 分子上调相一致,混合淋巴细胞反应显示 SB 处理的细胞可明显刺激异基因淋巴细胞增殖结论 sB 可上调急性白血病细胞共刺激分子 CD86 和 CD80,NFKB 为其参与上调 CD86 分子的重要的转录因子【关键词】羟丁酸钠;抗原,CD86;抗原,CDSO;NFKBUP-regulationofcostimulatorymoleculesbysodiumbutvrateinacuteleukemiacellsandit
3、smolecularmechanismL/Wei,WANGYuli,KAN(;LihuaWANGGuan-junDepartmentofHematology/Oncolog).thefirstHospitalofJilinUniversityi3o021.China【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectofsodiumbutyrate(sB)(m 【heexpressionofenstimulatorymoleculesinacuteleukemiacellsall(1itsmechanism.MethodsTheexpressionofCD86andCD8
4、0wasexaminedonthesurfacesofN134,HL_60,Kasumi1.U937andJurkatcellsI)vflowcytometricanalysisaftertreatedbySBornot.AllogeneicmixedlymphocytereactionwasusedtoevaluatetheimmunomodulatorveffectsofcellstreatedbySB.AetivatedNFKBwaslneasuredwithanNFKBassaykit.ResultsUpregulationofCD86andCD80atvariouslevelswas
5、ot)serve(1ontheseleukemiacellstreatedbvSB.Therati()ofCD86eXpressingcellinN134cellstreatedby0.5mmo1/LSBwas36.8timeshigherthanthatincontro1.Up-regulationofNFKBwassimilartothatofCD86.AllogeneiclymphocyteproliferationwasstronglystimulatedbytheSBtreatedcells.ConclusionSBcanimprovetheexpressionofCD86inacu
6、teleukemiacells.NFKBwasanimportanttranscriptionfactorinvolvedintheupregulationofCD86.【KeywordslSodiumbutyrate;Antigen,cD86;Antigen,CDSO;NFkappaB组蛋白的乙酰化和去乙酰化修饰与基因调控密切相关.丁酸钠(sB)为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抑制剂(HDACI), 具有拈抗 HDAC 活性,上调组蛋白乙酰化水平,增强某些基因转录活性,从而达到治疗肿瘤的目的.有关组蛋白乙酰化和去乙酰化对肿瘤细胞表达免疫相关分子的影响了解甚少.我们将 sB 作用于 5 种急性
7、白血病细胞株,观察共刺激分子 CD86,CD80 表达变化,并探讨CD86 分子的上调与 NFKB 信号传导途径的关系.材料和方法试剂 sB,M1Tr,脂多糖(LPS)和二硫代氨基甲基金项目:吉林省计委资助项目(20031268)作者单位:130021 长春,吉林大学第一医院血液肿瘤科?265?论着?酸吡咯烷(PDTC)购自 Sigma 公司,CD86 一 PE,CD80 一FITC 抗体及同型对照 IgG1 一 PE,IgMFITC 购自美国BD 公司,NF KB 试剂盒为 Chemicon 公司产品,胎牛血清购自杭州四季清公司,RPM11640 培养液为Gibco 公司产品 .2 细胞培养
8、 NB4,HL-60,Kasunfi 一 1,U937 和 Jurkat 细胞株为本研究室传代保存,悬浮培养于含10%的灭活胎牛血清的 RPMI1640 培养液(内含 2mmol/L 谷氨酰胺)中,于 37,5%CO,饱和湿度培养箱培养,48h 传代 1 次,取对数生长期细胞用于实验3CD86,CD80 表达变化测定3.收集对数生长期细胞,调整细胞密度为 I10./ml,分别加入 0.5mmoL/L,1.0mmol/LSB 处理48h;对照组加入等体积的 RPMI1640 培养液,收集:2005 年 5 月第 26 卷第 5 期 c1inHl,细胞,用冰冷的 PBS 洗 2 次 ,加入 PE
9、标记的 CD86抗体和 FITC 标记的 CD80 抗体,4作用 30S,PBS洗 2 次,流式细胞仪检测,ELITE 软件分析.选取上调 CD86 最佳的浓度组细胞进行实验.3.21ixmol/LPDTC 预处理 NIM 细胞 1h,0.5mmol/LSB 处理 48h 后流式细胞术观察 CD86 分子表达改变,同时设 LPS(100ng/m1)作为阳性对照,方法同上.4 同种混合淋巴细胞反应取健康志愿者外周血,常规分离单个核细胞(PBMNC),培养 48h 后取悬浮细胞,调整细胞密度为 1X10/ml,接种于 96 孑 L平底培养板.0.5mmol/LSB 处理 NB4 细胞 48h,RP
10、MI1640 培养液洗 2 次,分别加 1X10/ml,1X10/ml 和 1X10/ml 细胞入 1X10/mlPBMNC,置于 37,5%CO,饱和湿度培养箱培养 3d,各孑 L 加入 M1rr 比色液 20l 后再培养 4h.各L/JN 二甲基亚砜 150ILl,轻微振荡 10min,酶标仪检测波长49Onto 的吸光度(A) 值.0.5mmol/LSB 处理 5 种细胞 48h,按 NF.KB 试剂盒说明进行下述操作 :提取核蛋白,PBS 调整蛋白终浓度为 2.55.0mg/ml,加核蛋白底物于寡核苷酸包被 96 孑 L 板,依次加入兔抗人 NFKBp65 抗体 ,HRPIgG 二抗,
11、底物TMB,显色 ,酶标仪检测波长 450IIlTI 的 A 值.5 统计学处理实验均重复 3 次以上,结果以孟s表示,两样本均数用 t 检验进行比较,P0.05 表示有统计学意义.结果1SB 上调急性白血病细胞 CD86,CD80 分子表达NB4,HL-60,Kasumi 一 1,U937 和 Jurkat 细胞经 SB处理后 CD86 分子表达上调(图 1),其中 CD86 分子以 NB4 细胞 0.5mmol/LSB 组上调最为明显.SB 处理组比空白对照组 CD86 阳性细胞率增高 36.8 倍,平均荧光强度增高 1.5 倍,CD80 分子也少量增多.以 Jurkat 细胞阳性细胞率增
12、高最显着,为 5.6 倍,平均荧光强度增高 1.2 倍.2PDTC 对 SB 诱导 CD86 分子表达的抑制作用PDTC 预处理可明显减低 SB 对 CD86 分子的上调作用,阳性细胞率减少 31.59%(罔 2),与 NF.KB 非特异性刺激物 LPS 上调 CD86 分子表达相近,但后者平均荧光强度较低.3SB 处理的 NB4 细胞对异体淋巴细胞刺激作用经 0.5mmol/LSB 处理 48h 的 NB4 对异体淋巴细胞的增殖有明显的刺激作用,并与所加 NB4 细胞数呈正相关(图 3).a200籁 160120熏 80400bd籁霉熹200籁 160堇 120熹 80400籁霉最籁霉最20
13、016012080400荧光强度荧光强度黑色:空白对照组:绿色:0.5lxmol/Ll处理组;红:l0lxmol/LsB 处理组 .a:NB4 细胞;b:HL-60 细胞:U937 细胞 ;(1:Kasu-mi-l 细胞;e:Jurkat 细胞图 1 流式细胞仪检测 sB 处理前 ,后急 r自n【病细胞 CD86,CD80分子表达结果一番.0薹.u20Z0不同崩药组一空白对照团 SB团 SB+PDTC 口 LPS图 2PDTC 抑制 sB 上调 NB4 细胞 CD86 分子表达结果o 姗啪o 渤啪o 咖坳o咖差言啪o 啪啪o华血液学杂志 2005 午笙鲞笙!Y 竺l垂霉吾蓑图 3NB4 细胞经
14、 sB 处理后淋巴细胞增殖变化4SB 作用前,后细胞核内 NF-KB 含量改变 SB 处理细胞 48h,不同程度上调细胞核内 NFKBp65 亚基含量(图 4),NFKB 上调幅度与该细胞 CD86 分子上调幅度呈正相关.一望墓一缸Z0.40NB4HL 一 60U937Kasumi 一 1Jurkat细胞系图 4SB 作用前后急性自血病细胞 N 卜 KB 含量变化讨论组蛋白乙酰化和去乙酰化与多种恶性肿瘤发生,发展直接相关,其机制研究是目前药物干涉癌变细胞表型修饰现象的研究热点之一T 细胞介导特异性细胞免疫在肿瘤免疫中起重要作用.T 细胞的活化需要双信号,即由 MHC/抗原肽与 TCR 提供的第
15、一信号,还必须有 B7/CD28提供的第二信号,MHC,B7 分子在肿瘤细胞中表达往往减少甚至缺如,从而使肿瘤细胞发生免疫逃避.最近,日本和美国的两个实验室分别报道了在急性髓系白血病细胞和浆细胞瘤细胞中使用 HDACI可上调肿瘤细胞表面 MHCI,MHCII 类分子,CD40的表达.我们的研究表明,sB 可不同程度上调急性白血病细胞 CD86 和 CD80 分子表达,上调幅度具有明显的异质性,急性髓系白血病来源的 NB4,HL-60,Kasumi-1 和 U937 四种细胞 CD86 与空白对照组相比上调显着,具有统计学意义,但急性淋巴细胞白血病来源的 Jurkat 细胞 CD86 分子上调程
16、度低,与用药前相比无统计学意义.而 CDS0 分子仅在 NB4 和 Jurkat 细胞上出现有统计学意义的上调.上述结果与 Maeda 等报道 HDACI 可上调急性髓系白血病细胞系中共刺激分子 CD86 和 CD80 的水平,其中 CD86 上调水平最高的结果相一致.另外同种混合淋巴细胞反应表明,sB 预处理白血病细胞可刺激淋巴细胞增殖,上调的共刺激分子具有信号激活功能,如果进而培养形成肿瘤细胞源性的功能性抗原呈递细胞(APC),将可能应朋于过继免疫治疗,对 HDACI 应用于肿瘤治疗又添有力证据.IJi 等.报道 Th 细胞诱导 APC 中 CD86 基因转录是南转录因子 NF.KB 与
17、CD86 基因启动子结合后激活引起,说明正常 APC 分子上 CD86 分子表达是由转录因子 NFKB 介导的 ;我们检测了 NFKB 最主要的亚基 p65 在 sB 作用前后核内含量变化 ,发现其上调幅度与该细胞 CD86 分子上调幅度正相关,可见 SB 上调肿瘤细胞 CD86 分子表达也是依赖NF.KB 介导的 .Sheppard 等报道 NFKB 参与基因转录调节时,招募共激活因子 CBP,P/CAF 等,可见 NFKB 介导基因转录增强,蛋白表达增多,乙酰化活动参与其中.但应用 NF.KB 特异性抑制剂PDTC 预处理后再用 sB 处理 NB4,并不能使 CD86分子表达减低至空白对照
18、水平,相反 CD86 仍上调33.57%,说明参与 sB 上调 CD86 分子的不仅 NF.KB 这一条信号传导通路.Suzuki 等.报道 MAPK和 ERK.1/2 抑制剂不能阻断组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠诱导的 CD86 分子表达,可见 CD86 的表达信号通路中 MAPK 和 ERK-1/2 不占主导地位.细胞内分子信号转导机制复杂,常为多种信号协同作用,互相协调的结果,SB 上调 CD86 的分子机制还须进一步阐明.Zhao 等,3j 研究发现在 CD80 基因启动子上游大约 3kb 的增强子域有 NF.KB 的结合位点,可以解释本研究 CD80 分子轻度上调的结果.有关 HDAC
19、I 抗肿瘤机制的深入研究将使其有望成为一种新型抗肿瘤药物.参考文献l 汤屹,刘文励,周剑峰,等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗肿瘤的机制和临床应用研究进展.中华血液学杂,2002,6:329 331.2 刘鹏,I:一理,司履生,等.组蛋白乙酰化及与肿瘤的关系巾华病理孝杂志,2002,6:263.265.3KosugiH,TowatariM,HatanoS,eta1.Histonedea(etylaseinhibi.torsarethepotentinducer/enhancerofdifferentiationinaeutemyeloidleukemia:anewapproachtoanti-le
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