1、细胞生物学专业优秀论文 林麝 -干扰素基因的克隆及表达关键词：药用动物 林麝饲养 麝病防控 基因表达摘要：林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的
2、5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核
3、表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长 498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA序列高度相似。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白
4、质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大
5、肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。正文内容林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，
6、但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对
7、此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA 序列高度相似。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE
8、 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕
9、赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及
10、其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝
11、对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA 序列高度相似。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高
12、效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这
13、表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，
14、病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林
15、麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA 序列高度相似。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.coli BL21，在
16、IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导
17、表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式
18、，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此
19、，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA 序列高度相似。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.
20、coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了
21、约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年
22、四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等
23、多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA 序列高度相似。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX
24、4T-1 中，转化 E.coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导
25、 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、
26、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN-
27、已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA 序列高度相似。将林麝 IFN- 重组
28、到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，
29、在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，
30、圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人
31、和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA 序列高度相似
32、。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS
33、-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目
34、前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使
35、机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN-
36、 cDNA 序列高度相似。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些
37、酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝，并且也
38、取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T 细胞产生的能力；诱导巨噬
39、细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166 个氨基酸，与偶蹄目动物
40、赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA 序列高度相似。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、酵母菌落 PCR 鉴定，
41、得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。林麝是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料，也是我国和东亚地区传统的珍贵药材，因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失，林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史，在 1958 年就开始了人工圈养以
42、及保护野生的林麝，并且也取得了一定的成效，但是目前人工养麝的技术不完善，圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染，化脓性疾病一年四季都有发生，呈散发形式，表现慢性病程，发病多，病程长，治愈率低，虽不及其他传染病那样来势凶猛，但死亡率高，约为麝群总死亡数的 5070，在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN- 是免疫系统的重要调节因子，主要由 T 细胞和 NK 细胞产生，能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN- 可增加 T、B 淋巴细胞的激活和 IgG 的 Fc 受体表达；显著增强抗原呈递细胞表达 MHC 类抗原，增强抗原呈递细胞与 T 细胞的相互作用，进而增强 T 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒 T
43、细胞产生的能力；诱导巨噬细胞产生体液免疫应答，使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中，IFN- 已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此，为了应用 IF- 对林麝进行免疫治疗，提高林麝对外界环境的免疫水平，对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛 IFN- 基因的 cDNA 全序列为参考，设计两条克隆引物，从经 ConA 诱导的林麝外周血淋巴细胞(PBMC)总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 技术扩增出编码林麝 IFN- 的基因并将其克隆到 pMD18-T 载体上。经筛选、菌落 PCR 鉴定、测序、序列分析，证实为林麝 IFN- 基因编码序列，全长498bp，编码 166
44、 个氨基酸，与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的 IFN- cDNA 序列高度相似。将林麝 IFN- 重组到原核表达载体 pGEX4T-1 中，转化 E.coli BL21，在 IPTG 诱导下实现了高效表达，SDS-PAGE 分析得到约 43KDa 的蛋白质条带，与 GST 融合蛋白的预期分子量一致，表达量约占细菌总蛋白的 26.9。经 NaOH 法变性复性后，用 GSTrap 亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝 IFN- 基因与真核表达质粒 pPIC9K 连接，转化 E.coli JM109，通过菌落 PCR、测序筛选构建正确的重组质粒，经线性化后电转化毕赤酵母 GS115，再经 G418 抗性筛选、
45、酵母菌落 PCR 鉴定，得到多个重组酵母，对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析，在两株重组酵母经甲醇诱导 4d 的上清中检测到了约17.3KDa 的诱导表达带，但表达量极低，这表明林麝 IFN- 在毕赤酵母中的表达是低水平的，而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝 IFN- 的生物学活性及其临床应用奠定了基础，对林麝异地保护具有重要意义。特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供
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