1、玻璃化冷冻技术的应用及研究进展 徐利 葛凤菊 黄亚 上海永远幸妇科医院 摘 要： 玻璃化冷冻技术作为辅助生殖中的一项重要技术手段, 相比传统的程序冷冻法 具有诸多优势。 目前已在卵母细胞和各个胚胎期应用, 显示了较好的可行性与稳 定性。但是, 玻璃化冷冻效果仍会受到一些因素影响, 如样本自身质量、冻融方 法、冷冻保护剂和冷冻载体的选择等。再者, 玻璃化冷冻技术应用时间不长, 临 床结局以及新生儿出生状况跟踪相对匮乏, 还需长期安全性评价。 本文就玻璃化 冷冻技术的发展、应用、影响因素及安全性评价方面做一综述。 关键词： 辅助生殖技术; 玻璃化冷冻; 冷冻保护剂; 冷冻载体; 安全性评价; 作者
2、简介：黄亚, Email: 辅助生殖技术 (assisted reproductive technology, ART) 是指采用医疗辅助 手段使不育夫妇妊娠的技术, 其中配子 (精子和卵子) 和胚胎的冷冻保存及复 苏是一项重要的衍生技术。 当人体条件与移植周期不能完全匹配时, 需要选择将 配子或胚胎进行冷冻保存, 等到身体条件适宜时再复苏胚胎, 进行移植。 冷冻复 苏过程中, 配子或胚胎需要保持原有的发育潜能。 细胞中的生物活性物质多以水 溶液的状态存在, 而水又是诸多化学反应的参与者及催化剂。 冷冻形成的水结晶 对生物大分子产生一定的应力而改变其活性, 此外冷冻过程中的溶质效应会导 致细胞
3、膜的通透性发生改变, 造成细胞损伤甚至死亡。 因此在冷冻时最好去除细 胞内水分, 减少细胞损伤, 待复苏后再将水分重新浸回。 借鉴于细胞生物学领域的冻存方法, 早期研究者选择合适的冷冻保护剂, 慢速 降温, 快速复苏, 成功进行了胚胎细胞的冻存与复苏, 此法被称为程序化冷冻 1或平衡冷冻法。程序化冷冻较成熟稳定, 但操作时间长, 需高度精确的程序 化冷冻仪, 设备成本高, 万一发生故障则带来很大的医疗风险。1985 年Rall等 2使用另一种冷冻方法成功冷冻了小鼠的胚胎, 此法称为非平衡冷冻法, 即玻 璃化冷冻。 玻璃化是液态物质在较高的降温速率下, 由液相直接转变成为一种玻 璃化的固体状态的
4、过程。 相比程序化冷冻, 溶液实现玻璃化需更高的液体黏滞系 数, 高效的降温速率, 更小的液体总体积。 辅助生殖的应用中, 配子或胚胎首先 置于较低浓度冷冻保护剂的平衡溶液中平衡, 使渗透性冷冻保护剂能充分渗透 进入细胞内, 细胞逐步脱水。 然后再将胚胎置于较高浓度冷冻保护剂的玻璃化溶 液中, 以较短时间平衡后, 装入冷冻载体, 投入液氮。 冷冻保护剂的固化是通过黏度极度增加, 而非通过结晶, 形成无结构的玻璃化固体, 这种固态物质能保 持其溶液状态的分子和离子分布。 由于没有形成冰晶, 因此不会对细胞结构造成 过度损伤。1998年 Mukaida等3首次报道了玻璃化冷冻保存人类卵裂期胚胎获
5、得成功并分娩。 目前玻璃化冷冻已被诸多生殖中心所采纳, 本文就玻璃化冷冻的 应用、影响因素及安全性等方面做一综述。 1 玻璃化冷冻在各时期胚胎中的应用 1.1 卵母细胞冷冻 卵母细胞冷冻保存的临床应用范围不及胚胎广泛, 主要是因卵母细胞有其特殊 性。 相比分裂期胚胎细胞, 卵母细胞表面积与体积比小, 水分含量高, 细胞膜的 渗透性低。 在冷冻过程中, 渗透性保护剂和水分的出入交换速度较慢, 若脱水不 充分易形成胞内冰晶。 此外, 卵母细胞的一些特殊结构易受到冷冻的影响, 进而 影响卵母细胞的生理功能, 如皮质颗粒、纺锤体和细胞骨架。但是对患者卵母细 胞的冻存, 可保障后续周期失败时仍有弥补途径
6、, 或对特殊人群, 冻存卵母细 胞有利于其自身生育能力的储备。 人类卵母细胞玻璃化冻存的第一例成功临床案例源于 1999年Kuleshova 等4 使用开放式拉细麦管 (open pulled straws, OPS) 冻融卵母细胞, 复苏存活率 64.7% (11/17) , 并通过 ICSI成功得到一例发育正常的后代。2007 年Antinori 等5报道, 使用冷冻薄膜 (Cryotop) 作为冷冻载体, 卵母细胞获得复苏率 99.4% (328/330) , 行ICSI 18h后, 受精率 93.0% (305/328) , 24h 后, 24 细胞卵裂率96.7% (295/305)
7、 。将295个卵裂球移植到 120例孕妇中, 5周以后 检测到胎心的比率即妊娠率 32.5% (39/120) , 平均胚胎着床率13.2% (39/295) 。临床结局与新鲜卵母细胞受精率 (96.7%) 、卵裂率 (97.6%) 、移 植率 (10.4%) 和妊娠率 (28.6%) 相当。Cobo 等6使用15%EG、15%DMSO 加 0.5mol/L蔗糖作为冷冻保护剂, 对231例卵母细胞玻璃化冷冻, 获得 96.9% (224/231) 的复苏率, 行ICSI 受精率76.3% (171/224) 。进一步监测 D2卵裂 率为94.2% (161/171) , D3 卵裂率77.6%
8、 (125/161) , 囊胚形成率 48.7% (38/78) 。与新鲜卵子受精率 (82.2%) , D2 卵裂率 (97.8%) , 囊胚形成率 (47.5%) 相近。 另一项近 600例标本进行的前瞻性随机对照试验中, 用同样方法 也获得了92.5%的复苏率 (3039/3286) , 并且与新鲜卵子相比, 其受精、发育 及移植方面都没有不利影响7。汇总数据发现, 卵母细胞的玻璃化冷冻复苏存 活率都均达到90%以上, 受精率、D2卵裂率、移植率 (0.05) , 但该升高趋势仍说明玻璃化冷冻虽提高了胚胎复苏率和改善临 床妊娠结局, 但并没有改善新生儿出生结局, 甚至有不利的趋向。 目前
9、安全性问题主要集中在保护剂毒性、开放载体交叉污染、对细胞超微结构的 影响以及操作机械性损伤等方面。开放式载体使用的微生物、交叉污染, 开放性 操作, 存放存储运输风险等问题不再冗述。 保护剂的毒性是影响安全性的重要问 题, 所以一直得到较高的重视, 而目前解决方法仅局限于减少暴露时间, 使用 弱毒性多种保护剂混用等。 玻璃化冷冻时发生巨大的渗透压变化及高浓度冷冻保 护剂会引起滋养细胞微绒毛数量的减少, 对质膜、 线粒体和粗面内质网等细胞器 或细胞结构都可能造成影响。而操作机械性损伤主要考虑到人为技术熟练程度。 如人工辅助时操作不当或操作时间过长, 易引起胚胎损伤。 而激光辅助也可能会 因其热效
10、应而影响胚胎发育。 4 展望 由于冰晶应力、冷休克、溶质效应、破碎损伤、重结晶和渗透性休克等原因, 对 生物活性标本进行简单的冷冻处理极易引起冷冻损伤。 冷冻保存作为一项重要的 手段, 在生物、 医学领域对细胞、 组织等标本的保存发挥着重要的作用。 因此, 选 择一套合适合理的冷冻复苏方案, 对于降低细胞损伤、 提高细胞复苏率, 保存原 有的细胞活性是重要的。自 1978年第一例试管婴儿出生以来, 辅助生殖技术及 相关衍生技术发展迅速。 玻璃化冷冻作为新兴技术并快速得到该领域的认可, 证 实了其可行性和有效性。而在今后的发展中, 稳定性和安全性也日趋得到重视。 综合国内目前报道略少, 以零散临
11、床报道或回顾分析为主, 且临床结局略差于 国外报道水平。国内机构多以商品化试剂盒为主, 缺乏理论系统性的优化探索, 或许是造成这种差异的原因。因此, 对比更好的冷冻保护剂组合、浓度和平衡时 间长度, 探寻更优的决定性影响因素, 增强更大样本量的出生后长期随访, 引 入更全面的安全性评估资料, 将会对该技术在我国的发展与完善起到重要作用。 参考文献 1黄国宁, 孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术M.第1版.北京:人民卫生 出版社, 2012:259-299 2Rall WF, Fahy GM.Cryopreservation of mouse embryos by vitrificationJ
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