1、薄荷提取物对 3 株微藻生长特性的影响 赵文玉 潘维莲 王菁晗 许雪乔 王潇雄 Valerie Teysseyre 胡洪营 桂林理工大学 清华大学环境学院环境模拟与污染控制国家重点联合实验室国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室 皮尔法伯研究所 清华-伯克利深圳学院环境与新能源技术工程实验室 摘 要： 薄荷中含有不同的化感物质, 其化感作用可能抑制或促进微藻生长, 达到对水华微藻或商业微藻的调控作用。该研究以铜绿微囊藻、蛋白核小球藻和栅藻为受试藻种, 探究了薄荷提取物对铜绿微囊藻、蛋白核小球藻和栅藻生长特性的影响。发现薄荷提取物对铜绿微囊藻 (蓝藻) 的生长具有抑制作用, 其抑制率最大
2、可达 97%, 而对蛋白核小球藻和栅藻 (均为绿藻) 的生长具有一定的促进作用, 最大促进率可分别达 552%和 176%, 两株受试绿藻的干重最大增加 0.60 g/L 和 0.62 g/L。可见, 薄荷提取物对不同藻种的生长特性影响不同, 通过添加薄荷提取物控制微藻生长, 达到对不同藻种的调控作用。关键词： 薄荷提取物; 水华; 铜绿微囊藻; 栅藻; 蛋白核小球藻; 化感作用; 化感物质; 作者简介：赵文玉 (1973-) , 男, 副教授, 博士 (后) , 主要从事水处理理论与技术, (电子信箱) ;作者简介：胡洪营, (电子信箱) 。收稿日期：2016-12-30基金：INSTITU
3、T DE RECHERCHE PIERRE FABRE 和 INSTITUT KLORANE 的基金支持Effect of Mentha Extract on Growth Characteristics of Three Strains of MicroalgaeZHAO Wenyu PAN Weilian WANG Jinghan XU Xueqiao WANG Xiaoxiong Valerie Teysseyre HU Hongying Guilin University of Technology; State Key Joint Laboratory of Environmenta
4、l Simulation and Pollution Control, State Environmental Protection Key Laboratory of Microorganism Application and Risk Control (SMARC) , School of Environment, Tsinghua University; Institut de Recherche Pierre Fabre; Abstract： Mentha spp. contains different allelochemicals, which may inhibit or pro
5、mote the growth of microalgae, achieving control of microalgal bloom or regulation of commercial microalgae production. This study investigated the effect of Mentha aquatica L. extract on growth characteristics of three microalgal strains including Microcystis aeruginosa, Chlorella pyrenoidosa and S
6、cenedesmus sp. It was found that Mentha extract inhibited the growth of M. aeruginosa (cyanobacteria) , with inhibition rate up to 97%, while promoting effects were observed on the growth of C. pyrenoidosa and Scenedesmus sp. (both of which belong to green algae) , with maximum promotion rates of 55
7、2% and 176%, respectively. Dry weight of the tested algal strains (C. pyrenoidosa and Scenedesmus sp.) increased maximally by 0.60 g/L and 0.62 g/L. It can be seen that the effects of Mentha extract on growth characteristics of different algae species are different. By adding Mentha extract in the c
8、ultivating medium, growth of the microalgae can be controlled.Keyword： Mentha aquatica L.extract; algal bloom; Microcystis aeruginosa; Scenedesmus sp; Chlorella pyrenoidosa; allelopathy; allelochemicals; Received： 2016-12-30化感作用是植物在生长过程中不断向环境中释放的次生代谢物质对其他生物的生长影响1。微藻是分布广泛, 营养丰富、光合利用率高的生物, 其在富营养化水体中大量
9、繁殖引发水华暴发, 但其含有的优良生物质能源具有良好的开发前景。已有研究发现, 化感物质 (代谢分泌物) 包括水溶性有机酸、生物碱、氨基酸、硫化物、直链醇、酚类和萜类等1。薄荷 (Mentha spp.) 是常见的唇形科植物, 含有化感物质, 如酚类、萜类、有机酸等2, 其可能抑制或促进微藻的生长。水体富营养化引发的水华现象不仅会破坏自然水体, 同时导致经济3、饮食安全、健康4等问题的出现。控制水华的方法主要包括物理法5、化学法6和生物法7。生物法中的化感作用由于无需引入人工合成化学药剂等优势, 成为近年来控制藻类生长的研究热点。已有研究发现, 芦苇8 (Phragmitis communis
10、 Trin) 、大麦秆9 (barley straw) 、凤眼莲10 (Eichhornia Crassipes (Mart.) Solms) 等植物中含有 2-甲基乙酰乙酸乙酯和苯基-1-萘胺、亚油酸等影响藻类生长的物质。目前薄荷在医药、饮食和化妆品等领域被广泛使用11, 但关于薄荷对微藻的生长影响研究却鲜见报道。微藻的爆发式生长引发了一系列的环境问题, 但微藻的利用价值不可小觑。目前, 微藻主要用于生物柴油、色素、饲料、营养品、化妆品等产品的开发利用12。微藻生长的调控是生产不同产品的必要手段之一。目前, 植物的化感作用研究主要针对有害藻类抑制, 而对微藻的促进作用研究较少。若薄荷植物化感
11、作用能提高微藻生物质的产量, 则有益于藻类产品的开发利用。铜绿微囊藻、蛋白核小球藻和栅藻是最常见水华危害的蓝藻和绿藻藻种, 而蛋白核小球藻和栅藻等部分绿藻因含有多不饱和脂肪酸和蛋白等营养物质而具有较高的应用价值12-13。本研究比较了薄荷提取物对铜绿微囊藻、蛋白核小球藻和栅藻的生长特性的影响, 以便为薄荷化感作用的利用提供研究基础和理论参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 薄荷提取物薄荷提取物由皮尔法伯公司 (Pierre Fabre Research Institute) 和康如研究所 (Klorane Institute) 提供。本实验中的薄荷 (Mentha aquatica L.
12、) 生长于法国西南部, 取其地上新鲜部分, 压榨后获得薄荷液, 然后将其过滤干燥获得褐色干粉, 将此干粉置于室温条件下备用 (产量为新鲜薄荷的 4%或干燥薄荷的 22.6%) 。1.1.2 藻种实验所用铜绿微囊藻 (Microcystis aeruginosa, FACHB905) 由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供, 蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa, THUZ-TY1304) 和栅藻 (Scenedesmus sp.LX1, CGMCC 3036) 为实验室以往研究中分离的藻种。3 株藻种均培养于 sm BG11 培养基中14, 繁殖至对数期备用。1.2 试
13、验方法在 500 m L 锥形瓶中加入 250 m L sm BG11 培养基, 121下湿热灭菌 20 min, 冷却后在超净台中加入不同质量的提取物, 由预实验结果设置铜绿微囊藻培养基中薄荷提取物的浓度由低至高分别为 0.03、0.12、0.24、0.36 g/L;蛋白核小球藻与栅藻培养基中薄荷提取物的浓度由低至高分别为 0.6、1.2、1.8、2.4 g/L。每个浓度组设 2 个平行样。实验条件设置:温度 25, 相对湿度 50%, 光照强度 4060mol/ (ms) , 光暗时间比 14 h10 h。1.3 指标与测定方法1.3.1 藻细胞计数采用光学显微镜 (XSZ-HS3) 和血
14、球计数板计数藻细胞数目, 再换算出培养液中的藻细胞密度。细胞数/m L=80 小格内细胞个数/8040010 000稀释倍数。1.3.2 水质指标测定采用 0.45m 水相滤膜过滤藻液, 取滤液测定其中总氮 (TN) 和总磷 (TP) 的含量。TN 采用岛津 TOC 仪 (TOC-V CPH) 测定, TP 采用国家环境保护总局颁布的标准方法, 即钼酸铵分光光度法测定。1.4 数据分析1.4.1 化感物质对藻类的抑制率式 (1) 中:RI 为抑制率 (%) ;N 为加入薄荷提取物组的藻密度 (个/m L) ;N 0为未加入薄荷提取物的对照组藻密度 (个/m L) 。1.4.2 Logistic
15、 模型分析Logistic 模型是在资源有限的环境下, 种群生物量增长速率受到种群密度制约的经典种群增长模型:式 (2) (3) 中, N t为 t 时刻的藻密度 (个/m L) ;t 为培养时间 (d) ;K 为最大环境容纳量 (个/m L) ;a 为常数, 表示曲线对原点的相对位置;r 为藻细胞的比生长速率 (d) ;d N/dt 为种群藻密度的增长速率 (个m Ld) ;N 1、N 2、N 3是藻细胞在 t1、t 2、t 3时刻的种群密度, t 1、t 2、t 3为等差时间点。当生物种群密度为该条件下最大环境容纳量时, 生物密度的增长速率最大, 为半效应浓度 (EC 50, half e
16、ffective concentration, 抑制率为 50%时对应的抑制剂的浓度) 是表征抑制剂抑制目标生物能力的指标, EC 50值越小, 说明抑制剂的抑制活性越大。式 (4) 中:浊为抑制率 (%) ;EC 50为半致死浓度 (mg/L) ;c 0为薄荷提取物浓度 (mg/L) ;Imax为最大抑制率 (%) ;H 为曲线最大斜率, 表征对毒性的敏感程度。2 结果与分析2.1 对铜绿微囊藻生长特性的影响图 1 为不同浓度薄荷提取物对铜绿微囊藻的生长特性的影响。铜绿微囊藻的空白对照组与 0.03 g/L 实验组, 在培养的 015 d 为对数期, 1521 d 为稳定期;0.12 g/L
17、 和 0.24 g/L 的实验组在 07 d 为迟滞期, 21 d 为对数生长期;0.36 g/L 的实验组在 015 d 一直处于迟滞期。培养至 21 d, 铜绿微囊藻均未达到衰亡期, 空白对照组铜绿微囊藻的藻密度为 1.4810 个/m L, 0.36 g/L 实验组的藻密度为 910 个/m L。以上结果表明, 薄荷提取物对铜绿微囊藻有抑制效应, 其抑制效应随添加的薄荷提取物浓度的升高而增强。本研究同时测定了微藻在生长过程中对培养液中磷的利用情况。发现随着添加的薄荷提取物浓度的增加, 实验中铜绿微囊藻对总磷的去除率最大降低23.9%。可见, 薄荷提取物阻碍铜绿微囊藻对磷的营养物质的利用。
18、本实验中铜绿微囊藻的相对抑制率随着培养时间的延长而升高, 实验组铜绿微囊藻的生长受到薄荷提取物的抑制作用, 其最大抑制率达到 97%, 如图 2 所示。据报道, 薄荷植物中含有一定的化感物质如萜类、黄酮类、酚类、有机酸等15,而本实验中薄荷提取物的多酚含量等效于 13.6%的对羟苯基乙醇。薄荷中有机酸含有的迷迭香酸能破坏细菌的细胞膜, 影响细菌的正常生长16, 铜绿微囊藻为蓝细菌, 与细菌同为原核生物, 细胞壁均由肽聚糖组成。因此受化感物质抑制作用的机理与细菌接近。薄荷提取物对铜绿微囊藻的半效应浓度 (EC 50, half effective concentration, 抑制率为 50%时
19、对应的抑制剂的浓度) , 以此来表示薄荷提取物对铜绿微囊藻的抑制能力。由图 2 可知, 随着培养时间的延长薄荷提取物对铜绿微囊藻的 EC50逐渐升高, 说明薄荷提取物对铜绿微囊藻的抑制效应逐渐减弱。用 Logistic 模型拟合铜绿微囊藻后发现, 随着薄荷提取物的添加量的增加, 最大种群密度 K 和种群生物量最大增长速率 Rmax均呈下降趋势 (图 3) 。可见, 薄荷提取物降低铜绿微囊藻的环境容纳量和减缓其生长速度来达到抑制效果。说明薄荷提取物对铜绿微囊藻有长效的抑制作用。2.2 对蛋白核小球藻和栅藻生长特性的影响图 4 为蛋白核小球藻和栅藻的生长特性曲线。对照组与实验组的蛋白核小球藻在培养
20、的 06 d 为对数生长期, 615 d 为稳定期;由图 4 (a) 知, 培养至第 15 d 的空白组蛋白核小球藻的藻密度低于实验组蛋白核小球藻的藻密度。栅藻的实验现象与蛋白核小球藻相似, 栅藻在 012 d 处于对数生长期, 1215 d 为稳定期。达到稳定期的栅藻的藻密度低于蛋白核小球藻的藻密度。2 株绿藻与铜绿微囊藻不同, 薄荷提取物对蛋白核小球藻与栅藻有促进作用, 其促进作用随添加的薄荷提取物浓度的升高而增强。另外, 随着薄荷提取物的添加, 蛋白核小球藻和栅藻的总氮去除率最大增加了57.6%和 55.7%。可见, 薄荷提取物显著提高蛋白核小球藻和栅藻对于总氮的利用。培养至 15 d
21、时, 随着添加浓度的增加, 试验组蛋白核小球藻和栅藻的干重逐渐增加, 明显高于对照组的蛋白核小球藻与栅藻的干重 (图 5) 。2.4 g/L 实验组的蛋白核小球藻和栅藻干重分别为 0.70 g/L 和 0.74 g/L。与对照相比, 蛋白核小球藻和栅藻最大增加了 0.60 g/L 和 0.62g/L。由此看出, 薄荷提取物对蛋白核小球藻和栅藻的干重有明显的促进作用。由图 6 可知, 薄荷提取物对蛋白核小球藻和栅藻有明显的抑制效果。培养至稳定期时, 2.4 g/L 实验组的蛋白核小球藻和栅藻的最大平均促进率分别为 552%和 176%。同一植物对不同微藻生长产生的化感作用不尽相同, 例如芦苇中的
22、化感物质抑制铜绿微囊藻和蛋白核小球藻, 但对斜生栅藻却是先抑制后促进17。薄荷提取物成分复杂, 其中对 3 株受试微藻的有效物质尚不明确。实验组中薄荷提取物最高浓度为 2.4 g/L, 即 250 m L 的培养基中添加 0.6 g 的薄荷提取物。计算得, 1 g/L 的薄荷提取物分别提高了 3 倍的蛋白核小球藻的生物量和1 倍的栅藻生物量。与葡萄糖相比, 10 g/L 的葡萄糖在 250 m L 的培养基中需加入 2.5 g 的葡萄糖。换算成 1 g/L 葡萄糖对蛋白核小球藻的促进作用在 2 倍左右, 而栅藻对葡萄糖的利用能力弱于蛋白核小球藻18。以此可以看出薄荷提取物对 2 株绿藻有明显的
23、促进效应。根据以上结果对蛋白核小球藻和栅藻进行了 Logistic 模型拟合。不同属的微藻尺寸相差较大, 因此两株绿藻的最大种群密度 K 和种群生物量最大增长速率Rmax存在差异。薄荷提取物的加入提高了培养基的蛋白核小球藻和栅藻的环境容纳量。实验结果表明, 随着薄荷提取物浓度的增加, 蛋白核小球藻和栅藻的最大种群密度 K 和种群生物量最大增长速率 Rmax均有升高。蛋白核小球藻的最大种群密度 K 在 5.7104.610 个/m L 之间, 种群生物量最大增长速率 Rmax在 2.010 个/ (m Ld) 2.810 个/ (m Ld) 之间;栅藻的最大种群密度K 在 1.910 个/m L
24、5.610 个/m L 之间, 种群生物量最大增长速率 Rmax在5.510 个/ (m Ld) 3.610 个/ (m Ld) 之间, 如图 7。3 结论薄荷提取物对铜绿微囊藻有抑制效应, 其抑制率可达 97%, 这种抑制效应表现在降低了铜绿微囊藻的环境容纳量和生长速率。薄荷提取物对蛋白核小球藻与栅藻有促进效应, 其促进率可达 552%和 176%, 这种促进效应表现在提高了 2 株绿藻的环境容纳量和生长速率。参考文献1Rice E L.AllelopathyM.2nd Edition.London:Academic Press, 1984. 2Whittaker R.The Biochem
25、ical Ecology of Higher PlantsM./Soudheimer E, Simeone J B.Chemical Ecology.New York:Academic Press Inc., 1970. 3Wang LZ, Li XC.Management of shellfish safety in ChinaJ.Journal of Shellfish Research, 1998, 17 (5) :1609-1611. 4Liu L, Zhong R, Zeng Y.Advances in study on microcystins and their toxicolo
26、gyJ.Journal of Hygiene Research, 2006, 35 (2) :247-249. 5周云龙, 于明.水华的发生、危害和防治J.生物学通报, 2004, 39 (6) :11-14.Zhou Yunlong, Yu Ming.Occurrence, harm and control of algae bloomJ.Bulletin of Biology, 2004, 39 (6) :11-14. 7刘建康, 谢平.用鲢鳙直接控制微囊藻水华的围隔实验和湖泊实践J.生态科学, 2003, 22 (3) :193-196.Liu Jiankang, Xie Ping.Di
27、rect control of microcystis bloom through the use of planktivorous carp-closure experiments and lake fishery practiceJ.Ecologic Science, 2003, 22 (3) :193-196. 8门玉洁, 胡洪营, 李锋民.芦苇化感物质对斜生栅藻 Scenedesmus obliquus生长特性的影响J.生态环境, 2006, 5 (15) :925-929.Men Yujie, Hu Hongying, Li Fengmin.Effects of an allelop
28、athic fraction from Phragmitis communis trin on the growth characteristics of Scenedesmus obliquusJ.Ecology and Environment, 2006, 5 (15) :925-929. 9张薛, 胡洪营, 门玉洁.大麦秆提取液对铜绿微囊藻生长的影响研究J.环境科学学报, 2007, 27 (12) :1984-1987.Zhang Xue, Hu Hongying, Men Yujie.Inhibitory effect of extract from barley straw on
29、the growth of Microcystis aeruginosaJ.Acta Scientiae Circumstantiae, 2007, 27 (12) :1984-1987. 10胡廷尖, 王雨晨, 陈丰刚, 等.凤眼莲对铜绿微囊藻的化感抑制作用研究J.水生态学杂志, 2010, 3 (6) :47-51.Hu Tingjian, Wang Yuchen, Chen Fenggang, et al.Study on allelopathic effects of Eichhornia crassipes to Microcystis aeruginosaJ.Journal of
30、Hydroecology, 2010, 3 (6) :47-51. 11Vohnikova Park KJ Z, Brod FPR.Evaluation of drying parameters and desorption isotherms of garden mint leaves (Mentha crispa L.) J.Journal of Food Engineering, 2002, 51 (3) :193-199. 12王冬琴, 谭瑜, 卢虹玉, 等.微藻生物活性物质在食品工业中的应用进展J.现代食品科技, 2013, 29 (5) :1185-1191.Wang Dongqi
31、n, Tan Yu, Lu Hongyu, et al.Application of micro algal bioactives in food industryJ.Modern Food Science and Technology, 2013, 29 (5) :1185-1191. 14Zhang TY.Isolation and heterotrophic cultivation of mixotrophic microalgae strains for domestic wastewater treatment and lipid production under dark cond
32、itionJ.Bioresource Technology, 2013 (149) :586-589. 15沈梅芳, 李小萌, 单琪媛.薄荷化学成分与药理作用研究新进展J.中华中医药学刊, 2012, 30 (7) :1484-1486.Shen Meifang, Li Xiaomeng, Shan Qiyuan.Research progress of chemical compositions and pharmacological actions of Mentha canadensisJ.Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,
33、 2012, 30 (7) :1484-1486. 16孙询, 汪靖超, 李洪涛, 等.迷迭香酸的抗菌机理研究J.青岛大学学报:自然科学版, 2005, 18 (4) :41-45.Sun Xun, Wang Jingchao, Li Hongtao, et al.A study on the antibacterial mechanism of rosmarinic acidJ.Journal of Qingdao University:Natural Science Edition, 2005, 18 (4) :41-45. 17Men YJ, Hu HY, Li FM.Effects o
34、f the novel allelochemical ethyl 2-methylacetoacetate from the reed (Phragmitis australis Trin) on the growth of several common species of green algaeJ.Journal of Applied Phycology, 2007, 19 (5) :521-527. 18Benjamas Cheirsilp, Salwa Torpee.Enhanced growth and lipid production of microalgae under mixotrophic culture condition:effect of light intensity, glucose concentration and fed-batch cultivationJ.Bioresource Technology, 2012 (110) :510-516.
