1、第4章 蛋白质的 共价结构,Peptides and Primary Structure of Proteins,蛋白质（protein）是一类最重要的生物大分子，在生物体中占有特殊的地位，与核酸构成细胞内原生质的主要成分。 原生质是生命现象的物质基础。,4.1 蛋白质通论 Overview of protein,4.1.1 蛋白质的化学组成和分类The chemical component and classification of proteinChemical component ：C : 50%H : 7%O : 23%N : 16%S : 0-3%other: trace,The c
2、hemical component and classification of protein,蛋白质浓度测定：凯氏定氮法的基础： 氮 = 16% 蛋白质含量 = 蛋白氮 6.25,三聚氰胺,单纯蛋白质： 仅由氨基酸组成，如核糖核酸酶，肌动蛋白。 缀合蛋白质： 除氨基酸外还有其他化学成分作为结构的一部分。(辅基或配体),蛋白质的分类：,The chemical component and classification of protein,单纯蛋白还可根据溶解性及其它物理性质进行分类缀合蛋白可根据辅基分类,The chemical component and classification of
3、 protein,按生物功能分类，如：,酶 调节蛋白 转运蛋白 贮存蛋白 结构蛋白等,The chemical component and classification of protein,根据形状和溶解度可分为三大类：)纤维状蛋白质(Fibrous protein)球状蛋白质(globular proteins)膜蛋白 (Membrane proteins),4.1.2 蛋白质的形状和大小 The shape and size of protein,Fibrous protein,简单有规律的线性结构、形状呈细棒或纤维状。结构作用。 胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白等，不溶于稀盐溶液和水
4、。,The shape and size of protein,globular proteins ：形状接近球形或椭圆球形，多肽链折叠紧密，疏水的氨基酸侧链位于内部，亲水的在外部，如酶类。,The shape and size of protein,Membrane proteins ：与细胞的各种膜系统结合而存在，为能与膜内的非极性相相互作用，膜蛋白的疏水氨基酸侧链伸向外部。,The shape and size of protein,构象和构型 Conformation and configuration,4.1.3 蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次 The conformation a
5、nd Organization level of the protein structure,构象：指具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态。 构象的改变不涉及共价键的断裂。,Conformation and configuration,Conformation and configuration,构型：在具有相同结构式的立体异构体中，取代基团在空间的相对取向。 不同的构型如果没有共价键的破裂时不能互变。,Configuration and conformation define the different aspects of the three dimensional str
6、ucture of biomolecules. Configuration defines the spatial (空间的)arrangement of the groups attached to an asymmetric（不对称的） carbon or two double-bonded carbon atoms. Configurational isomers can not be interconverted without breaking one or more covalent bonds. Conformation refers to the numerous possib
7、le spatial arrangement of atoms due to free rotations around single bonds. Conformational isomers can be interconverted without breaking covalent bonds.,Conformation and configuration,Protein Primary Structure Protein Secondary Structure Protein tertiary Structure Protein Quaternary Structure,The co
8、nformation and Organization level of the protein structure,4.1.4 蛋白质功能的多样性 Protein functions,蛋白质的种类估计在1010 1012数量级。 由20种氨基酸组成的20肽，有21018种序列异构体。 蛋白质的生物功能：,）催化-酶的作用。 ）调节-调节蛋白，如胰岛素（激素），调节遗传信息转录的控制因子。 ）转运-转运蛋白，如血红蛋白、血清清蛋白（将脂肪酸从脂肪组织转运到各器官）是通过血流转运物质的。 ）贮存-如卵清蛋白、乳中的酪蛋白、植物种子中的贮存蛋白等。 ）运动-引起肌肉收缩的肌动蛋白，引起细胞运动的肌
9、动蛋白、肌球蛋白等。,Protein functions,）结构成分-结构蛋白的单体一般聚合成纤维状如胶原蛋白。 ）支架作用-含有多个不同的组件，在它上面可将多种不同蛋白质组装成一个多蛋白复合体，参与对激素和其它信号分子的胞内应答的协调和通讯。 在细胞应答激素和生长因子的复杂途径中起作用。 ）防御和进攻-免疫球蛋白（抗体）、血液凝固蛋白、抗冻蛋白、蛇毒和蜂毒的溶血蛋白、植物毒素、细菌毒素。 ）异常功能蛋白-甜蛋白、节肢弹性蛋白等。,Protein functions,肽是氨基酸的线型聚合物，也称肽链（peptide chain）Amino acids covalently（共价地） join
10、one another to form peptides,4.2 肽Peptide,Peptide,N-C-C- main chain or back bone,蛋白质中氨基酸的连接方式是肽键，实验证据： 蛋白质分子中游离-氨基和-羧基是很少的。 某些人工合成的多肽能被水解蛋白质的蛋白酶所水解。 双缩脲颜色反应 X射线衍射图案,4.2.1 肽和肽键的结构 The structure of peptide and Peptide bond,Name of peptide 二肽(dipeptide) 寡肽(oligopeptide) 多肽(polypeptide) 氨基酸残基(aminoacid
11、residue) 末端氨基 环状肽(cyclic peptide),The structure of peptide and Peptide bond,The structure of peptide and Peptide bond,The peptide chain is directional. An amino acid unit in a peptide chain is called a residue. The end having a free -amino group is called amino-terminal or N-terminal. The end having
12、 a free -carboxyl group is called carboxyl-terminal or C-terminal.,The structure of peptide and Peptide bond,By convention, the N-terminal is taken as the beginning of the peptide chain, and put at the left (C-terminal at the right). Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu,The structure of peptide and Peptide bond,The
13、peptide chain consist of a regularly repeating main chain (or backbone) and the variable side chains of the residues. -N-C-C , N is the amide nitrogen，C is the carbon of amino acid residues，C is carbonyl carbon,The structure of peptide and Peptide bond,Peptide bond is the main way for linkage betwee
14、n amino acids in peptides and proteins Peptide bond is a kind of amide bond, usually denoted by a single bond between carboxyl carbon and amide nitrogen.,Peptide bond,The structure of peptide and Peptide bond,由于酰胺氮上的孤电子对离域与羰基轨道重叠，因此在酰胺氮和羰基氧之间发生共振相互作用(resonance interaction),The structure of peptide a
15、nd Peptide bond,肽键共振产生几个重要结果：限制绕肽键的自由旋转 组成肽基的4个原子和2个相邻的C形成多肽主链的酰胺平面(amide plane)，也称肽基平面或肽平面 C=N键具有约40%双键性质。由于CN具有部分双键性质，绕键旋转的能障比较高,保持酰胺基处于平面 肽键具有永久偶极,The structure of peptide and Peptide bond,酰胺平面(amide plane)，,限制绕肽键的自由旋转，肽主链的每一氨基酸残基只保留两个自由度：绕N-C键的旋转和绕C-C键的旋转,4.2.2 肽的物理和化学性质 The physical and chemica
16、l properties of Peptide,短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在 在pH014范围内，肽键中的酰胺氢不解离,4.2.3 天然存在的活性肽,Biologically active peptides,鹅膏蕈碱是从鬼笔鹅膏中分离出来的一个环状八肽，它能与真核生物的RNA聚合酶II牢固结合而抑制酶的活性，因而使真核生物的RNA的合成不能进行。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽（ Met-enkephalin ） +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽,脑啡肽（enkephalin）在中枢神经系统
17、中形成，是体内自己产生的一类鸦片剂（opiate），是轻度的情绪调节剂和强力镇痛剂。,Biologically active peptides,Biologically active peptides,Glutathione,Glutathione: G-SH and G-S-S-G,G-SH,G-S-S-G,oxidation,reduction,Biologically active peptides,Biologically active peptides,谷胱甘肽（尤其是肝细胞内的谷胱甘肽）具有非常重要的生理作用整合解毒作用，能与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、重金属）等结合，
18、参与生物转化作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。 谷胱甘肽的另一主要生理作用是做为体内一种重要的抗氧化剂，它能够清除掉人体内的自由基，清洁和净化人体内环境污染，从而增进人的身心健康。,蛋白质的共价结构-蛋白质的一级结构-氨基酸序列 现在已知约200,000个不同蛋白质的氨基酸序列 相当一部分使用Sanger法测定的 现在大多数是根据编码蛋白质的基因核苷酸序列推导出来的。,4.3 蛋白质一级结构的测定 Determination of the amino acid sequences of proteins,Determination of the amino acid s
19、equences of proteins,蛋白质的氨基酸序列具有重要意义：蛋白质的一级结构决定它的高级结构（第二遗传密码，一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于多肽链的氨基酸序列中）,Sanger worked out the first amino acid sequence of a peptide (bovine insulin) in 1953.,Determination of the amino acid sequences of proteins,蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋白质生物活性的分子基础,IAYKPAG 。 。,氨基酸序列（一级结构） 高级结构 生物活性（功能）
20、,4.3.1 蛋白质测序的策略 Strategy for sequence analysis,纯度应在97%以上，同时必须知道它的相对分子质量 测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质分子的多肽链（寡聚蛋白则需用变 性剂 8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍或高浓度盐处理） 断开多肽链内的二硫键（用氧化剂或还原剂） 分析每一条多肽链的氨基酸组成,Strategy for sequence analysis, 鉴定多肽链的N-端和C-端氨基酸残基 裂解多肽成较小的片段 测定各肽段的氨基酸序列 重建完整多肽链的一级结构 确定二硫桥的位置,Strategy for sequence analysis
21、,4.3.2 N末端和C末端氨基酸残基的测定4.3.2.1 N-末端分析二硝基氟苯（DNFB,FDNB）法 丹磺酰氯（DNS）法（比DNFB法灵敏度高100倍） 苯异硫氰酸酯（Edman试剂）法 氨肽酶法,4.3.2.2 C-末端分析,肼解法,肼解法,4.3.3 二硫桥的断裂过甲酸氧化法和巯基化合物还原法,4.3.4 氨基酸组成的分析完全水解的氨基酸用氨基酸分析仪测定,Amino acid sequence analyzer :ion-exchange chromatography +color reagents + spectrophotometer,Amino Acids Sequence
22、 Analysis,4.3.5 多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化最有效地Edman化学降解法一次只能连续降解几十个残基，因此须先将长的多肽链水解成较小的肽段。,Edman Degradation,4.3.5.1 酶裂解法胰蛋白酶 糜蛋白酶 嗜热菌蛋白酶 胃蛋白酶 木瓜蛋白酶 葡萄球菌蛋白酶 水解的专一性不同,酶裂解法,4.3.5.2 化学裂解法溴化氰(cyanogen bromide)只断裂由甲硫氨酸残基的羧基参加形成的肽键。 羟胺断裂：AsnGly之间的肽链、AsnLeu及AsnAla键。,4.3.6 肽段氨基酸序列的测定 Amino Acids Sequence Analysis 4
23、.3.6.1 Edmen化学降解法,Amino Acids Sequence Analysis,4.3.6.2 酶降解法外肽酶：氨肽酶和羧肽酶,The amino acid sequences of many proteins are currently deduced from their genes or cDNA sequences The amino acid sequence of a protein is encoded by its corresponding gene. Every three bases consist of a genetic code, which is
24、translated into a specific amino acid on the polypeptide chain. Sequencing DNA is much easier (faster and more accurate) than sequencing a polypeptide.,Amino Acids Sequence Analysis,Amino acid sequences of proteins are mostly deduced(推断) from their DNA sequences nowadays Proteins can be much more ef
25、ficiently studied with their genes available,Amino Acids Sequence Analysis,根据核苷酸序列的推定法,4.3.6.3 根据核苷酸序列的推定法用待测的蛋白质作抗原免疫动物，得相应抗体； 用此抗体去沉淀此种蛋白质的多核糖体(polysome)，因为在这种多核糖体上含有该蛋白质的模版mRNA和与其相连而未被释放的蛋白质多肽链； 后者将与加入的抗体发生结合而使多核糖体沉淀。 从沉淀中分离出该mRNA，并将它转录成cDNA。 测出cDNA的核苷酸序列，从而推测出蛋白质的氨基酸序列。,4.3.7 肽段在多肽链中次序的决定P179,4.
26、3.8 二硫桥位置的确定,Diagonal electrophoresis,用胃蛋白酶水解蛋白成较小片段，将样品点在滤纸中央,4.3.9 蛋白质测定举例 (自学)4.3.10 蛋白质序列数据库(自学),4.4 蛋白质的氨基酸序列与生物功能 The amino acid sequence and the function of a protein,4.4.1 同源蛋白质的物种差异 与生物进化,4.4.1.1 同源蛋白质 （ Homologous proteins ） 在不同生物体种行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。 具有明显序列同源的蛋白质也称同源蛋白质。 不变残基(invariant r
27、esidue) 可变残基(variable residue),Most proteins of the same (or similar) functions contain crucial regions that are essential to their function and whose sequence is therefore conserved. Highly conserved residues usually play important roles in protein structure and/or function.,Homologous proteins,EF-
28、Tu protein family,The amino acid sequences of proteins provide important biochemical information (application of bioinformatic tools).,A newly revealed amino acid sequence of a protein is usually compared with a large bank of stored sequences. Thousands of sequences have been revealed and stored in
29、computerized databases (e.g., Swiss-Prot, PIR, TreEMBL).Sequence similarity usually reveals functional relatedness.,Homologous proteins,PIR：蛋白质信息（鉴定）库，网址： http:/pir.georgetown.edu/ SWISS-PROT：经过注释的蛋白质序列数据库，网址：http:/www.ebi.ac.uk/swissprot/ GenBank：基因序列数据库，网址： http:/www.ncbi.nlm.nih.gov EMBL：欧洲分子生物学实
30、验室数据库，网址：http:/www.ebi.ac.uk/embl/,Homologous proteins,4.4.1.2 细胞色素c Cytochrome C大多数细胞色素c含 一百零几个氨基酸残基。 40多种物种的细胞色素c的分析揭示，多肽链中的28个位置上的氨基酸残基对所有已分析过的样品都是相同的。 例如人和黑猩猩的细胞色素c是相同的（差异残基数为零）；人和其他哺乳动物（绵羊）的细胞色素c相差10个残基。,4.4.1.3 系统树,Homologous proteins share a common ancestor during evolution, hence are of the
31、same function. Homology describes the percentage of similarity (or identity) between two proteins (or DNA molecules), usually referring to sequence rather than structure. Amino acid residues between two proteins at certain positions (counting from the N-terminal as 1) can be identical, conservative
32、(similar), or variable. The amino acid sequences of two or more homologous proteins can be compared by sequence alignment（线性）.,The amino acid sequence and the function of a protein,Aligning protein sequences with the use of gaps (EF-Tu protein family),Aligning protein sequences in the EF-1/EF-Tu protein family,Primary Structure of Proteins,Conservation and variation of cytochrome c sequences,27 invariant residues (yellow), conservative substitutions (blue) non-conservative or variable residues (unshaded),Primary Structure of Proteins,蛋白质的共价结构章完,
