1、 西北大学学报 (自然科学网络版 ) 2005 年 5 月，第 3 卷，第 5 期 Science Journal of Northwest University Online May. 2005， Vo l. 3， No. 5 _ 收稿日期： 2004-09-08 基金项目： 陕西省教育厅专项基金资助项目（ 01jk099） 审 稿 人： 孙悦迎，女，陕西省微生物研究所副研究员 转化法获被孢霉不饱和酸高产菌株 孙继民，王卫卫，熊本涛，侯小娟 (西北大学 生命科学学院 ， 陕西 西安 710069) 摘 要： 为了提高拉曼被孢霉多不饱和脂肪酸的产量。通过转化的方法，将小克银汉霉的 DNA转入拉
2、曼被孢霉孢子细胞中。得到转化子 F2-70。随后对该转化子的油脂含量不饱和脂肪酸含量、葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶活性进行了比较分析。实验表明：该转化子比出发菌株具有较显著改变，其干菌体含油率比原来提高了 30.6%，碘值提高了近 40%；该转化子经传代培养 10代以后，它的遗传性状仍然稳定。 关 键 词： 多不饱和脂肪酸；转化法；被孢霉；葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶 中图分类号 ： Q813 文献标识码 ： A 文章编号： 1000-274X(2005)0148-6 近年来，围绕微生物生产多不饱和脂肪酸的遗传诱变育种，人们采用了大量物理的、化学的和基因工程的方法，并取得了较好的效果。随着生物技术的发
3、展，人们倾向于用基因工程来提高目的产量。如文献 1在番茄中表达了酵母9脂肪酸脱饱和基因，转基因果实中棕榈酸和亚油酸的含量上升；文献 2克隆了催化油酸转化成亚油酸的12脂肪酸去饱和基因，并在酵母中表达；文献 3在烟草中导入兰藻6脂肪酸脱饱和酶基因，结果，转基因烟草中 r-亚麻酸大为积累；文献 4从芜荽中分离克隆了4软脂酰 ACP脱饱和酶基因，并于烟草中转化，后者合成了占其总脂肪酸 5%的岩芹酸；文献 5从高山被孢霉中克隆了 AA和 EPA在生物合成中起关键作用的5-脂肪酸去饱和酶的基因；文献 6， 7分别将5-脂肪酸去饱和酶与延伸酶在酵母内共同表达，以 C18:3和 C18:4为底物获得了 AA
4、和 EPA，成功地实现了 PUFA生成合成途径的异源重组。文献 8从被孢霉细胞中克隆了-葡萄糖苷酶的 cDNA，并进行了其功能的表达。文献 9向大豆导入深黄被孢霉6-脂肪酸脱氢酶基因，也获得了一定效果。另外，文献 10将深黄被孢霉 M6-226-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达。由于产多不饱和脂肪酸的小克银汉霉具有生长速度快、菌丝粗壮、疏松、颜色较白，而被孢霉相对生长速度慢、菌丝较细密、颜色灰白，所以，将小克银汉霉的 DNA导入拉曼被孢霉细胞中，通过孢子细胞染色体 DNA和外源 DNA的一系列重组、交换和整合，可形成新的染色体组合 ,获得新的性状的菌株。本文报道了用转化的方法来进行被孢霉育种
5、的初步研究结果。 1 材料与方法 1.1 菌种、培养基、试剂 1.1.1 菌 种 拉曼被孢霉 (Mortierella ramanniana)M2-03、小克银汉霉 (Cunninghamella echinulate)C3-10，本实验室保存。 1.1.2 培养基 斜面培养基：采用 PDA培养基； 种子培养基：葡萄糖 50g/L,酵母膏 1g/L， MgSO4 - 2 -1g/L,(NH4)2SO4 3g/L,KH2PO4 2g/L,蛋白胨 0.5g/L， pH自然； 发酵培养基：葡萄糖 100g/L, 酵母膏 2g/L,蛋白0.5g/L, MgSO41g/L, (NH4)2SO44g/L,
6、 KH2PO4 3g/L,柠檬酸 1.2g/L, 柠檬酸钠 1g/L,微量元素液 1mL/L,pH自然； 基本培养基 (MM)：葡萄糖 50g/L,(NH4)2SO43g/L,KH2PO41g/L,MgSO42H2O 0.5g/L,酵母膏 0.5g/L,蛋白胨 0.3g/L,微量元素液 1mL/L,pH自然。 1.1.3 试剂 2% CTAB， -巯基乙醇， 0.1mol/L MgCl2溶液， 0.1mol/L LiAc溶液，酚氯仿异戊醇液，异丙醇， 乙醇， TE缓冲液 （ pH8.0） ， 5.0mol/L LiCl溶液， 聚乙二醇 (4000)， 液氮， 苏丹黑， -萘胺， I2液 ,Na
7、2S2O3 5H2O。 1.2 方 法 1.2.1 DNA的提取 参考文献 11， 12 提取 DNA的方法并作改进：将小克银汉霉孢子培养 2d，真空抽虑菌丝，用无菌生理盐水、 20mmol/L EDTA、 无菌生理盐水分别洗一次，抽干，称重。加液氮，将菌体研磨至粉末。以每 1g菌体加 4mL CTAB抽提液（含 2% -巯基乙醇）于 65保温 45 60min，并不时上下混匀。再按 1g菌体加1.5mL 5mol/L的 LiCl充分混匀，水浴 30min。 4下离心 10min（ 11 000r/min） 。加入等体积酚氯仿异戊醇液 , 轻轻上下混匀。离心 10min（ 11 000r/mi
8、n） 。取上层水相至另一离心管中，加入 0.5 0.6倍体积冷冻的异丙醇，轻轻上下混匀， 4放置 20 30min，至出现絮状沉淀。离心 10min（ 11 000r/min） ，倾去上清液，将离心管倒置于吸水纸上控干。用 70%乙醇洗涤沉淀 2 3次，真空干燥后，用适量的 TE液完全溶解沉淀。 -20保存备用。 1.2.2 DNA的转化 参考文献 13， 14的真菌转化法和文献8， 15作一改进：将培养 7 8d的被孢霉的新鲜分生孢子加入 MM悬液，调整在 100mL中约含有 108个分生孢子， 30摇床培养 4 6h,离心收集萌发的孢子，用30mL TE洗涤一次，再离心收集（ 10 000
9、r/min）分生孢子，并悬浮于 0.4mL 0.1mol/L MgCl2中，浓度在 107个mL,30振荡保温 50min再离心并悬浮在 0.1mol/L LiAc中， 30振荡保温 30min；用 0.1mol/L LiAc将分生孢子调整在 1 610个 mL范围内按 0.5mL孢子悬液加入 5 10mL TE悬浮的 DNA 20 g的比例加入 DNA的 TE悬浮液，混匀后， 10过夜。再加入 6 8mL PEG充分混匀， 30保温 30 50min， 37热冲击 10min，静置 40min，离心收集分生孢子， MM液洗涤一次，最终用 MM液悬浮。均匀涂布于平板上 ,培养 2 3d，挑选转
10、化株。 1.2.3 检验 苏丹黑染色法：对文献 16的方法略作修改，即染色后离心，水洗一次，再离心，悬于等体积的无菌水中； 用 Soxhlet法抽提油脂及油脂的碘值测定17； G-6-PDH活性的测定18：氯化三苯基四氮唑还原法（ TTC法） ，未加 TTC之前，调整 F2-70与出发菌株的吸光度，使它们的吸光度值相等，然后再同时加入TTC处理一定时间即可； 遗传稳定性实验：用斜面培养基将 F2-70进行传代培养，培养 10代后，测定第 1代和第 10代转化菌株 F2-70的菌体收率、 菌体含油率及葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶活性， 将之进行比较， 其变化范围小于 5%，则说明它的遗传稳定性可靠。
11、 2 结果与讨论 2.1 形态比较（初筛） 通过形态对比 ,从培养了 2 3d的平板上挑选生长速度快，菌丝粗大，菌苔大、厚、密，颜色较浅的菌落于- 3 -00.10.20.30.4123456编号（次）吸光度（OD值）突变株出发株斜面，进行培养；通过复筛，从 203株转化子中得到了一株多不饱和脂肪酸量大幅提高的转化子 F2-70（见表 1） 。 表 1 出发菌株与转化菌株的形态比较 Tab.1 The comparision of figure of the original strain and F2-70Strains The original strain F2-70生长速度 慢（ 2-
12、3d才能看到） 快（十几 h即可看到） 菌 丝 较小 较粗 菌 苔 薄、小、疏松 厚、大、密 颜 色 白而偏灰 偏白（后偏褐） 2.2 苏丹黑染色结果 2.2.1 转化菌株与出发菌株细胞脂肪粒的数目与大小的比较 将它们的斜面孢子用无菌水分别洗入液体培养基中，培养 6天，然后，通过离心、洗涤、染色、观察，最后，获得实验结果（表 2） 。可以看出，在相同培养条件和营养成分充足的条件下，虽然转化株的平均脂肪粒数目比出发菌株细胞脂肪粒的数目要小；但其脂肪颗粒要大得多，相对单位细胞的脂肪量也要大得多；这应与单位细胞中的脂肪酶的增加有关。 表 2 转化菌株与出发菌株细胞脂肪粒的数目与大小的比较 Tab.2
13、 The comparision of number and volumn of the original strain and F2-70Strains Number of fatty/cell Volumn of fatty/ m F2-70 4.6 2.47 The original strain 6.1 2.03 2.2.2 转化菌株与出发菌株脂肪酸量的比较 将它们的斜面孢子分别用无菌水洗入液体培养基中，培养 3d 以后，各取 5ml 悬液经相同浓度和体积的苏丹黑染色以后，在 580nm 下测定它们的吸光度值，并进行比较分析（图 1） 。从图 1 可以看出 ,菌体在相同条件下，培养 3
14、d，其油脂含量就有了较大的差别，说明它们的油脂积累量有了较大的不同。可能是因转录、翻译合成油脂的酶量或酶的活性发生了改变而导致的结果。 图 1 转化菌株与出发菌株油脂含量的比较 Fig.1 The comparision of fatty oil of the original strain and F2-70 2.3 转化菌株 F2-70与出发菌株的含油率及其碘值的比较 将转化菌株与出发菌株的斜面孢子用无菌水洗至液体培养基中，在 28下，摇床培养 6d。再抽滤、洗涤、干燥、研磨、抽提和测定，见表 3的数据比较分析，其中转化株 F2-70的干菌体平均含油量和碘值比对照株分别- 4 -00.05
15、0.10.15123456编号 (次 )吸光度（OD值)突变株出发菌株高出了 30.2%和 40.0%，可以看出，转化株 F2-70的合成不饱和脂肪酸的能力大大提高了 ,说明其对应的 DNA可能发生了变化，在转化过程中获得了目的基因。 表 3 转化菌株 F2-70与出发菌株的含油率及其碘值的比较 Tab.3 The comparision of lipid in biomass and I2scale of total fatty of the original strain and F2-70strains lipid in biomass /% I2 scale of total fatt
16、y 1 2 3 4 5 6 平均值 1 2 3 4 5 6 平均值 Original 25.5 25.0 24.3 23.7 24.4 24.6 24.6 86 81 83 82 84 82 83F2-70 30.6 33.7 32.8 31.9 31.5 32.3 32.13 118 120 115 117 118 113 116.82.4 葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶 （ G-6-PDH） 活性的测定 图 2 出发菌株与突变株脱氢酶活性的比较 Fig.2 The comparision of Glucose-6-phosphate dehydrogenase of the original s
17、train and F2-70为了进一步获得证明，测量其酶的活性或酶量大小有无变化。将斜面孢子洗入液体培养基中， 28、摇床培养 3d、离心、称相同重量的菌丝和缓冲液研磨，然后，加入 TTC，与之反应 30-50min，取上清液测定它们的吸光度值。从图 2可以进一步说明，根据中心法则，如酶（蛋白质）的活性发生了变化，则说明 DNA也可能发生变化，由于转化菌株 F2-70比出发菌株的脱氢酶活性要大得多，说明转化株 F2-70获得了目的基因；为了进一步证实，再进行遗传稳定性实验 。 2.5 遗传稳定性实验 F2-70经传代 10代以后，测定其性能指标；实验结果（表 4）表明， F2-70菌株的性能
18、稳定，说明它是可遗传的、带目的基因的、有开发应用价值的、遗传稳定的转化株。 表 4 遗传稳定性实验 Tab.4 Genetic stability of F2-70Biomass /g-L） Lipid in biomass /% Active of G-6-PDH /吸光度值 The first generation 42.8 32.13 0.14 The tenth generation 42.2 31.8 约 0.14 The rate of change /% 1.4 1.03 0 - 5 -3 讨 论 孢子转化的方法是一种半定向的育种方法，具有较好的实用性，虽然，其诱变效率没有基因工
19、程重组技术高，但操作方法简便，实验条件要求较低。在此试验中，新鲜的分生孢子萌发时的同频率和萌发率是关键，其次是加入的 DNA的量及氯化镁与醋酸锂对孢子的影响效果。本文的实验结果初步显示，转化子获得了目的基因；孢子转化法是被孢霉育种中的一种较有效的方法。 参考文献 1 WANG C L,CHIN C T. Changes of fatty acids and fatty acid derived flavour compounds by expressing the yeast -9 desaturase gene in tomatoJ. J Agric FoodChem, 1996, 44(1
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28、生理学实验指导 M. 北京 : 高等教育出版社 , 1999. (编辑 曹大刚) Transformation method of obtaining poly- unsaturated fatty acid in a mortierella ramannianas high yield strain SUN Ji min, WANG Wei-wei, XIONG Ben-tao, HOU Xiao-juan （ Institute of Life Science, Northwest University, xian 710069, China） ABSTRACT: To increase
29、the productivity of poly-unsaturated fatty acid, the cunninghamella echinulates gene was transformed into Mortierella ramanniana strain . A high-yield strain-F2-70was obtained. Then its percent of poly-unsaturated fatty acidGlucose-6-phosphate dehydrogenase,biomass, lipids were analyzed and research
30、ed .The statistical results obtained show that the high-yield strain which we obtained is more mutants than the originations .The high-yield strain is as stable as the tenth generation and as the first one.And the productivity of F2-70 fatty acid is 30.2% higher than the original strains. Key words: poly-unsaturated fatty acid; transformation method; Mortierella ramanniana ;Glucose-6-phosphate dehydrogenase 作者简介 孙继民，男，湖南娄底人，生于1969年。讲师，西北大学生命科学学院硕士生，主要从事微生物生理生化及应用方面的研究。现主攻霉菌和放线菌的诱变育种及其代谢产物的发酵等方面的研究，曾发表相关论文两篇。 本文引用格式为： 孙继民，王卫卫，熊本涛，等.转化法获被孢霉不饱和酸高产菌株J. 西北大学学报(自然科学网络版) , 2005, 3（ 5） ： 0148.
