1、胞质完整的无透明带卵母细胞临床利用 价值探讨 马超 邵小光 金波 张振强 大连市妇女儿童医疗中心生殖与遗传医学中心 摘 要： 目的 探讨胞质完整的无透明带卵母细胞 (ZFO) 的临床利用价值。方法 选取本 中心2016 年1月至 12月接受ICSI治疗的 123例不孕症患者, 根据卵母细胞有 无透明带分为2组:36 个ICSI周期中的36 枚ZFO作为实验组, 87个 ICSI周期 中749 枚透明带完整的成熟卵母细胞作为对照组。比较两组患者一般临床特征、 促性腺激素 (Gn) 用量及天数、HCG日血清雌二醇 (E2) 水平及平均获卵数, 同 时对两组的受精率、双原核 (2PN) 受精率、异常
2、受精率、卵裂率、囊胚形成率 及优质囊胚形成率进行比较分析。结果 两组患者的年龄、不孕年限、体重指数 (BMI) 、基础 FSH水平、Gn用量及使用天数、HCG日E2水平及平均获卵数差异 均无统计学意义 (P0.05) ;实验组与对照组 ICSI后的受精率、2PN 受精率、异 常受精率、卵裂率、囊胚形成率及优质囊胚形成率相比较, 差异均无统计学意义 (P0.05) 。结论 无透明带卵母细胞可以正常受精、卵裂并发育为囊胚;若患者 在无可利用胚胎的前提下, 临床上可以考虑将其利用, 以增加患者的累积妊娠 率。 关键词： 无透明带卵母细胞; 卵胞浆内单精子注射; 胚胎培养; 囊胚; 作者简介：马超,
3、男, 辽宁大连人, 硕士, 助理研究员, 生殖医学专业. 作者简介：邵小光, Email: 基金：国家自然基金面上项目 (81571498) Clinical value of cytoplasmic intact and zona pellucid-free oocytes MA Chao SHAO Xiao-guang JIN Bo ZHANG Zhen-qiang Reproductive Medicine Center, Dalian Municipal Women Abstract： Objective: To investigate the clinical value of cy
4、toplasmic intact and zona pellucid-free oocytes (ZFO) .Methods: A total of 123 infertile patients treated with ICSI from January to December in 2016 were selected for the study.The oocytes were divided into two groups according to with or without zona pellucid:36 ZFO of 36 ICSI cycles in the test gr
5、oup, and 749 zona pellucida intact oocytes of 87 ICSI cycles in the control group.The general clinical characteristics, dosage and days of gonadotropin (Gn) used, serum E2 levels on the HCG day, average number of oocytes retrieved, fertilization rate, two pronuclei (2 PN) fertilization rate, abnorma
6、l fertilization rate, cleavage rate, blastocyst formation rate and high quality blastocyst formation rate were compared between the two groups.Results: There were no significant differences in age, infertility duration, body mass index (BMI) , basal FSH levels, dosage and days of Gn used, E2 levels
7、on HCG day and average number of oocytes retrieved between the two groups (P0.05) .There were also no significant differences in fertilization rate, 2 PN fertilization rate, abnormal fertilization rate, cleavage rate, blastocyst formation rate and high quality blastocyst formation rate between the t
8、wo groups (P0.05) .Conclusions: Zona-free oocytes can be successfully fertilized, and cleave ICSI; Embryo culture; Blastocyst; (J Reprod Med2018, 27 (01) :32-36) 在人类辅助生殖技术 (ART) 过程中, 由于取卵过程负压过大或剥除卵母细胞颗 粒细胞时剥卵针过细等原因1, 会对卵母细胞透明带造成伤害, 导致患者的部 分卵母细胞存在无透明带现象。对于这些胞质完整的无透明带卵母细胞 (zona-free oocytes, ZFO) , 大多
9、数生殖实验室往往采取丢弃方式处理。对于 那些高龄且取卵周期获卵数较少的患者来说, 如果能够把这部分卵加以利用, 从而增加患者的可利用胚胎数量, 将会大大减轻患者身心和经济上的压力。 本研 究对本中心获取的 36枚ZFO尝试ICSI授精并对受精后相关数据进行统计分析, 以探讨ZFO的临床利用价值。 资料与方法 一、研究对象 收集本中心2016年112月共123例接受ICSI治疗的不孕症患者作为研究对象。 本研究选取36个ICSI 周期中36枚ZFO作为实验组 (每周期发现1 枚ZFO, 同 周期剩余卵母细胞为透明带完整卵母细胞) , 同期87例ICSI周期中749枚透明 带完整的成熟卵母细胞作为
10、对照组, 两组受精后均进行囊胚培养。 入组标准:患者年龄均38岁;不孕原因均为男方因素。 排除标准:染色体异常;子宫内膜异位症;卵巢低反应等疾病。 所有用于研究的卵母细胞均经患者同意并签署知情同意书。 二、方法 1.促排卵及卵母细胞的获取:促排卵采用超长方案、长方案和短方案2, 当有 2个优势卵泡直径达 20mm时, 注射HCG (丽珠医药) 10 000U, 36h 后行阴道B 超指引下穿刺取卵。 2.受精过程及受精判断:取卵完成后, 卵冠丘复合物需在培养液中培养 4h, 常 规透明质酸酶消化, 剥除卵母细胞颗粒细胞, 准备ICSI。实验组:剥除颗粒细胞 后, 一旦发现 ZFO (图1A)
11、, 应用Oosight系统对其纺锤体的有无及位置进行观 察 (图 1B) , 以判断 ZFO是否成熟及ICSI 入针位置, 避免ICSI过程对纺锤体 造成伤害。由于没有透明带的保护, ICSI过程极易对 ZFO造成损伤, 故持卵针 应轻柔固定ZFO, 注射过程应小心缓慢, 注射后移入 G-IVF-plus (Vitrolife, 瑞典) 受精微滴中培养。对照组:剥除卵母细胞颗粒细胞后, 以卵母细胞出现第 一极体为标准, 判断卵母细胞成熟度。ICSI 过程采取本中心常规操作。ICSI后 1618h对卵母细胞受精情况进行观察, 若卵母细胞出现双原核, 则判断为正常 受精。 3.胚胎培养及观察: (
12、1) 实验组:应用微穴培养方式 (Well of the well, WOW) 3 对受精后ZFO进行培养。具体操作步骤如下:用1 ml注射器 (BD, 美国) 小心在 3001培养皿 (FALCON BD, 美国) 中央钻取多个直径在 150200m的锥形小孔, 用新鲜培养液冲洗小孔数次, 将皿中残余杂质清除, 环氧乙烷消毒后备用。 50l G-1-plus (Vitrolife, 瑞典) 卵裂培养液加入小孔, 矿物油覆盖, 平衡 后备用。 次日用巴斯特吸管将确认受精的ZFO小心转移至平衡好的小孔中, 37、 6%CO2、5%O2条件下培养 48h。第三天 (D3) 用巴斯特吸管将 90%G
13、-1-plus培养液 吸出, 并将平衡好的 G-2-plus (Vitrolife, 瑞典) 囊胚培养液50l 原位加入 培养微滴中, 继续培养至第五天 (D5) 或第六天 (D6) 。D5用巴斯特吸管小心 吹打小孔中央, 以使胚胎脱离小孔之外, 小心将胚胎转移至另一微滴中, 倒置 显微镜下对胚胎质量进行评估 (图1F) 。 (2) 对照组:采用传统序贯培养方式, D3更换囊胚培养液, 培养至D5 或D6, 对囊胚形成情况进行观察。 图 1为显微镜 下ZFO 受精及卵裂过程。 4.相关结局指标计算方法:ICSI 受精率= (2PN+1PN+多PN数) /MII卵数 100%;2PN受精率=2P
14、N受精数/MII卵数100%;异常受精率= (1PN+多PN数) /MII卵数100%;卵裂率=2PN卵裂数/2PN受精数100%;囊胚形成率=囊胚形成 数/2PN 卵裂数100%;优质囊胚形成率=优质囊胚数/2PN卵裂数100%。本中心 根据Garnder 囊胚分级法对形成的囊胚进行分级4, 将D5、D6评分在 3期BB 以上囊胚定义为优质囊胚, 囊胚形成标准定义为 2期以上囊胚。 三、统计学分析 运用SPSS18.0 对数据进行统计学分析。 计量资料用均数标准差 表示, 均数比较采用 t检验, 计数资料用率表示, 率的比较采用检验。P0.05) (表1) 。 二、实验组与对照组实验室相关结
15、局比较 应用Oosight 纺锤体观察系统对 36枚ZFO进行观察后发现, 36枚ZFO 均发现纺 锤体, 并对所有 36 枚ZFO行ICSI。对照组在观察到第一极体确认卵母细胞成熟 后行ICSI。两组ICSI 后的受精率、2PN受精率、异常受精率、卵裂率、囊胚形 成率及优质囊胚形成率相比较, 差异均无统计学意义 (P0.05) (表 2) 。 表1 两组患者的一般临床资料 下载原表 表2 实验组与对照组实验室结局比较 (%) 下载原表 讨论 1999年 Ding等5首次报道, ZFO通过ICSI 可以获得受精, 并能在体外发育至 囊胚阶段。 随后, Stanger 等6通过不脱颗粒细胞的方式
16、对 ZFO进行 ICSI操作, 成功使患者妊娠。2010 年Shu等7首次报道, 对脱颗粒细胞后的ZFO 行ICSI, 成功受精、妊娠并活产了健康婴儿。Ueno等8回顾性分析研究发现, ZFO卵母 细胞可以和正常卵母细胞一样在体外受精并发育到囊胚期, 并不影响其囊胚形 成率、妊娠率及新生儿活产率。本研究结果显示, 应用Oosight纺锤体观察系统 对ZFO 行 ICSI, 可以取得与透明带完整卵母细胞相似的受精率、卵裂率及囊胚 形成率。此结果与 Ueno等8报道基本一致。 人类卵母细胞透明带是由初级卵母细胞分泌而形成的酸性糖蛋白膜, 位于放射 冠和卵黄膜之间。在卵母细胞和早期胚胎的保护、精卵识
17、别、阻止多精受精及维 持卵裂期细胞间的空间构象等方面起着重要作用9。由于ZFO没有透明带的保 护, 失去了精卵识别、阻止多精受精的功能, 本研究对ZFO采取ICSI 方式进行 受精。同时ZFO没有透明带的支撑保护, ICSI 过程极易对ZFO造成损伤, 故在 操作过程中, 持卵针应轻柔固定 ZFO, 注射过程应小心缓慢。由于 ZFO 无法观察 到第一极体, 所以无法对 ZFO的成熟度及纺锤体位置进行判断, 给 ICSI过程带 来很大困难。Rubino 等10采取随机位点对 ZFO行ICSI并取得不错的结果。本 研究应用Oosight纺锤体观察系统对 36枚 ZFO观察后进行ICSI, 提高了
18、ICSI 过程的安全性, 取得了较高的受精率、卵裂率及囊胚形成率。 在ART 周期中, 医源性损伤或自身遗传因素等原因会导致患者部分或全部卵母 细胞无透明带现象。 医源性损伤是大多数 ZFO 产生的原因, 其中取卵过程负压过 大及剥除卵母细胞颗粒细胞时剥卵针过细, 则是医源性ZFO产生的主要原因 8。由遗传因素导致 ZFO则非常罕见, Huang 等11报道了一个家系由于 ZP1 基因突变导致全部 ZFO现象。Hu等12报道一例患者多次周期均出现全部 ZFO 现象, 通过 ICSI授精并成功诞下一对双胞胎。本研究实验组 36枚 ZFO来源于 36周期, 均为医源性损伤导致。发生 ZFO周期患者
19、年龄, 不孕年限等临床特征 与对照组没有明显相关性, 说明ZFO的发生没有群体特殊性, 可能与外界因素 刺激有关。 为了避免医源性卵母细胞损伤, 在取卵过程中, 应选择合适孔径的取 卵针同时应避免负压过大;在剥除卵母细胞颗粒细胞过程中, 应选择合适孔径的 巴斯特吸管, 剥卵时应小心轻柔, 尽可能减少对卵母细胞造成伤害。 ZFO受精后培养过程中, 由于没有了透明带的支持保护, ZFO在卵裂期极易发生 卵裂球分散现象, 导致卵裂球间细胞连接减少, 进而发生胚胎停育。Vajta等3 提出WOW 体系, 通过锥形微穴来维持卵裂球的空间构象, 避免了卵裂期胚胎分 散现象, 大大提高了 ZFO的囊胚形成率
20、。本研究应用 WOW培养方式, 对受精后ZFO培养至囊胚阶段。同时采用 D3原位换液, D5对胚胎发育情况进行观察的策 略, 避免了胚胎在融合前因体外操作导致卵裂球分散现象。 有研究报道无透明带囊胚移植已经诞生健康婴儿, 与透明带完整囊胚移植比较, 并不影响妊娠率与活产率13-15。虽然ZFO 已有活产报道, 但目前尚未有 ZFO 相关深入的安全性评估报道, 故本研究对于 ZFO周期的移植策略是, 优先移植 透明带完整胚胎, 将受精后 ZFO培养至囊胚并冷冻保存, 拟解冻周期移植。 故本 研究目前还未有ZFO 移植后妊娠报道。 综上所述, 本研究初步探讨了 ZFO的临床利用价值。研究结果显示,
21、 ZFO 可以正 常受精、卵裂并发育为囊胚。若患者在无可利用胚胎前提下, 临床上可以考虑将 其利用, 以增加患者的累积妊娠率, 降低患者心理和经济上的压力。 但本研究仅 为阶段性观察, 还需要继续观察种植后的临床结局, 以确定ZFO的真正临床价 值。 参考文献 1黄国宁, 孙海翔主编.体外受精-胚胎移植实验室技术M.北京:人民卫生出 版社, 2012:37-43. 2陈子江主编.人类生殖与辅助生殖M.第 1版.北京:科学出版社, 2005:373-460. 3Vajta G, Peura TT, Holm P, et al.New method for culture of zona-incl
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