1、茶树 miR156a 靶基因 SPL6 和 SPL9 的克隆及表达分析 刘亚芹 田坤红 孙琪璐 潘铖 李叶云 蒋家月 江昌俊 安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室 信阳师范学院河南省茶树生物学重点实验室 摘 要： MicroRNA156a-SQUAMOSA promoter binding-like protein (miR156a-SPLs) 参与植物生长阶段转变、叶片形态建成和逆境胁迫等复杂的生理过程。基于茶树转录组数据, 从茶树中克隆出 2 个 SPL 家族成员CsSPL6 和 CsSPL9。CsSPL6 cDNA 全长 2 318 bp, ORF 框长 1 668 bp, 编
2、码 555 个氨基酸;CsSPL9 cDNA 全长 1 954 bp, ORF 框长 1 116 bp, 编码 371 个氨基酸;CsSPL6 和 CsSPL9 都有典型 SBP 结构域和 Csn-miR156a 识别位点。时空表达特性分析表明, Csn-miR156a在芽中表达量最高, 第 7 叶中最低, 与 CsSPL6 和 CsSPL9 呈负调控关系;不同品种 (系) 表达特性分析表明, Csn-miR156a 的表达模式与新梢生长量、光合指标结果一致, 与 CsSPL6 和 CsSPL9 表达模式相反, 说明 Csn-miR156a、CsSPL6和 CsSPL9 参与茶树生长过程, C
3、sn-miR156a 和 CsSPLs 可作为初步判断品种生长势强弱的分子手段;高温处理 4 个品种 (系) 表达特性表明 Csn-miR156a 与CsSPL9 呈负相关, 推断茶树在高温胁迫下 Csn-miR156a 可能通过负调控 CsSPL9来增加耐高温性。Csn-miR156a 负调控 CsSPLs 在茶树生长发育、逆境胁迫中发挥作用, 为茶树生长和抗逆机制提供理论依据。关键词： 茶树; 生长势; 高温; miR156a; SPL; 作者简介：刘亚芹, 女, 硕士研究生, 主要从事茶树种质资源与育种。作者简介：江昌俊 收稿日期：2017-07-04基金：茶树响应低温胁迫的 micro
4、RNA 发掘及其调控机制研究 (31270729) Cloning and Expression Analysis of miR156a-targeted Genes SPL6 and SPL9 in Camellia sinensisLIU Yaqin TIAN Kunhong SUN Qilu PAN Cheng LI Yeyun JIANG Jiayue JIANG Changjun State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University; Abstract： Mic
5、ro RNA156 a-SQUAMOSA promoter binding-like protein (miR156 a-SPLs) play important roles in growth process, formation of leaves and response to stress in tea plant (Camellia sinensis) . Based on transcriptome data, two c DNA CsSPL6 (2 318 bp) and CsSPL9 (1 954 bp) were cloned from tea plant. The nucl
6、eotide and amino acid sequences, biological information, phylogenetic tree and molecular expression models of the CsSPL6 and CsSPL9 were analyzed. Sequence analysis showed that the open reading frames of CsSPL6 and CsSPL9 are 1 668 bp and 1 116 bp, encoding 555 and 371 amino acids respectively. Both
7、 genes contain typical SBP domain and the recognition sites of micro RNA156 a. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression profile of Csn-miR156 a was the highest in the buds, and the lowest in the 7 th leaves, which was negatively correlated with CsSPL6 and CsSPL9. For different
8、varieties (strains) , the expression of Csn-miR156 a was consistent with the growth of new shoots and the value of Photosynthesis index, but negatively correlated with the expression of CsSPL6 and CsSPL9, indicating. Csn-miR156 a, CsSPL6 and CsSPL9 were involved in the growth of tea plant and can be
9、 used as markers to assess growth abilities among varieties. In addition, the expression of CsSPL9 was negatively correlatedwith Csn-miR156 a under heat stress in four varieties (strains) , which might be associated with the enhanced heat tolerance ability. The results showed that the expression of
10、CsSPLs were negatively regulated by Csn-miR156 a, which played an important role in the growth, development of tea plant and the stress resistance, providing a theoretical basis for understanding the growth and resistance mechanism of tea plant.Keyword： Camellia sinensis; growth potential; high temp
11、erature; miR156a; SPL; Received： 2017-07-04SQUAMOSA 启动子结合蛋白 (SQUAMOSA promoter binding protein-like, SPL) 是植物特有和保守的一个转录因子, 最先在金鱼草1中分离。研究发现, mi R156 通过转录后水平抑制拟南芥 SPL 转录因子的表达从而调控植株生长发育、形态建成、花青素积累、孢囊发育、赤霉素合成、信号转导, 以及胁迫响应等生理过程2-7。目前在拟南芥中已鉴定出 17 个 SPL 家族成员, 其中 11 个成员SPL2、SPL3、SPL4、SPL5、SPL6、SPL9、SPL10、SP
12、L11、SPL13a/b 和SPL15 具有 mi R156 识别位点8-10, 并且受其负调控。不同的 SPL 成员在拟南芥生长阶段发挥着不同的作用, ATSPL3、ATSPL4、ATSPL5 调控阶段转变和开花3,10;ATSPL8 参与花药发育和赤霉素合成11;At SPL9 和 At SPL15 调控叶原基长度、器官大小、芽叶成熟5,12;ATSPL2、ATSPL10、ATSPL11 在生殖生长阶段调控芽叶生长13。在逆境胁迫下, Cui 等认为 mi R156 可被作为信号分子, 通过 mi R156-SPL9-DFR 的途径参与植物生长和非生物胁迫14。拟南芥在响应高温胁迫时, m
13、i R156 表达量会急剧增加, SPL2 和 SPL11 则表现降低趋势15。苜蓿16在干旱胁迫下, mi R156 的过表达使其有更强的耐旱性, mi R156 通过下调 SPL13 的表达来提高抗旱性。对棉花进行盐胁迫和干旱胁迫发现, mi R156 通过负调控SPL2 来提高耐受力17。磷酸盐胁迫下, 拟南芥的根际酸化能力与 mi R156 呈正调控关系, 与 SPL3 呈负调控关系18。近年来, SPL 转录因子在越来越多的物种如枳19、水稻8,20、花生21、陆地棉22、草莓23等植物中被克隆。mi R156-SPLs 的功能与分子机制的研究成为热点, 越来越多的功能被挖掘。然而目
14、前研究的植物大多是草本植物, 对于茶树这样的木本植物研究较少。本研究基于茶树转录组数据, 采用 c DNA末端快速扩增 (rapid amplification of c DNA ends, RACE) 方法克隆出 Cs SPL6 和 Cs SPL9 的基因全长, 检测 Csn-mi R156a 和 Cs SPLs 在茶树不同叶位、不同品种 (系) 和高温胁迫中的表达量, 为揭示 Csn-mi R156a-Cs SPLs 在茶树生长发育、抗逆性中的作用提供依据。1 材料与方法1.1 实验材料及处理植物材料选取生长势不同的东北抗、黄山白茶 1 号 (C.sinensis cv.Huangshan
15、baicha) 、舒茶早 (C.sinensis cv.Shuchazao) 、特香早 (C.sinensis cv.Texiangzao) 4 个茶树品种 (系) 。茶树新株系东北抗是本课题组从祁门槠叶群体种中筛选的优良单株, 通过多年观察, 发现该株系具有生长旺盛、速度快和耐高温的特性。不同叶位:选取芽、第 1 叶、第 3 叶、第 5 叶、第 7 叶。高温胁迫处理参数:温度为 38/28, 相对湿度为 80%/70%, 平均光强为 600molms, 光周期为 14 h/10 h。以处理 0、1、2、3、4 d 时间点的芽下第 2 叶为材料。每个样品均为 3 个生物学重复, 样品采集后立即
16、投入液氮处理, 冷冻后80储存备用。1.2 茶树生长势特性测定新梢生长量测定:腋芽萌发时选取生育期基本一致的进行挂牌, 每个品种 (系) 10 株, 每隔 3 d 测定芽叶生长量24。光合作用的测定:取芽下第 3 叶为测试材料, 采用 LI-COR 6400 便携式光合测定系统分析仪 (LI-COR, 美国) 在光强 1 200molms, 气体流速500mols, CO 2浓度 500molmol, 叶温 (251) , 空气湿度 (705) %条件下测定净光合速率 Pn、蒸腾速率 Tr、气孔导度 Gs。1.3 总 RNA 提取及 c DNA 的合成实验材料经液氮研磨后, 使用 RNAiso
17、 Plus 提取试剂盒及 Fruit-mate for RNA Purification (Ta Ka Ra, 大连) 提取 RNA。用核酸定量仪 (Thermo Electron, 美国) 测定总 RNA 样品的浓度、纯度, 用 1.2%变性琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA完整性, -80储存备用。总 RNA 反转录为 c DNA 使用 Prime Script1st Strand c DNA Synthesis Kit (Ta Ka Ra, 大连) 试剂盒。1.4 Cs SPL6 和 Cs SPL9 基因全长克隆从茶树转录组数据中获得 2 个 SPL 转录因子序列, 利用 Primer 5.0
18、 设计引物 (表 1) , 验证片段后通过 SMART-RACE-PCR 技术对 Cs SPL6 和 Cs SPL9 的 3和 5端进行扩增。第一轮扩增以 SMART RACE c DNA Amplification Kit (Clontech, 美国) 合成 3和 5c DNA 第一链为模板, 扩增体系为50L:10LA Taq buffer (Mgplus) 5L, UPM (10molL) 5L, d NTP Mixure (2.5mmolL) 4L, RACE GSP primer (10molL) 1L, c DNA 1L, LA Taq (5 UL) 0.3L, dd H 2O 3
19、3.7L。PCR 扩增参数为:943 min;9430 s、722 min, 5 个循环;9430 s、7030 s、722 min, 5 个循环;9430 s、6530 s、722 min, 25 个循环;72延伸 10 min。第二轮扩增以第一轮稀释 50 倍的扩增产物为模板, 反应体系同第一轮扩增。反应参数:943 min, 9445 s, 6745 s, 722 min, 30 个循环;7210 min。产物用 Axy Prep DNA Gel Extraction Kit (Axygen, 美国) 试剂盒进行回收, 连接 p MD 19-T 载体, 转化至大肠杆菌 DH5 感受态细胞
20、, 菌落 PCR 挑选阳性克隆 (至少 3 个重复) , 测序由上海生工有限公司完成。获得全长序列后, 跨开放阅读框 (ORF) 设计特异引物, 验证序列完整性。1.5 序列生物信息学分析用 Edit Seq 和 Meg Align 软件查询 ORF 框、氨基酸序列。蛋白质等电点和分子量用 Edit Seq 软件分析, Ex PASY-Prot Scale (http:/web.expasy.org/protscale) 预测亲/疏水性, Signal P (http:/www.cbs.dtu.dk/services/Signal P-2.0) 预测信号肽, TMHMM (http:/www.
21、cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0) 预测跨膜螺旋, Net Plos2.0 Predict Protein (https:/ppopen.informatik.tu-muenchen.de) 预测蛋白质的亚细胞定位, SOPMA (https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop ma.html) 预测蛋白质的二级结构, SWISS-MODEL (https:/swissmodel.expasy.org/interactive) 模拟蛋白质的三维结构, 保守结构域的预测在 NCBI (htt
22、ps:/:6443/Blast.cgi) 中进行, 用 Clustal Omega (http:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo) 比对蛋白质的同源性序列, 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 、水稻 (Oryza sativa) 、葡萄 (Vitis vinifera) 、小立碗藓 (Physcomitrella patens) SBP 转录因子基因序列参照文献21, 利用 MEGA5.125软件并通过邻接 (N-J) 算法构建系统进化树。1.6 茶树 Csn-mi R156a 和 SPLs 的表达分析荧光定量分析东北抗不同叶位、4 个品种
23、 (系) 间和高温胁迫下 Csn-mi R156a和 SPLs 的表达。根据 mi R156a 成熟序列设计具有茎环结构的反转录引物和 mi R156a 荧光定量正反向引物26。Csn-mi R156a 荧光定量内参为 Csn-pc-3p-22227, Cs SPLs 的内参为 GAPDH。荧光定量实验体系和反应参数按照SYBRPremix Ex Taq II 试剂盒 (Ta Ka Ra, 大连) 说明进行。采用 CFX96 Real-Time PCR Detection System 进行 PCR 扩增, 每个样品 3 次生物学重复。验证目标基因和内参基因的扩增效率和扩增范围, 采用 2 法
24、进行相对表达量的计算。表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 下载原表 2 结果与分析2.1 Cs SPL6 和 Cs SPL9 的全长克隆和序列分析以 Cs SPL6-3RACE 和 Cs SPL6-5RACE 引物分别扩增出约 1 000 bp (图 1-A) 和 750 bp (图 1-B) 的片段, 拼接后利用引物 Cs SPL6-F/R 验证 ORF 框完整性 (图 1-C) 。经测序和分析, 得到 Cs SPL6 全长为 2 318 bp, 包含 1 个 1 688 bp 完整的 ORF 框, 编码 1 个由 555 个氨基酸组成的蛋白 (图 2) 。预
25、测蛋白分子量为 60.44 k Da, 等电点为 6.58。以引物 Cs SPL9-3RACE 扩增出 500 bp (图 1-D) 左右的片段, Cs SPL9-5RACE 扩增出 1 200 bp (图 1-E) 左右的条带, 利用 Cs SPL9-F/R 验证 ORF 框完整性 (图 1-F) 。测序分析表明, 茶树 Cs SPL9 基因全长 1 954 bp, 完整 ORF 框大小为 1 116 bp, 编码 371 个氨基酸 (图 2) 。预测的蛋白质分子量是 39.62 k Da, 等电点为 8.3。Cs SPL6 和 Cs SPL9 序列提交至 Gen Bank, 登录号 KX8
26、08499 和 KY569510。Cs SPL6 和 Cs SPL9 蛋白为亲水性蛋白, Score 值小于 0.5, 不存在信号肽。Cs SPL6 不存在跨膜结构, 不属于跨膜蛋白。在 Cs SPL9 上发现 1 处由内到外的跨膜螺旋和 1 处由外到内的跨膜螺旋, 存在跨膜区域, 属于跨膜蛋白, Cs SPL6和 Cs SPL9 定位于细胞核。Cs SPL6 由 9.55%的 -螺旋 (Alpha helix) 、11.89%的 -折叠 (Beta sheet) 和 55.41%的无规则卷曲 (Random coil) 组成, Cs SPL9 由 19.41%的 -螺旋、8.63%的 -折叠
27、和 52.02%的无规则卷曲组成。Cs SPL6 和 Cs SPL9 属于 / 型 (图 3) , 具有高等植物转录因子特有的SBP 结合域。图 1 茶树 Cs SPL6 和 Cs SPL9 全长 c DNA Fig.1 Full c DNA sequences of Cs SPL6 and Cs SPL9 in C.sinensis 下载原图注:M:DL2000, 1:扩增产物。A:Cs SPL6-3端产物, B:Cs SPL6-5端产物, C:Cs SPL6 ORF 扩增产物, D:Cs SPL9-3端产物;E:Cs SPL9-5端产物, F:Cs SPL9 ORF 扩增产物。Note:M
28、:DL2000, 1:Amplification products.A:Amplification products of the Cs SPL6-3end, B:Amplification products of the Cs SPL6-5end, C:ORF products of the Cs SPL6 c DNA, D:Amplification products of the Cs SPL9-3end, E:Amplification products of the Cs SPL9-5end, F:ORF products of the Cs SPL9 c DNA.图 3 预测的 C
29、s SPL6/Cs SPL9 蛋白三级结构 Fig.3 Tertiary structure prediction of protein Cs SPL6/Cs SPL9 下载原图注:黄色代表 -折叠, 粉色为 -螺旋, 蓝色为无规则卷曲。Note:Yellow represents beta sheet, pink means alpha helix and blue for the random coil.图 2 Cs SPL9 和 Cs SPL6 c DNA 全长与推导的氨基酸序列 Fig.2 Full c DNA sequences of Cs SPL9 and Cs SPL6 and
30、their deduced amino acids 下载原图图 2 Cs SPL9 和 Cs SPL6 c DNA 全长与推导的氨基酸序列 Fig.2 Full c DNA sequences of Cs SPL9 and Cs SPL6 and their deduced amino acids 下载原图注:浅灰色阴影部分显示为 SBP 结构域;下划线为两个锌指蛋白域 Zn-1 和 Zn-2, 含有半胱氨酸和组氨酸;深灰色阴影部分表示双向核定位信号;虚线是 mi R156的识别位点。Note:SBP domain is light grey shaded area.The two under
31、line area is conserved cysteine and histidine stands for the two zinc finger protein domain Zn-1 and Zn-2 respectively.Dark grey is bi-directional nuclear localization signal.The sequences dotted underlined is the mi R156 recognition sites.2.2 Cs SPL6 和 Cs SPL9 的进化分析和氨基酸序列的比对为进一步分析 Cs SPL6 和 Cs SPL9
32、 转录因子的进化, 将 Cs SPL6 和 Cs SPL9 的氨基酸序列与 34 条双子叶植物 (拟南芥和葡萄) 、19 条单子叶植物 (水稻) 、13 条无花植物 (小立碗藓) 的 SBP 序列进行比对, 参考 Li21的分类方法, 构建同源进化树, SPL 转录家族被分成 6 组 (图 4) 。Cs SPL6 与 At SPL6 (At1g69170) 、Vv SBP1 (XM002273498.1) 、Vv SBP16 (XM002265167.1) 聚在一类, 属于 G2 组;Cs SPL9 与 Vv SBP8 (XM002278476.1) 、At SPL9 (At2g42200)
33、、At SPL15 (At3g57920) 同处一个分支, 属于 G1 组, 推测 Cs SPL9 与 Vv SBP8、At SPL9、At SPL15 具有相似的生物学功能。而小立碗藓 SBP转录因子没有聚类在 G1 和 G2, 说明茶树 Cs SPL6 和 Cs SPL9 转录因子和小立碗藓亲缘关系比较远, 而和拟南芥、葡萄较近。不同物种的 SBP 转录因子并没有聚在一起, 演化情况可能比较复杂。图 4 茶树 Cs SPL6 和 Cs SPL9 转录因子的进化分析 Fig.4 Phylogenetic analysis of Cs SPL6 and Cs SPL9 transcriptio
34、n factors in C.sinensis 下载原图注:At:拟南芥, Os:水稻, Vv:葡萄, Pp:小立碗藓, Cs:茶树。树的分支程度根据 5000 次重复的自展率。Note:At:Arabidopsis thaliana, Os:Oryza sativa, Vv:Vitis vinifera, Pp:Physcomitrella patens, Cs:Camellia sinensis.This study employed 5000 bootstrap replication.对茶树 Cs SPL6 和 Cs SPL9 转录因子进行保守结构域预测发现 Cs SPL6 和 Cs
35、SPL9 都含有高度保守的 SBP 结构域 (图 5-A 和图 5-B) 和 mi R156a 的识别位点。通过 Blast P 同源序列检索与多序列比对, Cs SPL6 与葡萄 (XP_010663469.1) 、可可 (XP_017973789.1) 、枣 (XP_015883292.1) 相似度分别为61.10%、61.63%和 59.15%;Cs SPL9 与葡萄 (ADG36380.1) 、番薯 (XP_019186327.1) 和可可 (XP_017977243.1) 的相似度达 65.51%、54.59%和59.31%, 而且 SBP 结构域在植物中高度保守 (图 5-C) 。
36、图 5 茶树 Cs SPL6 (A) 和 Cs SPL9 (B) 转录因子的保守域预测及和同源物种SBP 结构域比对 (C) Fig.5 Prediction of Cs SPL6 (A) and Cs SPL9 (B) conserved domains and alignment of SBP domain in C.sinensis and homologous proteins in other species (C) 下载原图2.3 茶树 Csn-mi R156a 和 SPLs 表达机制分析2.3.1 不同叶位时序表达如图 6 显示, Cs SPL6 和 Cs SPL9 以及 Csn
37、-mi R156a 在不同叶位中均有所表达, 但表达量存在差异。Csn-mi R156a 在芽中表达量最高, 随着叶位的增加, 表达量依次降低;Cs SPL6 和 Cs SPL9 的表达情况一致, 表达量在芽中最低, 第 7 叶中最高, 分别是芽的 2.3 和 2.9 倍, 与 Csn-mi R156a 的表达模式相反。2.3.2 不同生长势品种 (系) 表达右图 7 可见, Cs SPL6、Cs SPL9 和 Csn-mi R156a 在 4 个品种 (系) 间表达量差异明显。Csn-mi R156a 在 4 个品种 (系) 的表达量东北抗最高, 特香早最低;而Cs SPL6 和 Cs SP
38、L9 的表达趋势一致, 与 Csn-mi R156a 呈负相关关系。新梢生长势的测定结果表明 (图 8) , 4 个品种 (系) 生长速度东北抗最快, 特香早最慢。光合指标中 (表 2) , Pn 和 Tr 结果一致, 东北抗最高, 特香早最低, 而 Gs 结果相反。生长势高的植物 Pn 和 Tr 高, Gs 低28-29, 即植物光合能力强而呼吸作用弱, 有利于干物质积累, 增加植物产量。新梢生长势和光合作用指标测定结果与 Csn-mi R156a 的表达量的趋势一致。东北抗生长速度最快, Csn-mi R156a 的表达量最高;特香早生长最慢, Csn-mi R156a 的表达量最低。图
39、6 茶树不同叶位 Csn-mi R156a-Cs SPLs 表达水平的 q RT-PCR 分析 Fig.6 Expression profiles of the Csn-mi R156a-Cs SPLs in different leaf positions 下载原图注:s:芽, 1y:第 1 叶位, 3y:第 3 叶位, 5y:第 5 叶位, 7y:第 7 叶位。小写字母表示 P黄山白茶 1号特香早舒茶早。黄山白茶 1 号和舒茶早在处理 1 天后 Cs SPL6 表达量达最高, 分别达到对照的 1.7 和 2.4 倍, 随后呈下降趋势, 仍维持很高水平;特香早经高温处理后 Cs SPL6 呈
40、波动下降趋势并在处理第 3 天降至最低。东北抗在处理的第 2 天和第 4 天 Cs SPL9 的表达量急剧增加, 是对照的 3.9 倍;舒茶早高温胁迫 1 d 后, Cs SPL9 剧增达最大值, 是对照 4.3 倍, 之后表达量下降仍高于处理前水平。高温胁迫下, Cs SPL6 的表达不受 Csn-mi R156a 调控, 而 Cs SPL9 受 Csn-mi R156a 负调控。图 9 高温处理下不同茶树品种 (系) Csn-mi R156a-Cs SPLs 表达水平的 q RT-PCR 分析 Fig.9 Expression analysis of Csn-mi R156a-Cs SPL
41、s in different varieties (strains) under heat stress by q RT-PCR 下载原图3 讨论3.1 Cs SPL6 和 Cs SPL9 的克隆及序列分析从茶树中克隆出 SPL 家族中 2 个成员Cs SPL6 和 Cs SPL9 的 c DNA 全长序列。序列分析发现, Cs SPL6 编码 555 个氨基酸, Cs SPL9 编码 371 个氨基酸。Cs SPL6 和 Cs SPL9 编码蛋白序列都含 SBP 结构域和 mi R156a 的识别位点。SBP 结构域由 79 个保守的氨基酸残基组成, 结合 2 个锌离子形成锌指结构 (Zin
42、c-finger domain) 30。2 个锌指结构均由 3 个半胱氨酸和 1 个组氨酸残基形成四面体并结合 1 个锌离子, 从而形成稳定的构象。其中 N-端构成是 Cys-Cys-Cys-His, C-端是 Cys-Cys-His-Cys, C 末端带有 1 个双向核定位信号 (Nuclear Localization Signal) KRXXXRRRK1, 与第 2 个锌指结构有部分重叠。Birkenbihl31等研究表明, 该信号肽序列可以引导 SBP 蛋白进入细胞核, 从而调控下游相关基因的转录表达。系统进化树发现茶树 Cs SPL6 和 Cs SPL9转录因子分别属于 G2 组和
43、G1 组, 并且和小立碗藓亲缘关系比较远, 而和拟南芥、葡萄较近;这可能和 SBP 转录因子序列长度、结构域起始位置、外显子数量及 mi RNA 识别位点的差异性有关19。3.2 Csn-mi R156a 和 Cs SPLs 的表达分析mi R156a 在拟南芥和大豆第 1、2 叶表达水平高, 随着叶位增加, 表达水平大幅降低32-34。mi R156a 在顶芽中表达量最高并在植物生长发育过程中与 SPL呈负相关关系35。目前研究证明 mi R156a 随发育进程表达量降低的时序降低机制可能涉及到内源信号分子响应36。在本研究中 Csn-mi R156a 与 Cs SPL6和 Cs SPL9
44、呈负调控, 推测 Csn-mi R156a 通过负调控 Cs SPL6 和 Cs SPL9 参与茶树生长过程37, 在茶树生长阶段发育和转变中起重要作用。在不同茶树品种 (系) 的表达模式中, Csn-mi R156a 表达趋势与新梢生长量以及光合指标的测定结果趋势一致, 与 Cs SPLs 呈负调控关系。目前这方面的研究较少, 初步推断 Csn-mi R156a 和 Cs SPLs 表达机制可能是茶树生长过程中的重要组成部分, Csn-mi R156a 表达量越高, Cs SPLs 表达量越低, 植物生长可能越快, 反之, 则越慢, 推测 Csn-mi R156a 和 Cs SPLs 表达机制可作为判断植物生长快慢的重要分子指标。高温胁迫下不同茶树品种 (系) 、不同处理时间 Csn-mi R156a 和 Cs SPLs 表达有所差异, 说明在高温胁迫下存在调控关系。在胁迫处理第 1 天, Csn-mi R156a 通过急剧上调减少高温对植物体的伤害, 与 Xin 等38、Stief 等15研究结果一致。芸薹属蔬菜作物受高温胁迫后, mi R156 也是下调 SPL2 来增加耐受性39。干旱条件下研究 mi R156 与其呈负调控关系的靶基因
