1、马属动物全基因组高通量测序研究进展 白东义 赵一萍 李蓓 格日乐其木格 张心壮 芒来 内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖学重点实验室 摘 要： 马属 (Equus) 动物的祖先大约在 5500 万年前出现, 经过持续分化形成现今的马、驴和斑马, 统称马属动物。马作为家畜中的重要一员, 是推动人类文明发展的载体, 在人类的饮食、战争、农耕、运输和娱乐等领域做出了巨大贡献。然而, 人类为了满足需求, 或多或少影响着马的进化方向, 从而在长时间自然和人工选择过程中形成了多种独具特色性状的不同马种。驴和骡在全球的存栏量也较多, 在人类的生产和生活中起到的作用同样不可忽视, 不
2、但为人类提供了生产力而且还提供了食物和营养保健品。可见, 马属动物对人类的重要性。近年来, 高通量测序技术和生物信息学分析方法被广泛运用于家畜的遗传学研究。人们利用高通量测序手段探索马属动物在进化过程中的种群变化历史, 解析形成独特性状的分子机制, 为其育种工作提供有效的数据支持。本文综述了马属动物全基因组高通量测序的研究进展, 以及利用该技术在马属动物的进化历史和功能基因挖掘研究领域所取得的成就, 以期今后对马属动物的深入研究、产业开发和利用等方面提供参考信息。关键词： 马属; 全基因组; 高通量测序; 进化; 作者简介：白东义, 博士, 讲师, 研究方向:马属动物遗传育种与繁殖。E-mai
3、l:作者简介：芒来, 双博士, 教授, 研究方向:马属动物遗传育种与繁殖。E-mail:收稿日期：2017-03-31基金：国家自然科学基金项目 (编号:31472070, 31360538) Progress in the whole genome of Equus by using high-throughput sequencing technologiesDongyi Bai Yiping Zhao Bei Li Bou Gerelchimeg Xinzhuang Zhang Manglai Dugar-javiin Inner Mongolia Equus Genetics, Bre
4、eding and Reproduction Key Laboratory, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University; Abstract： The ancestors of the Equus lived on earth about 55 million years ago, and then they diverged and evolved into modern horses, donkeys and zebras. Equus is indispensable for human lives.
5、 Horses are key members of the livestock, domesticated for farming, transportation, recreation as well as food supply and warfare, thereby enhancing the development of human civilization. In the meantime, humans also influence horses evolution to meet their own demands, resulting in lots of differen
6、t horse breeds with specific traits after a prolonged natural and artifi-cial selection. Besides horses, donkeys and mules in the Equus genus also benefit human lives, providing essential work force and also food and nutrition products. The advent of the high-throughput sequencing technologies and b
7、ioinformatics analysis has transformed the genetics research of the livestock. In this review, we summarize research progress in the whole genome of Equus by using high-throughput sequencing technologies. Moreover, we describe the achievements on evolution history and functional gene research of Equ
8、us using the technology. We look forward to providing further insights for better industrialization and utilization of Equus.Keyword： Equus; whole genome; high-throughput sequencing; evolution; Received： 2017-03-31马属动物 (Equus) 为奇蹄目 (Perissodactyla) 、马科 (Equidae) 1, 包括马 (E.ferus) 、驴 (E.Asinus) 和斑马 (E
9、.ippotigris) 。通过化石研究已经证实, 马属动物的祖先始新马出现于 5500 万年前的北美2,3, 其身体如同狐狸样大小, 以多汁嫩叶为食, 前足有四指, 后足有三趾4,5。马属动物在中新世中、晚期及更新世晚期达到繁盛时期, 形成了大约 20 个属、100 多个种2,6。此时马属动物的祖先已通过白令海峡, 先后从北美扩散到欧亚大陆, 但没有留下后代7。大约在 400450 万年前的上新世, 马属动物的祖先在北美持续演化, 形成了上新马, 是现代马属的最近祖先8。大约在 200 万年前, 驴和斑马的祖先穿过白令海峡首先来到欧亚大陆, 并先后两次穿越欧亚大陆抵达非洲, 分别形成了现在的
10、亚洲野驴 (Equus hemionus) 、非洲野驴 (Asinus africanus) 和斑马。然而, 马的祖先在大约 70 万年前才抵达欧亚大陆。有趣的是, 大约在 1 万年前, 马在其起源地美洲彻底消失, 直到公元 16 世纪西班牙人再一次把马引回了美洲9。在马属动物的演化过程中分化出很多种及亚种 (图 1) 。通过分子遗传学方法推断, 马与驴和斑马的祖先最先分化, 大约发生在 400450 万年前的北美。驴和斑马的祖先大约在 169199 万年前又开始分化8。在驴和斑马的祖先向不同方向分化后, 驴的祖先又开始不断的分化, 在 147175 万年前分化形成非洲野驴和亚洲野驴, 而亚洲
11、野驴又在 26.639.2 万年前分化成中亚野驴和西藏野驴。家驴和野驴的分化时间可追溯到 12.618.8 万年前。然而, 斑马的祖先大约在128159 万年前的非洲经历分化, 形成 3 个主要的现存斑马亚种。山斑马 (E.zebra) 最先形成, 然后分化出细纹斑马 (E.grevyi) , 平原斑马 (E.quagga) 于 70 万年前形成, 并在 23.335.6 万年前分化出现今已经灭绝的斑驴 (Equus quagga) 8,15。据最近研究发现, 家马和普氏野马 (E.f.przewalskii) 的祖先大约在 15 万年前开始分离, 但相互间的基因交流现象一直持续到 3.87.
12、2 万年前16。通过时间推断可以证实, 家马被驯化的时间远晚于家马和普氏野马的分离时间, 加之与古 DNA 的数据比较, 古 DNA 中的保守基因型在现代马种基因组中被发现, 而在普氏野马的基因组中不存在, 因此科学家们推断家马并非由普氏野马驯化而来16,17。图 1 马属动物进化关系及分化时间 Fig.1 The time line of Equus evolution 下载原图数字代表分化年代置信区间, 带箭头的线条代表两个物种之间有基因交流, 箭头方向代表基因流流向。通过研究发现, 在马属动物的进化过程中马的群体波动较大, 主要在第四纪的几次冰川期经历过 3 次遗传瓶颈18,16。然而,
13、 在家驴的进化过程中, 其种群较稳定19。研究表明, 在 2025 万年前的间冰期, 马、中亚野驴和平原斑马的群体波动较大。在 12.53.0 万年的间冰期, 马属动物大量扩张, 但细纹斑马和索马里野驴 (Equus africanus somaliensis) 的扩张信号最弱, 藏驴 (Equus kiang) 甚至没有群体扩张信号8。目前, 对马的驯化事件仍有不同的观点。有的研究证明马的驯化可能发生在欧洲的伊比利亚半岛20, 但有研究认为最早的家马起源于乌兹别克斯坦21, 也有研究认为乌克兰是家马的起源中心22, 从而形成了多起源学说。但最被广泛接受的是家马起源于 5500 年前的哈萨克斯
14、坦23。对家驴的起源研究相对较少, 普遍认为在 5000 年前的埃及将非洲野驴驯化成了家驴24,25。马、驴和斑马本是 3 个独立的物种, 已出现生殖隔离。但有趣的是, 马和驴、驴和斑马杂交都能产生后代26,27。骡子是马和驴的杂交体, 分为马骡 (驴马) 和驴骡 (马驴) 。通常认为雄骡没有生殖能力, 但有对雌骡产驹的相关报道28,29, 并有报道称马骡的受孕率显著高于驴骡 (约 7 倍) 30。通过比较马和驴的核型, 推测一匹具有生殖能力的骡子在减数分裂时可能会形成六价体30,31。普氏野马和家马经历过一次罗伯逊易位导致其核型的差异, 其杂种子一代在减数分裂时会形成三价体, 能够形成成熟的
15、生殖细胞, 并能繁殖后代, 但其机理还未得到解析。在马属动物中, 鞑靼野马 (E.f.gmilini) 、斑驴、叙利亚野驴 (E.h.hemippus) 和阿特拉斯野驴 (Equus africanus atlanticus) 已灭绝。鞑靼野马曾经广泛分布于欧洲, 早在 20 世纪 80 年代末已经灭绝。斑驴是平原斑马的一种, 据记载于 1883 年灭绝, 与斑马和驴杂交出来的后代不同, 其具有正常的生殖能力。叙利亚野驴分布于叙利亚东北部的高原, 于 1928 年灭绝。阿特拉斯野驴曾经分布于北非和撒哈拉的部分地区, 对其确切的灭绝时间没有详细的记载。普氏野马是现存唯一的马的野生种16, 也曾一
16、度濒临灭绝, 据记载曾经只留有 12 个个体, 后来经人工干预扩繁后放回大自然, 再一次得到了大量的繁殖, 现大约有 2000 余匹。通过对普氏野马基因组杂合度的研究, 表明其存在高度的近交现象, 这与其由 12 匹基础马、4 个母系保种而来的事实相符32。1 马属动物染色体快速进化马属动物的分化在过去极短的时间内快速完成33。在这种演化过程中伴有剧烈的染色体重排, 从而导致各物种间的核型差异。研究发现, 马属动物在进化过程中至少经历了 9 次着丝粒移位, 而其中 6 次发生在驴亚属中34。通过对纯血马全基因组测序研究, 发现其第 11 号染色体的着丝粒是一个崭新的着丝粒。在另一项研究中通过比
17、较马和家驴的染色体, 发现马的第 1 号染色体和第 31 号染色体与家驴第 1 号染色体高度同源, 但经历过染色体融合和臂间倒位34,35。而马的 7 号染色体与家驴第 20 号染色体高度同源, 也发生过臂间倒位36。通过全基因组测序研究发现, 驴和蒙古马基因组与纯血马基因组相比存在大量的大片段重排18,19。家驴第 15 号染色体的着丝粒为新着丝粒, 同时还经历过臂间倒位37,38。而对平原斑马的研究发现, 第 12 号染色体可能发生了小范围的着丝粒移位或小片段的臂间倒位, 而且还发现第 20 号染色体和第 17 号染色体为新的着丝粒39,40。通过比较家马、家驴和山斑马的 X 染色体形态,
18、 发现家驴 X 染色体由于小片段的臂间倒位, 导致其着丝粒位置的移动41,42。通过比较马、驴和斑马共 7 个亚种的染色体形态, 揭示马属的多个染色体局部重排43。对驴和斑马 6 个现存亚种的染色体脆性进行研究发现, 马与驴和斑马发生物种分离伴随着高频的染色体改变, 山斑马的染色体丢失比获得高出 4 倍, 导致其染色体数最少8。总结以上研究结果, 马属动物在进化过程中染色体重排速率极大, 平均每百万代为 2.922.2 次44, 导致马属动物染色体从 400 万年前的 3842 对18,45形成现今的 1633 对, 至少发生了 8.3417.7 次的染色体获得或丢失8, 从而导致马属动物间染
19、色体数差异较大 (表 1) 。2 马属动物全基因组测序对马属动物进化和性状的研究, 以往多采用线粒体 DNA 的部分或完整序列, 以及核基因的微卫星序列。近年来, 随着测序技术和生物信息学的飞速发展, 马属动物的基因组陆续被测定, 在马属动物的进化和功能基因挖掘方面取得了巨大突破 (表 2) 。2009 年通过一代测序技术完成了第一个马全基因组测定及组装46, 这项工作对于马属动物的遗传学研究具有里程碑式的意义。在该项研究中确定了马的基因组大小为 2.52.7 Gb, 共有 20 322 个编码基因, 发现其第 11 号染色体的着丝粒是一个崭新的着丝粒。更有意义的是, 发现马的基因组与人的基因
20、组高度相似, 拥有 53%的共线性, 这为后续的研究奠定了基础。随后, 分别在 2014 和2015 年对普氏野马和蒙古马18、蒙古野驴和家驴的全基因组进行了从头组装19, 但这两项研究都是基于高通量测序技术, 而且关注的问题主要是马属动物的染色体不稳定性。表 1 马属动物分类及染色体数8Table 1 The classification and chromosome numbers of Equus 下载原表 表 2 马属动物全基因组测序成果 Table 2 A summary of whole-genome sequencing of Equus 下载原表 随着二代测序技术和各种生物信息
21、学软件的涌现, 2012 年采用高通量测序技术完成了夸特马的全基因组重测序工作47。该研究采用了重测序方案, 所以将未比对到参考基因组上的 Unmapped 序列进行了从头组装, 从而实现挖掘其特有基因, 为后续的研究提供了新思路。另外, 相比纯血马的基因组研究, 获得了SNPs 以外的 Indels 和 CNVs 变异类型, 并发现这些变异主要富集在感官知觉、信号转导、免疫和防御通路, 为后续的深入研究指明了方向。2014 年开展了对印度马种马瓦里马的重测序工作48, 这是测定的第一个亚洲马种的全基因组序列。该研究发现 TSHZ1 基因与马瓦里马的耳尖内翻修饰有关, 这是首次将性状和基因进行
22、了很好的关联。从此, 人们开始越来越多的采用全基因组数据解析马性状形成的分子机制。2012 年, 通过对不同步法冰岛马进行全基因组测定, 发现 DMRT3 基因的终止密码子提前对马的运动模式有重要的影响49。2016 年, 发现马的灰褐色被毛是由于毛囊中 TBX3 基因转录因子的定位表达引起毛囊黑色素不对称沉积而形成50。2015 年, 通过对现代雅库特马的基因组进行测定, 对马耐寒性状形成的分子机制进行了很好的揭示, 首次提出马属动物环境适应性与其基因组的关系51。马属动物间的进化关系一直备受关注。2014 年通过对所有驴和斑马亚属的 6 个种以及 1 匹斑驴的基因组进行测定8, 发现了与嗅
23、觉、免疫应答、发育、运动和行为有关的 48 个基因受到了正选择, 并揭示在最后 40 万年马属动物的种群大小经历了强烈的波动, 并首次提出马、驴和斑马之间存在基因交流。这项研究与染色体重排导致物种分化这一观点产生分歧, 也促使人们认识到马属动物是研究染色体结构、基因流和物种分化的最佳模型。3 马属动物古基因组测序马的全基因组测定通常从活体血液或毛囊中提取基因组。随着生物技术的不断发展, 近年来古 DNA 全序列的研究成为热点, 在解析有关马进化过程的问题中起到了关键作用, 对马属动物驯化相关问题的探讨大部分都借助了古 DNA 的研究 (表 3) 。马属动物的古 DNA 提取首先是从已灭绝的马属
24、动物斑驴开始8,52, 从此真正开启了对马古 DNA 全序列的研究, 在质量上也有了逐渐的提高, 现在已经能够完成与活体基因组相同水平的古基因组提取和测定。马的古 DNA 研究主要揭示了 3 个关键性问题:首先, 发现现代雅库特马不是由当地的马种驯化而来, 很可能是随着雅库特人的迁移而被引入51, 很好的解析了一个马种的来源问题, 为马属动物不同品种的起源研究提供了研究方案;其次, 发现唯一现存的野马品种普氏野马并不是家马的祖先16,53, 为进一步研究家马和野马之间的关系提供了参考;最后, 发现马在被驯化后导致很多有害突变以及遗传多样性和古 DNA 片段的丢失, 而现代马 Y 染色体极少的单
25、倍型并非是与驯化时马的性别比例相关, 而是受当时育种策略的影响54, 并发现在古代马种就有与现代马性状密切相关的基因型, 说明人们在驯化马的初期就已经非常关注这些性状。表 3 马属动物古基因组测序成果 Table 3 A summary of ancient-genome sequencing of Equus 下载原表 4 结语与展望马属动物是人类文明形成过程中不可或缺的重要家畜之一。随着社会经济水平不断提高和人类需求不断变化, 马属动物的专门化品种也将越来越多, 随之而来的是这些特殊性状形成的机理将成为被关注的焦点。为解析这些性状形成的分子机理, 运用多组学结合的方法势在必行。随着技术的更
26、新, 测序成本也将会大大降低。因此, 应当加大测序深度和个体数量, 从现在的个体测序转为群体测序, 逐渐形成马属动物泛基因组数据库, 必要时可提出“万马基因组计划”, 从全球马种的角度解析马种之间的关系, 甚至进一步分析马与人类之间的关系。另外在功能基因的验证上可以建立马属动物不同组织的细胞系进行不同基因的定量表达分析或运用模式动物进行辅助验证, 这些信息必将能够对马属动物新品种选育提供可靠的信息。另外, 马属动物的进化关系和驯化事件永远是人们关注和研究的主题, 虽然其过程越来越清晰, 但还有很多未能解析的事件, 比如现代家马与普氏野马之间的关系、各马种的迁徙路线以及与人类迁徙路线的关系等。相
27、信随着三代测序、Hi-C 等新技术的到来和生物信息学分析水平的不断提高, 人们获得的有效信息将会越来越准确, 从而能够通过分析基因组上留有的印记, 将人们关注的与马属动物相关的科学问题一一解开。参考文献1Nowak RM.Walkers mammals of the world.Baltimore:Johns Hopkins University Press, 1999:161192. 2Simpson GG.The major features of evolution.New York:Columbia Univ.Press, 1953:87. 3Semprebon GM, Rivals
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