1、啤酒酵母 Ubr1 野生型和缺失型菌株的比较蛋白组学分析 彭健 张耀婷 李慧 肖小龙 韦超盈 周宇筝 卢爱 张礼铭 周梅 陈杰 丁成明 夏赞贤 中南大学湘雅医院 中南大学生命科学学院 摘 要： 目的 寻找并验证 Ubr1 泛素化底物蛋白大规模筛选方法的可行性。方法 通过对啤酒酵母 RJD347 (Ubr1 野生型) 和 AVY26 (Ubr1 缺失型) 的差异蛋白质组学比较, 分析酵母中可能存在的 Ubr1 直接或间接作用的底物蛋白。进一步通过外源表达实验验证差异蛋白与 Ubr1 之间的相关性。结果 组学研究得到 249 个差异表达蛋白, 其中 145 个蛋白在 AVY26 (Ubr1 缺失型
2、) 中表达上调。选取其中 40个并外源表达验证 5 个差异蛋白 MLC2、SCD6、AR G1、HO G1 及 R TF1 与 Ubr1具有相关性, 受泛素连接酶 Ubr1 的泛素化调控。结论 建立 Ubr1 泛素化底物候选蛋白库, 同时验证出 5 个潜在 Ubr1 泛素化底物蛋白。关键词： 啤酒酵母; 泛素连接酶 E3 成分 N-识别蛋白 1; 泛素化; 蛋白质组学; 作者简介：夏赞贤, E-mail:收稿日期：2017-04-11基金：国家自然科学基金联合项目 (No:U1603126) Comparative proteomic analysis of Ubr1 wild type an
3、d deletion type of Saccharomyces cerevisiaeJian Peng Yao-ting Zhang Hui Li Xiao-long Xiao Chao-ying Wei Yu-zheng Zhou Ai Lu Li-ming Zhang Mei Zhou Jie Chen Cheng-ming Ding Zan-xian Xia Xiangya Hospital, Central South University; School of Life Sciences, Central South University; Abstract： Objective
4、To justify the rationality of proteomic screening on a large scale and identify potential substrates of Ubr1 with the approach. Methods In this work, comparative proteomic analysis between RJD347 (Ubr1 wild type) and AVY26 (Ubr1 deletion type) has been performed to screen the possible substrate prot
5、eins of Ubr1. Moreover, the correlation between the differentially expressed proteins and Ubr1 was further verified by protein work. Results In total, 249 proteins which were differentially expressed were identified, of which 145 proteins were up-regulated in AVY26. Furthermore, the protein work con
6、firmed 5 proteins including MLC2, SCD6, ARG1, HOG1 and RTF1 that were closely related to Ubr1. Conclusions A massive database of 249 proteins that are differentially expressed between RJD347 and AVY26 is established. Five potential substrates of Ubr1 ubiquitination proteins is identified, which prov
7、ides the experimental basis for further understanding of biological processes of Ubr1.Keyword： Saccharomyces cerevisiae; ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 1; ubiquitination; proteomics; Received： 2017-04-11泛素 (ubiquitin) 是一种包含 76 个氨基酸并存在于所有真核生物中的小分子蛋白1。泛素化修饰参与细胞周期调控、细胞增殖和凋亡、脱氧核糖核酸 (de
8、oxyribonucleic acid, DNA) 损伤、基因表达、信号传递及炎症反应等几乎一切生命活动2-3, 并且与肿瘤4、心血管等5疾病的发生密切相关。在泛素化修饰过程中, 泛素连接酶对底物的识别是决定泛素化修饰特异性的关键6。泛素连接酶 E3 成分 N-识别蛋白 1 (ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin1, Ubr1) 已被证明是 N 端规则信号通路最重要的 E3 连接酶, 能识别含不稳定氨基酸末端的蛋白质7, 结构上存在 3 个底物结合位点, 分别能特异性结合蛋白质的碱性 N 端残基, 大的疏水性 N 端残基, 以及分子内
9、包含 Ubr1结合结构域的转录抑制因子 CUP98。在啤酒酵母中, Ubr1 通过泛素化降解转录抑制因子 CUP9, 从而调控寡肽/二肽转移蛋白 2 (peptide transporter 2, PTR2) 的表达, 促进酵母对寡肽和二肽的吸收8。Ubr1 在人体组织和细胞中也有表达, 且与人肿瘤蛋白 p53 诱导蛋白 3 (TP53I3) 的泛素化降解有关9。此外, 有研究表明, Ubr1 作为 N 端规则信号通路上的泛素连接酶, 能够识别细胞质内错误折叠的蛋白并使之通过泛素-蛋白酶体途径降解10。然而, 目前研究确定的 Ubr1 泛素化底物数量有限, 绝大多数 Ubr1 的底物尚未被发现
10、, 缺乏系统性的底物筛选研究。鉴定 E3 连接酶的底物不仅可以使笔者了解 E3 连接酶参与到的生物学过程, 而且有助于笔者深入研究该 E3 连接酶催化底物泛素化的分子机制。传统的研究E3 连接酶底物的方法通常是利用酵母双杂交等技术筛选相互作用的蛋白质11, 再通过体外泛素化反应和体内泛素化反应的方法确定与该 E3 连接酶相互作用的蛋白质是否是其底物。但该技术通量低, 效率不高12。因此, 筛选鉴定泛素化底物是当前泛素化研究的主要难点。蛋白质组学是后基因组时代主要的研究方法之一, 能够在蛋白质水平上直接、大规模研究基因功能。YUMIMOTO 等13采用差异蛋白质组质谱鉴定方法对 F-box 族的
11、泛素连接酶进行底物筛选, 鉴定到 515 个与 3 个 E3 连接酶相互作用的蛋白。因此, 差异蛋白质组质谱鉴定法是分析泛素连接酶底物的有力工具13。酵母作为模式生物, 不仅具有原核生物操作简单、生长快速的特点, 并且还具有真核细胞翻译后修饰功能的优势14。因此, 本实验通过对 Ubr1 野生型RJD347 及 Ubr1 缺失型 AVY26 的比较蛋白质组学研究, 分析啤酒酵母中可能存在的 Ubr1 直接或间接作用的底物蛋白。1 材料与方法1.1 菌株及主要试剂1.1.1 菌株Escherichia coli DH5 (由本实验室提供) , 酵母菌株 (MATaura 3-52) 8、AVY2
12、6 (MATaura3-52 Ubr1, Hi3G) 8、Ubr1 野生型 (Saccharomyces cerevisiae SC295) 、 (MATGAL4 GAL80 ura 3-52、Leu 2-3、112 reg1-501 gal1 pep 4-3) 7及 Ubr1 缺失型Saccharomyce scerevisiae SC295 (Ubr1) (SC295ubr deleted) 7 (由本实验室构建保存7) (见表 1) 。1.1.2 主要材料和试剂表达载体 p FLAGUBR1-SBX (由本实验室构建并保存) , 鼠抗 Flag 单克隆抗体 (美国 Sigma 公司) 、
13、辣根过氧化物酶 HRP-兔抗鼠抗体 (上海 Beyotime Biotechnology 公司) 、内切酶 Xho和 Sal及 T4 连接酶 (美国 New England Biolabs 公司) , 其他化学试剂如组氨酸、尿嘧啶、聚乙二醇 PEG3350、醋酸锂及单链鲑鱼精子等均为国产分析纯。实验所用菌株及载体信息见表 1。表 1 引物设计 下载原表 1.2 菌体蛋白样品的准备挑取 RJD347 和 AVY26 分别接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 (YPD 培养基) 中, 30培养至菌体 OD600 约为 0.75, 离心收集菌体, 用酵母裂解缓冲液 (SDT 缓冲液) 重悬菌体, 经 Fa
14、st Prep-24 高速均质器 (美国 MP Biomedicals 公司) 裂解 60 s, 13 000 r/min 离心, 上清液经蛋白样品酶解 (filter-aidedsample preparation, FASP) 用于质谱分析。1.3 质谱分析Q Exactive HF 质谱仪 (美国 Thermo Fisher Scientific 公司) 与液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 系统联用, 对肽段样品进行检测。1.4 质粒构建及酵母转化1.4.1 质粒构建以提取的酵母基因组 DNA 为模板, 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR
15、) 扩增 5 个差异蛋白 (MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 和 RTF1) 基因, PCR 所用引物设计见表 1。Xho和 Sal双酶切扩增片段及 p FLAG-UBR1-SBX 载体片段, 胶回收酶切产物, 酶连过夜后转化至 Escherichia coli DH5, 涂布于含氨苄的 LB 培养板, 37过夜培养, 筛选阳性单克隆菌落, 提取质粒, 双酶切鉴定后取阳性克隆质粒送铂尚生物公司测序。1.4.2 酵母转化取对数生长期的 SC295 和 SC295 (Ubr1) 菌液离心, 去上清液, 磷酸盐缓冲液 PBS 冲洗 2 次, 实验组取 1g 质粒 (加无菌水至 34l) 、对照
16、组 (无菌水34l) 分别加入适量 PEG3301、醋酸锂、鲑鱼单链精子后转化至 SC295 和SC295 (Ubr1) 的沉淀中, 42温浴 40 min, 加入 1 ml YPD, 30摇床培养23 h, 涂布于 SD-L 培养板, 30培养 23 d, 挑取单克隆菌液进行 PCR 验证。1.5 We s te rn blot 检测挑取阳性单克隆菌落, 经 10%的聚丙烯酰胺凝胶分离后, 电转移至聚偏氟乙烯PVDF 膜上, 以 5%脱脂牛奶室温摇床封闭 1 h, 加入鼠抗 Flag 单克隆抗体, 室温摇床孵育 2 h, 加入 HRP 标记的兔抗鼠 Ig G, 室温摇床孵育 1 h, ECL
17、 发光成像。1.6 统计学方法采用 DAVID 在线对酵母细胞胞内差异蛋白进行功能注释聚类分析;应用 R 语言“heatmap”包绘制蛋白差异表达聚类图。2 结果2.1 RJ D347 与 AVY26 胞内蛋白组学差异分析RJD347、AVY26 胞内总蛋白质谱分析共检测到 2 388 种蛋白, 其中有 249 种蛋白在 RJD347 (Ubr1 野生型) 和 AVY26 (Ubr1 缺失型) 中不同 (见图 1) , 该蛋白中, 145 个蛋白在 AVY26 中表达上调。由于 Ubr1 已被证明是 N 端规则信号通路最重要的 E3 连接酶, 因此在 AVY26 中, Ubr1 泛素化底物的含
18、量上升。由此可见, 质谱结果检测到的 145 个上调蛋白可能是 UBR1 潜在的泛素化底物。此外, 结果发现 AVY26 中有 104 个蛋白表达呈下调趋势 (见图 1) , 质谱结果也显示, PTR2 蛋白在 AVY26 中含量较野生型减少 (见表 2) 。笔者筛选 RJD347与 AVY26 蛋白表达差异倍数较大的 40 种蛋白进行进一步分析 (见表 2) , 表 3分别列出 AVY26/RJD347 (A/R) 胞内蛋白差异倍数 Ratio 等相关信息。其中Ratio (A/R) 1 表示该蛋白在突变菌株中升高, Ratio (A/R) 1 为蛋白在突变菌株中降低。表 3 中列举在 AV
19、Y26 胞内蛋白含量上升的 20 种蛋白, 该上调的蛋白可能是 E3 连接酶 Ubr1 潜在的泛素化底物。进一步通过数据库查找及文献比对, 发现差异倍数较大的蛋白如 MLC2、SCD6 及 ARG 家族 (ARG1、3、4、5、6和 7) 、HOG1、GDH1、RTF1、AKR1、HXT4 及 SMC3 目前还未有研究报道与 Ubr1泛素化调节相关。见表 2 和图 2。2.2 外源验证差异蛋白与 Ubr1 的相关性SC295 菌株因缺失 pep4-3 基因编码翻译后调控酵母液泡水解酶, 这有利于蛋白外源表达及稳定性的检测。为进一步验证上述差异蛋白与 Ubr1 之间的相关性, 笔者筛选差异最大的
20、 5 种差异蛋白进行外源验证, 在总蛋白趋于一致的情况下 (见图 2) , MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 在 SC295 中未检测到蛋白表达, 而在SC295 (Ubr1) 中检测到蛋白高表达 (见图 2AD) 。RTF1 虽然在 SC295 能够被检测, 但在 SC295 (Ubr1) 中蛋白水平明显高于野生菌 (见图 2E) 。由此看出, 在 SC295 中, Ubr1 的潜在作用底物 MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 及 RTF1 由于受 Ubr1 的调控, 可能被泛素化降解, 因而无法检测到蛋白的表达或检测到低表达;而在 SC295 (Ubr1) 中, 则呈现相反的结果
21、 (见图 3) 。因此, 可以初步确定 MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 及 RTF1 蛋白与泛素连接酶 Ubr1 相关, 并可能是泛素化 Ubr1 的直接作用底物。该实验结果也与质谱组学分析相符。图 1 RJD347 与 AVY26 胞内蛋白表达差异聚类图 下载原图A:AVY26 (n=3) ;R:RJD347 (n=3) 表 2 RJD347 与 AVY26 中差异最大的前 40 种胞内蛋白 下载原表 图 2 Ubr1 泛素化底物筛选差异倍数 下载原图图 3 差异蛋白转化至野生型和突变型 Ubr1 中的蛋白表达 下载原图图 3 差异蛋白转化至野生型和突变型 Ubr1 中的蛋白表达 下
22、载原图3 讨论目前研究发现, Ubr1 在酵母系统中存在 221 个相互作用蛋白, 而在人体中则证实只存在 84 个相互作用蛋白。本研究通过比对 RJD347 与 AVY26 胞内蛋白质组的差异, 发现共 249 个蛋白有差异表达, 其中 145 个蛋白在 AVY26 中含量增加, 104 个蛋白含量降低。由于 Ubr1 作为泛素 E3 连接酶, 可直接调控底物蛋白的泛素化降解, 因此 145 个在 AVY26 中含量增加的蛋白为泛素连接酶 Ubr1 的潜在泛素化底物。进一步通过外源验证蛋白 MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 及 RTF1 在SC295 (Ubr1) 中表达提高。泛素连接
23、酶 Ubr1 的潜在泛素化底物在酵母生理代谢过程中起重要的作用, SCD6是翻译起始抑制子, 在 DNA 复制应激时形成胞间集合体, 通过其 RGG 结构域结合 e IF4G 抑制前起始复合物的募集15。值得注意的是, 一些 Ubr1 潜在的泛素化底物蛋白在人体中也存在其相应的同源蛋白, 且与人体多种疾病相关并参与有机体重要的活动调控。酵母源 MLC2 (myolp Light Chain) 可调控酵母细胞型肌球蛋白 Myolp 轻链, 参与 Myolp 重链轻链环肽解体16, 对应人源肌球蛋白调节轻链激酶 MLC2 (Myosin light chain2) 在人体中具有催化肌球蛋白的磷酸化
24、, 控制平滑肌的收缩活动的作用, MLC2 的表达失调可导致原发性心肌症的发生17。此外, 精氨酸酶 (Arginase) 家族中的 ARG1、3、4、5、6及 7 检测到在 Ubr1 缺失型中高表达 (见表 3) , 说明 ARG 家族蛋白为 Ubr1的潜在直接底物。酵母 Ubr1 泛素化底物的筛选研究有助于笔者深入了解 Ubr1参与生物学过程, 同时还可以为人体内 Ubr1 介导的 N 端规则及对应的泛素化底物筛选提供线索, 为研究上述相关疾病发病机制及人类生命活动提供新思路。本研究采用差异蛋白质组学的方法筛选 Ubr1 泛素化底物的方法, 不仅不受蛋白表达纯化的影响, 覆盖率广, 可直接
25、检测细胞内生理状态下的 Ubr1 作用底物, 提高实验的准确性, 为筛选鉴定 E3 连接酶 Ubr1 作用底物提供大量候选蛋白, 为研究 Ubr1 催化底物泛素化的机制提供实验依据, 对研究该潜在底物的同源蛋白是否受泛素化调节生命活动及相关疾病具有重要意义。参考文献1ETZIONI A, CIECHANOVER A, PIKARSKY E.Immune defects caused by mutations in the ubiquitin systemJ.J Allergy ClinImmunol, 2017, 139 (3) :743-753. 2MOYNAGH P N.The roles
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