1、古 DNA 单链测序文库的建立与检测 宋凌峰 盛桂莲 袁俊霞 中国地质大学生物地质与环境地质国家重点实验室 摘 要： 2005 年问世的第二代测序技术在古 DNA 领域的应用, 突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息, 研究者能够从更为系统的实时分子证据角度, 解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后, 传统的古 DNA 研究方法及流程得以改变, 剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤, 引入了与第二代测序技术紧密相关的古 DNA 单链测序文库构建环节。
2、古 DNA 单链测序文库的构建, 是将古 DNA 双链模板变性成单链后, 通过向单链古 DNA 两端添加人工 DNA 片段, 将古 DNA 分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古 DNA 分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点, 古 DNA 单链测序文库, 能够高效获取古DNA 材料中的遗传信息。本文系统介绍古 DNA 单链测序文库建立流程, 以及对文库质量进行检测的方法, 为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。关键词： 第二代测序技术; 古 DNA; 单链 DNA 测序文库; 作者简介：盛桂莲 Tel:027-67883022;E-mail:收稿日期：
3、2017-06-21基金：国家自然科学基金项目 (No.41672017, No.41472014) Preparation and Evaluation of Single-stranded Sequencing Library for Ancient DNASONG Ling-Feng SHENG Gui-Lian Yuan Jun-Xia State Key Laboratory of Biogeology and Environmental Geology, China University of Geosciences; Abstract： The establishment of
4、the next-generation sequencing (NGS) technology in 2005, as well as its application in ancient DNA studies, has broken through the limitation of first generation sequencing in obtaining whole genome from extinct organisms.Scientists in paleontology, genetics, and evolutionary biology are able to exp
5、lore various issues related to human evolution, evolutionary history of extinct mammals, domestication of plants and animals, life styles of early human society etc via the paleongenomic information to gain a more systematic view of real-time genetic records.By incorporating NGS to ancient DNA studi
6、es, the time consuming step of molecular cloning of the PCR products has been removed from previous procedures, while the preparation of single-stranded DNA sequencing library that is closely related to NGS has become an essential step.After denaturing the double-stranded ancient DNA to single-stran
7、ded molecules, the artificial DNA fragments have been added to both ends of the ancient DNA molecules.Therefore, the ancient DNA templates have been transformed to NGS-platformdistinguished library molecules.The purpose of preparing single-stranded DNA sequencing library is to improve the efficiency
8、 of obtaining the damaged genetic information from ancient samples, since themajority of the ancient DNA molecules are characterized as trace-amount and highly fragmented.In this paper, we present a detailed introduction of how to construct a single-stranded ancient DNA sequencing library, as well a
9、s the standard of inspecting its quality and efficiency, and thus to provide methodological reference for scientists who are trying to apply NGS in paleogenomic exploration.Keyword： next-generation sequencing technology; ancient DNA; single-stranded DNA sequencing library; Received： 2017-06-21古 DNA
10、(ancient DNA, a DNA) 是保存在部分死亡或灭绝的生物组织中的高度片段化、微量的 DNA 分子1。古 DNA 研究依研究者涉及的遗传信息量大小和对序列数据应用侧重点被划分为不同阶段2。最近 10 年来, 第二代测序技术全面应用于古 DNA 研究领域, 推动其进入全基因组时代, 在大型绝灭哺乳动物的遗传演化、动植物家养驯化以及古人类迁移演化等诸多方向取得了突破性的进展3-5。第二代测序所具备的高通量技术特点突破了第一代测序技术在小分子片段捕获方面的局限, 改变了利用第一代测序技术在获取全基因组的过程中费时耗力的缺点, 使研究者能够从全基因组视角出发, 全面具体地分析死亡或绝灭生物
11、的遗传组成。随着测序技术的发展, 以单分子测序为理念的第三代测序技术在2008 年问世, 该技术在原理上摒弃了 PCR 扩增, 从理论上避免了二代测序 PCR扩增过程中的碱基错配问题6-10。然而, 第三代测序技术在设备仪器上的高成本, 影响了其推广应用, 加上其在工程学、光学及测序反应所涉及的化学和生物工程等诸多方面存在的挑战11, 并且测序读长较长的第三代测序在应用于平均片段长度低于 150 bp 的古 DNA 测序存在成本浪费。因此, 第二代测序技术仍然是目前古 DNA 研究首选的测序方法。关于第二代测序技术问世之后的古 DNA 研究实验流程, 笔者所在研究小组已有文章对其进行系统介绍和
12、分析2。本文主要聚焦古 DNA 单链测序文库的构建及文库质量检测。1 古 DNA 单链测序文库建立1.1 DNA 单链与双链测序文库的选择第二代测序技术应用于基因组测序之后, “测序文库建立”成为 DNA 提取之后的必要步骤:通过物理或酶切等方法, 随机打断生物总基因组以获得 DNA 片段, 在片段两端接上接头序列, 以制备 DNA 富集模板。在第二代测序技术中, 存在两种不同类型的测序文库:双链文库与单链文库。二者的区别是对原始 DNA 分子的处理方式以及接头分子加入时机的不同。单链DNA 分子文库构建过程中首先利用热变性原理使 DNA 双链分子解链形成 DNA 单链分子, 然后单链分子两端
13、连接接头之后在酶的作用下完成 PCR 扩增复制;与之相对的双链 DNA 分子文库, 在构建初始不进行热变形解链过程, 取而代之的是DNA 分子平端修复过程, 以便接入接头分子, 继而才是利用热变性解链在酶的作用下完成 PCR 扩增。DNA 双链文库构建方法的产生时间稍早于单链文库。根据文库构建所针对的不同测序平台, 有两种不同类型的 DNA 双链文库类型:其一是针对 454 测序平台的双链文库, 其二为针对 Illumina 测序平台及 Solexa 测序平台的双链文库。双链文库构建的核心流程大致相当:末端修复、接头连接、片段选择、PCR 扩增以及文库纯化。因所针对的测序平台不同导致实验具体操
14、作以及实验试剂在一定程度上有所差异, 最为明显的即是接头分子的不同。454 文库接头分为 A、B 两种, 各 44 bp, 由 20 bp 的 PCR 引物、20 bp 的测序引物及 4 bp (TCAG) 的“key”碱基构成, 其中 B 接头的 5端带有生物素 (Biotin) 标记, 用于磁珠纯化步骤。经过磁珠结合与 DNA 变性之后, 只有“A+目的片段+B”形式的连接产物得以富集, 另两种形式 (A+A、B+B) 的产物都被去除;Solexa 文库接头是一段一端互补、另一端开叉的 Y 字形 DNA 片段, 互补的部分 5端有一个碱基 T, 可与 3端腺苷化的 DNA 进行 T-A 互
15、补连接, 开叉的部分则是为了通过 PCR 扩增引入测序引物 P5 和 P7 的互补片段。DNA 双链测序文库能广泛应用于片段长度大于 40 bp 的全基因组测序, 而古 DNA分子具有高度片段化、普遍存在碱基损伤等特点;小于 40 bp 的古 DNA 分子是其基因组中的主体。将 DNA 双链文库应用于古基因组测序文库制备, 会造成小片段 DNA 在文库中的大量流失。鉴于此, Gansauge 等优化出专用于古基因组的DNA 单链文库建立方法12。对比双链文库, 单链文库可以从以下 3 个方面减少样品中古 DNA 分子的流失: (1) 通过古 DNA 分子的生物素化, 利用生物素与链霉亲和素的作
16、用, 使 DNA 分子与磁珠紧密连接, 减少了后续清洗过程中 DNA 分子的流失。 (2) 在 DNA 双链文库的建立过程中, 两条链出现不同程度损伤的 DNA 分子通常会被舍弃;在单链文库建立过程中, 将 DNA 双链分子热变性处理转化成单链 DNA 分子, 每一个单链分子在文库的建立过程中都有独立的机会被获取, 能够获得更多遗传信息。 (3) 双链分子中一条链的末端修饰可能完全地抑制接头的连接;而在单链文库中, DNA 双链经过热变性处理而分开, 即便出现一条链因为末端改变不能连接上接头分子, 另一条链仍然存在与接头分子连接的可能, 从而在一定程度上提高了内源性 DNA 的含量。除年代较老
17、的古生物样品之外, DNA 单链测序文库对年代相对较近、在破坏性环境下储存的材料同样高度有效, 如在福尔马林中保存的 DNA 样品材料。一般而言, 该条件下 DNA 会呈现高度片段化, 并且与蛋白质交联存在13。尽管通过加热处理可以部分消除这些交联存在的结构14, 但是加热过程同样也会使DNA 链变性, 从而影响 DNA 文库的构建效率。DNA 单链测序文库在古基因组测定中存在种种优势, 但也存在一定的局限性:所使用到的接头分子仅针对于 Illumina 测序平台;随着 DNA 分子的长度增加, 单链 DNA 分子的连接效率会降低。所以, DNA 单链测序文库仅仅适用于相对较短的 DNA 分子
18、。对于保存条件比较好的样品, 构建 DNA 双链测序文库相对来说是一种更加适合的方法。另外值得注意的是, DNA 单链测序文库的构建成本相对较高并且更加耗时, 实验者应该根据具体的实验材料合理选择合适的测序文库构建方法。1.2 古 DNA 单链测序文库建立流程及原理构建测序文库的目的, 在于将实验材料中提取到的 DNA 分子转变成能被测序仪识别的文库分子。该目的可通过向 DNA 分子两端添加人工 DNA 片段 (接头) 来实现。接头分子在文库富集以及测序反应过程中提供重要的引物位点12, 是文库分子能够被测序仪识别的重要凭证。古 DNA 单链文库的建立包含以下步骤12 (如 Fig.1) :F
19、ig.1 Schematic overview of the preparation of single-stranded sequencing library 下载原图(1) 去除 DNA 分子中的磷酸基团以及脱氧尿嘧啶:磷酸基团的存在提供了自连的可能性, 会妨碍接头分子与 DNA 单链的连接。在热变性解开 DNA 双链前, 首先用热敏碱性磷酸酶 (Fast AP) 除去 DNA 链中的 5端和 3端的磷酸基团。与此同时, DNA 损伤过程中由胞嘧啶脱氨基作用产生的脱氧尿嘧啶, 也会在尿嘧啶-DNA 糖苷酶 (uracil-DNA glycosylase, UDG) 的作用下移除。尿嘧啶-D
20、NA 糖苷酶是存在于多种生物体内的一种重要的 DNA 修复酶, 主要功能是参与碱基切除修复。研究发现, 尿嘧啶的切除能够有效地提高测序准确性。同时, 不显著影响其测序效率15。(2) 单链接头与 DNA 的连接:单链接头是一条短的核酸序列, 在该核酸序列的5端存在 1 个磷酸基团, 在 3端存在 1 个生物素化的间隔臂 (3-biotinylated spacer arm) 。在 Circ LigaseII ss DNA Ligase (Circ LigaseII 单链 DNA 环化连接酶) 的作用下, 单链接头分子的 5端磷酸基团与DNA 分子 3端-OH 基团连接。加入含有链霉亲和素分子的
21、磁珠后, 利用生物素与链霉亲和素之间的作用, 与单链接头连接的 DNA 分子以及过量的接头分子都可连接到磁珠上。(3) DNA 分子扩增:DNA 分子被连接到磁珠后, 加入与单链接头分子互补的引物, 在 Bst polymerase 2.0 聚合酶的作用下扩增模板 DNA 分子。Bst polymerase 2.0聚合酶是 Bacillus stearothermophilus DNA polymerase I 中的聚合酶片段, 具有 53端聚合酶活性, 但不具备 35端外切酶的活性。因此, 该酶不具备“校对功能”, 会产生误添加的核苷酸即 3悬端 (3-overhangs) 。(4) 剔除多
22、余的引物:多余的引物分子既包括没有与接头互补连接的引物分子, 也包括与固定到磁珠上的单链接头互补连接的引物分子。这些引物分子的存在, 会影响下一个双链接头的连接, 产生接头聚合物。引物分子与单链接头之间的作用力是脆弱的, 在洗脱液以及热效应作用下, 除去多余的引物分子, 避免对下一步实验造成误差。(5) 双链接头连接:利用 T4 DNA 聚合酶的 35端外切酶活性, 将步骤 (3) 中的因聚合酶产生的 3-悬端修复成平端后, 双链接头在 T4 连接酶的作用下被接入到双链 DNA 上。T4 DNA 连接酶是一种封闭 DNA 链上切口的酶, 借助 ATP 或NADP 水解提供的能量, 催化 DNA
23、 链 5-PO4与另一条 DNA 链的 3-OH 生成磷酸二酯键。将双链接头中一条链的 3端进行双脱氧处理, 可以有效地避免双链接头互连。(6) 文库分子脱离磁珠:双链接头与 DNA 分子连接完成以后, 经过洗脱试剂清洗, 文库分子从磁珠上释放出来。在这个过程中, 包含未能成功连接双链接头的含生物素初始 DNA 模板在内的一系列生物分子被释放出来。但是, 这些分子因双链接头连接失败缺少引物位点, 因此, 不能作为后续扩增的模板。所有的双链分子在 95下解链成为单链, 单链 DNA 分子文库建立完成。(7) 标准 PCR (Indexing PCR) :为了保证来自同一样品的文库分子在测序过程中
24、被有效识别, 并在测序完成后能与同批次样品区分归类获取。研究者采用条形码 DNA (DNA bar codes) 对样品进行标识。存在两种标识手段:单条形码标识与双条形码标识。研究发现, 双条形码标识的准确性高于单条形码, 单条形码标识的错误分配率在一定情况下会达到 0.3%16。双条形码标识其实是一段DNA 序列。这一段 DNA 序列包含在接头序列之中, 因此, 在后期测序中可以用来区分不同样品的 DNA 片段。古 DNA 文库建立完成后, 采用荧光定量 PCR 对文库分子中 DNA 含量进行测定。根据荧光定量 PCR 曲线确定 DNA 增长速度最大时对应的循环数 (turning poin
25、t) 。然后, 进行 indexing PCR。在 Accu Prime Pfx 聚合酶作用下, 按照拐点对应的循环数对 DNA 分子扩增, 完成样品材料 DNA分子标识, 直接应用于下游的序列测定12。2 古 DNA 单链测序文库质量检测2.1 影响古 DNA 单链测序文库质量的因素古 DNA 单链测序文库的质量受样品保存情况、样品类型、古 DNA 提取方法以及提取实验操作细节等诸多因素的影响。样品保存情况和样品类型直接决定样品中古 DNA 分子的质量和数量。用来构建DNA 单链测序文库的 DNA 样品, 在片段长度和分子数量上要达到一定要求;如果所使用的古 DNA 分子浓度过低, 在文库构
26、建过程中, 古 DNA 分子就会被所添加的人工合成的寡核苷酸片段所掩盖, 成为背景分子12。因此, 应首选保存相对较好的实验材料, 尽可能避免选择因水解和氧化导致的 DNA 甲基化、磷酸化, 以及富含脱氧腺嘌呤、脱氧尿嘧啶的 DNA 实验材料;如受材料限制无法避免, 须在文库构建过程中充分考虑以上因素的影响, 进行相关的实验设计。例如:利用热敏碱性磷酸酶 (Fast AP) 除去 DNA 链中 5端和 3端的磷酸基团, 利用尿嘧啶-DNA 糖苷酶除去因脱氧胞嘧啶脱氨基所形成的脱氧尿嘧啶等。由于环境的温度、p H 值、离子强度和腐殖酸含量等因素会直接影响古 DNA 的降解速度以及降解水平, 因此
27、低温、干燥、弱碱性和微生物活动较少的封闭环境有利于古 DNA 的保存17。然而即便是保存在同一环境条件下的古 DNA 样品, 其古 DNA 保存质量和浓度也可能存在显著差异, 从而影响单链文库的构建。在古 DNA 研究早期, 学界普遍认为骨骼和牙齿是保存内源性 DNA 的理想研究材料18。然而近期研究发现, 在以哺乳动物化石材料作为古 DNA 研究对象时, 对比牙齿和骨骼材料, 颞骨岩部 (petrosal bone) 中的内源性 DNA 含量更高。Gamba 等在对匈牙利不同地质时期人类化石古 DNA 内源性含量比较研究中, 发现颞骨岩部内源性 DNA 含量占总 DNA 含量的 37.4%8
28、5.4%, 是牙齿中内源性 DNA的 416 倍, 是骨骼材料的 183 倍19。Pinhasi 等在对颞骨岩部 3 个不同区域进行内源性 DNA 含量分析, 同样认为岩骨骨质致密部分内源性 DNA 的含量更高, 使研究者分析恶劣保存环境下的古生物样品的生物信息成为可能20。不同的古 DNA 提取方法使用不同的提取消化液和吸附缓冲液成分, 决定了 DNA分子的分离、吸附和纯化原理也不尽相同。需要根据不同的样品类型, 选择能从材料中获取尽可能多的 DNA 分子的方法。古 DNA 提取的操作细节直接关系到提取过程是否受到污染, 污染 DNA 的存在, 会在文库构建中竞争性地与接头及引物分子结合,
29、降低目标 DNA 分子在文库中的占比, 从而影响文库构建的质量。在古 DNA 研究过程中可设立提取空白对照、文库空白对照等阴性对照, 以此对污染进行监测。2.2 DNA 单链测序文库质量检测方法DNA 单链测序文库质量检测包含两个方面, 单链文库建立效率测定和单链文库分子质量浓度判断。单链文库建立效率测定能初步了解单链文库构建时, 参与到文库构建的 DNA 分子与产生的文库 DNA 分子之间的相对关系。借此来评价文库构建的效率, 为 DNA 文库构建提供一定的参考意义;而单链文库分子质量浓度判断, 则是对样品进行快速分析。在提供文库平均分子量信息的同时, 提供定量数据, 为后续的预测序实验提供
30、重要依据。2.2.1 DNA 单链测序文库建立效率测定在文库建立过程中, 设置阳性对照 (positive control) 验证文库建立的效率。在保持其它试剂等量加入的同时, 阳性对照组中加入的是寡核苷酸分子CL104。这个 60bp 寡核苷酸分子由 p UC19 分子衍生而来, 能够被 5端特定的标记引物 CL107 与 CL108 扩增。在实际操作中, 通过 2 次不同的荧光定量 PCR结果, 计算阳性对照中不同分子的浓度来实现文库效率的计算:Assay 1, 使用与接头分子特异性结合的引物 IS7 和 IS8, 对产生的文库分子进行定量;Assay 2, 使用与寡核苷酸分子 CL104
31、 特异性结合的引物 CL107 和 CL08, 对参与文库建立过程中该寡核苷酸序列的含量进行定量。两者比值 (Assay 2/Assay 1) 反映的是文库建立的效率。该效率值通常会在 30%70%之间变化, 变化的原因可能是因为稀释或 q PCR 错误。2.2.2 单链测序文库质量及主要分子类型和浓度判断借助凝胶电泳结果对 DNA 单链测序文库分子质量及浓度进行判断, 分析结果能够显示 3 个方面的信息:其一, 初步判断实验过程是否存在交叉污染。Fig.2 所示为中国南方炭化稻古 DNA 单链测序文库电泳结果。比较文库空白对照组、提取空白对照组和炭化稻样品实验组的结果峰图, 观察在较上的峰与
32、较下的峰之间是否存在重叠峰, 即可初步判断 DNA 提取和文库建立是否存在交叉污染。其二, 初步了解文库分子的主要分子类型。Fig.2 横轴所对应的文库分子长度显示出不同文库中的主要分子长度分别为 164 bp、153 bp 和 168 bp。其三, 确定各文库在混合测序文库 (pooling) 中的体积。为保证在测序反应中每个分子有同等机会被扩增, 避免由于分子组成的不均一使得部分分子被优势扩增得到大量重复, 应基于各文库的主要分子大小以及文库浓度, 计算该文库加入到混合文库的体积。3 古基因组预测序预测序是 DNA 样品在进行深度测序前的重要环节。预测序是以 Illumina 高通量测序芯
33、片为基础完成的。关于高通量测序原理, 周晓光等6曾撰文进行过全面介绍, 以边合成边测序为原理, 以桥式扩增为手段, 以脱氧核苷酸碱基配对为基础。技术要点在于 4 种可逆终止化合物标记的脱氧核苷酸, 实现确定实验组文库、提取空白对照与文库空白对照中所包含的 DNA 信息的目的。经 Illumina 测序得到的预测序数据, 是包含实验材料所有可能涉及到文库构建的单链 DNA 序列。其中既有实验材料内源性 DNA 分子数据, 也有外源性 DNA 分子数据。对预测序数据的处理过程, 实际上是切除文库构建时加入到 DNA 分子两端的接头分子和过滤外源性 DNA 分子数据, 并将内源性 DNA 从海量数据
34、中捕获的过程。预测序数据处理是在终端服务器上完成的。终端服务器上包含一系列二代测序数据处理的软件, 以实现接头切除、提取外源性 DNA 和捕获整理内源性 DNA 等目的。数据处理过程中会产生一系列中间文件, 研究者根据中间文件能够检查每一步完成的质量以及了解关于实验数据的重要信息。Fig.2 Electrophoresis results from Agilent 2200 Tape Station of the sequencing libraries constructed in carbonized rice DNA experiment (A) (B) (C) represents e
35、xtraction blank, library blank, and sample sequencing libraries, respectively.Lateral axis represents molecular size (bp) and vertical axis represents molecular concentration (FU) .根据切除接头、匹配参考序列、剔除外源性 DNA 以及去除内源性 DNA 重复片段时产生的中间文件, 能够得到文库总片段数量与匹配参考序列片段数量 (mapped reads) 、特异性片段数量 (unique reads) , 文库内源性
36、 DNA 含量是指特异性片段数量与文库总片段数量的比值。Fig.3 反映的是本课题组对中国北方马化石古 DNA 预测序数据分析结果:Fig.3 (A) 显示在实验样品单链 DNA 分子文库中, 能够匹配到马化石参考序列的特异性数目, 远高于提取空白对照以及文库空白对照中的特异性片段数量;Fig.3 (B) 表明在实验样品单链 DNA 分子文库中的内源性 DNA, 远高于提取空白对照以及文库空白对照中的内源性 DNA含量。在利用预测序数据分析结果进行准确的实验污染分析时, 提取空白对照组与文库空白对照组中不存在实验样品的内源性 DNA 是最为理想的, 说明实验过程不存在交叉污染。但是, 实际情况
37、有时如同中国北方马化石古 DNA 研究所出现的情况, 应该针对提取空白对照、文库空白对照中的内源性 DNA 进行特异性判断:如果提取空白对照组和文库空白对照组中的内源性 DNA 既能与目标基因组匹配, 也能与其他物种匹配, 则说明这些内源性 DNA 不具备物种特异性, 可判定实验过程不存在交叉污染;如果提取空白对照和文库空白对照中的内源性DNA 仅与目标基因组匹配, 则说明实验过程存在交叉污染, 实验数据的真实性有待考证。通过预测序结果可以初步了解实验样品内源性 DNA 含量。内源性 DNA 含量对于深度测序的指导意义体现在以下两个方面:其一, 内源性 DNA 含量决定了测定全基因组或核外基因
38、组所需要构建的文库数量;其二, 内源性 DNA 含量决定了后续实验中构建测序文库的方法, 如:是否需要通过文库富集过程提升内源性 DNA 在总 DNA 分子中的比例。Fig.3 Contamination analysis of pre-sequencing data from a Northern Chinese horse specimen (A) Reads numbers of different libraries.Different colors represent ancient DNA extracts (blue) , extraction blank (red) , and
39、 library blank (green) ;the upper columns were enlarged from the cycled columns in the bottom to show the mapped reads, unique reads; (B) Pre-sequencing reads ratios of endogenous DNA from the specimen, library blank, and extraction blank.4 问题与展望本文介绍的单链分子文库构建方案仅适合于 Illumina 测序平台, 而 Illumina测序平台是第二代测
40、序技术最主要的商业测序平台。古 DNA 单链文库是近年来广泛运用于古 DNA 研究的文库构建方案, 辅以 CT 3D 成像技术获取古 DNA 材料颞骨岩骨等作为古 DNA 实验材料, 提高从古代材料中捕获古 DNA 分子的效率, 是打开古生物分子遗传以及系统演化研究的重要钥匙。基于原理和技术特征等方面的因素考虑, 第三代测序技术具备应用到古 DNA 研究的潜力, 其纳米孔测序原理决定该技术能够有效识别单个碱基, 准确识别甲基化严重的 DNA 分子, 避免了之前两代测序技术涉及的 PCR 扩增过程。这一技术特点与普遍存在碱基损伤的古 DNA 材料相契合, 可在最大程度上还原古 DNA 生物的遗传
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