1、阳和汤的质量标准研究 窦建卫 朱宇红 王红英 任翠翠 尚荣国 黄芊 西安交通大学药学院 西安市第一医院 西安市中医医院 摘 要： 目的:创建阳和汤质量控制的标准, 从而更好服务于研究与临床。方法:采用TLC 对麻黄、肉桂鉴别与 HPLC 对阳和汤所含成分毛蕊花糖苷进行含量测定。结果:用 TLC 鉴别麻黄、肉桂具有较好的专属性;毛蕊花糖苷在 32.1192.6ng 范围内, 与峰面积呈良好的线性关系, 相关系数 r=0.9994, 平均回收率 99.7%, RSD等于 0.75%。结论:本实验所创建的检测方法方便有效, 专属性强, 此标准能够很好控制阳和汤质量。收稿日期：2017-06-17基金
2、：国家自然科学基金资助项目 (81573983) Received： 2017-06-17阳和汤是由肉桂、麻黄、熟地、姜碳等多味中药经一定工艺加工而成。是基于古法阳和汤, 逐步优化创制而成的中药复方制剂, 具有温阳散寒、补血通滞之效。前期实验研究表明, 阳和汤对乳腺癌具有良好的控制作用, 其主要是通过对细胞内多种信号通路起到一定的抑制作用, 且药物安全性良好1-3。本课题得到国家自然科学基金的大力支持, 为了对该复方制剂质量进行控制, 该实验采用 TLC 和 HPLC 检测其含量, 内容如下。材料与方法1 仪器超声波清洗机 (型号:PS-40, 生产厂家:深华泰超声洗净设备有限公司) ;分析天
3、平 (型号:YP1201N, 生产厂家:上海天平仪器厂) ;0.1 mg 微量分析天平 (型号:FA1104, 生产厂家:上海天平仪器厂) ;0.01 mg 微量分析天平 (型号:AB135-S, 生产厂家:梅特勒-托利多公司) 等。2 试药毛蕊花糖苷对照品 (批号:111530-201512) ;桂皮醛对照品 (批号:121604-201502) ;盐酸麻黄碱对照品 (批号:171241-201508) ;供试品、阴性样品均为自制;其他试剂均是分析纯。3 薄层色谱鉴别3.1 麻黄:取一定量样品 (5ml 左右) , 加入一定量氢氧化钠溶液 (使其为碱性) , 加乙醚 20 ml 萃取分离 (
4、3 次重复) , 每次用量 10 ml, 合并乙醚相, 蒸干, 收集残渣, 加 2ml 甲醇溶解, 即为供试品溶液4。同时, 取适量盐酸麻黄碱对照品, 以甲醇为溶剂, 用上法配制对照品溶液。按处方的构成比, 取缺麻黄的其它药材, 用上法制成阴性样品溶液 (不含麻黄) 。依薄层色谱法 (通则 0502) 5, 分别取上述 10L 各溶液, 点于硅胶 G 薄层板上, 放入展开剂片刻, 拿出, 晾干后, 浸渍于茚三酮溶液中, 取出晾干。展开剂按照三氯甲烷-甲醇-浓氨试液体积比为 2060.5 配制而成。结果显示, 供试品色谱与对照品色谱对照, 在对应的位置上, 主斑点呈现相同颜色及形状, 且阴性对照
5、显示没有干扰, 因此将该法列入该制剂的质量标准。3.2 肉桂:取一定量样品 (5mL 左右) , 加 10mL 乙醇, 振荡, 静置, 醋酸乙酯萃取 (重复3 次) , 收集乙醇相并旋蒸, 收集残渣, 再加 2 mL 乙醇搅拌溶解, 即供试品溶液6。同时将肉桂对照药材, 以乙醇为溶剂, 按以上方法配制成对照品溶液。按处方的构成比, 取不含肉桂的其它药材, 用上法制成阴性样品溶液 (不含肉桂) 。分别取 5L 上述溶液, 点于硅胶 G 薄层板上, 放入展开剂片刻, 拿出后, 晾干, 将二硝基苯肼乙醇喷于薄层板上 105C 条件下加热, 斑点完全显现时停止。展开剂按照石油醚-醋酸乙酯体积比为 18
6、2 配制。供试品色谱与对照品色谱对照, 在对应的位置上, 主斑点呈现相同颜色及形状, 且阴性对照显示没有干扰, 因此将该法列入该制剂的质量标准。4 含量测定4.1 色谱条件与系统适用性试验:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂;流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液 (1882) ;检测波长 334nm。理论板数按毛蕊花糖苷峰计算应不小于 5000。4.2 对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液的制备:取一定量毛蕊花糖苷, 用甲醇为溶剂配成 10g/ml 的溶液, 即对照品溶液。供试品溶液:量取 10 ml 样品于 25ml 容量瓶中, 加甲醇定容至刻度线, 超声处理1.5h, 稍冷, 补加甲醇溶液至刻度
7、线, 混匀, 过滤, 收集续滤液, 即得。阴性对照溶液:按前述制备方法, 取除熟地外的阴性样品适量, 制备阴性对照溶液。4.3 干扰性试验:取一定量对照品溶液 (10l) , 进行检测, 得到色谱图, 阴性对照和供试品溶液重复以上操作。由结果可知, 阴性样品在毛蕊花糖苷对应的位置上, 没有色谱峰被检出, 说明该制剂中其余药材毛蕊花糖苷的测定不会产生干扰。4.4 线性考察:称取一定量毛蕊花糖苷对照品, 用甲醇溶液作为溶剂, 制备 10.7g/ml 的溶液, 精确吸取 3、6、9、12、15、18l 进行实验, 得到色谱图, 峰面积值, 分析得到其回归方程:y=1768.3-627.3 (r=0.
8、9994) , 在 32.1192.6ng 范围内, 毛蕊花糖苷与色谱峰面积线性关系良好。4.5 精密度试验:取适量对照品溶液, 进行精密度实验 (色谱条件与上述相同) , 得到色谱图及色谱峰面积, 以毛蕊花糖苷峰面积 (A) 为指标进行考察, 进样 6 次, 得到 RSD为 0.95%, 结果可知, 该方法具有较好的精密度。4.6 稳定性试验:从首次进样后, 每 2h 进样 1 次, 共进样 5 次 (10l/次) , 得到色谱图及色谱峰面积, RSD 为 0.72%。由以上结果可知, 在 8h 内, 供试品溶液有较好的稳定性。4.7 重复性试验:按上法, 制备 6 样份供试品溶液, 按次序
9、取 10l 进行处理, 得到色谱图, 计算复方制剂中目标成分含量为 0.102mg/ml, RSD 为 1.33%。由以上结果可知, 该法有较好的重复性。4.8 加样回收率试验:取浓度已知的样品 (各 1ml) , 按顺序加入容量瓶中, 同时加以上毛蕊花糖苷对照品 (0.105 mg/ml) 溶液适量, 依上法制备、分析、得到色谱图, 对复方制剂中毛蕊花糖苷含量及回收率进行计算, 见表 1。表 1 样品的回收率试验结果 下载原表 4.9 样品的含量测定:按以上方法对 3 批阳和汤进行含量测定, 毛蕊花糖苷平均含量为 0.102mg/ml。讨论阳和汤作为临床常用中药复方制剂, 由熟地、麻黄、肉桂
10、、白芥子等组成。其中熟地为滋养之品, 滋阴补肾, 养血调肝;麻黄、肉桂、炮姜炭、白芥子乃温阳之药, 具有驱散寒邪, 腠理开, 寒凝解, 气血则行, 毒迹随消。肉桂、炮姜炭入血分, 温经散结而解寒凝;麻黄辛温, 得熟地而通络;白芥子通阳散寒而消痰结, 祛内外之痰。诸药配伍, 针对阳气亏虚之本, 寒凝痰滞之标, 温阳共补阴合用, 滋腻和辛散相伍, 温且不燥、补而不腻。寒邪易客于肌肉、筋骨, 凝则为痰, 凝痰阻碍气血运行, 日久为瘀血, 寒痰瘀聚于乳, 则为“乳岩”, 本方温阳以化寒痰、解凝聚, 血得热则行, 寒痰得温而消, 故能消痰凝肿块。在体外实验研究方面, 阳和汤可明显抑制 MDA-MB-23
11、1 细胞的增殖, 下调 NF-B、减少 IL-8 的分泌, 从而有效阻止乳腺癌的发生、发展2;在体内实验研究方面, 阳和汤通过降低裸鼠血清中 IL-6、移植瘤组织中 MMP-9、CD90 的表达, 从而表明其可抑制乳腺癌的发生、发展1,3。因此, 为保证阳和汤复方制剂的质量, 我们创建阳和汤复方制剂的质量标准, 此实验通过测定制剂中毛蕊花糖苷成分的含量, 建立了该制剂质量标准。此外, 我们对该制剂中的肉桂、麻黄进行了 TLC 鉴别, 在相应展开剂中, 供试品能够特征性地检测出该制剂中肉桂、麻黄。鉴于以上实验结果, 将上法列入该制剂的标准, 为更好的掌控阳和汤复方制剂的质量提供了标准。参考文献1
12、窦建卫, 任翠翠, 郝云, 等.阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌组织中 CD90 表达的影响及其抑瘤作用J.世界中医药, 2015, 10 (3) :391-393, 398. 2窦建卫, 黄芊, 赵天一, 等.阳和汤对乳腺癌 MDAMB-231 细胞 NF-B、IL-8表达的影响J.四川中医, 2017, 35 (2) :44-47. 3窦建卫, 黄芊, 赵天一, 等.阳和汤对三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤生长及 IL-6、MMP-9 表达的影响J.中国现代医药杂志, 2016, 18 (12) :1-4. 4毛丹, 许勇, 陆继伟, 等.复方桔梗麻黄碱糖浆质量标准研究J.中成药, 2012, 34 (8) :1518-1522. 5国家药典委员会.中国药典M.第四部.北京:中国医药科技出版社, 2015:57-59. 6王卓, 韩璐, 王燕.前列痊胶囊质量标准中大青叶、肉桂 TLC 鉴别的研究J.中国医药指南, 2015, 13 (33) :39-40.
