1、胰腺癌 LyP-1 靶向性磁共振荧光双模态分子探针实验 史张 宋长恩 施睿峰 陆建平 邓勇辉 蒋涛 第二军医大学附属长海医院放射科 复旦大学化学系 摘 要： 目的构建胰腺癌 LyP-1 靶向性磁共振荧光双模态分子探针, 观察其表征并进行 MR 显像。方法构建 50nm 核壳结构的磁共振荧光双模态介孔探针, 表面经环形多肽 LyP-1 (Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg-Gly-Cys) 修饰, 通过荧光及MR T2WI 联合成像, 验证该分子探针能否特异性识别并结合胰腺癌细胞。结果新型 LyP-1 靶向性磁共振荧光双模态分子探针可用于小鼠原位胰腺癌的荧光显像和磁共振成像,
2、 可有效结合胰腺癌细胞并在体外使 T2WI 信号明显降低。体内实验表明, 该分子探针可与荧光标记的胰腺癌组织靶向结合, 并作为 MRI 对比剂显示 C57BL/6 小鼠原位胰腺癌。结论 LyP-1 靶向性磁共振荧光双模态分子探针可靶向性地高效结合原位移植的小鼠胰腺癌细胞, 用于早期胰腺癌诊断的转化研究。关键词： 胰腺肿瘤; 分子探针; 双模态; 磁共振成像; 荧光成像; 作者简介：史张 (1987) , 男, 陕西渭南人, 在读硕士。研究方向:分子影像及血管成像。E-mail:作者简介：邓勇辉, 复旦大学化学系, 200433。E-mail:作者简介：蒋涛, 第二军医大学附属长海医院放射科,
3、200433。E-mail:收稿日期：2017-04-10基金：国家自然科学基金 (81402680、81371551) MR-fluorescent dual-modality molecular probes anchored with LyP-1 for pancreatic cancerSHI Zhang SONG Changen SHI Ruifeng LU Jianping DENG Yonghui JIANG Tao Department of Radiology, Changhai Hospital, the Second Military Medical University
4、; Department of Chemistry, Fudan University; Abstract： Objective To construct the LyP-1 targeted MR fluorescence dual-modality molecular probe for pancreatic cancer, and to observe its features and MRI charicteristics.Methods The 50nm MR-fluorescent dual-modality molecular probe with surface modifie
5、d with cyclic nine-amino acid peptide LyP-1 (Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg-Gly-Cys) was rationally designed.Whether the molecular probe could specifically recognize the pancreatic cancer cells were validated by the combination of fluorescent imaging and MR T2WI.Results The new MR-fluorescent dual-moda
6、lity molecular probe anchored with LyP-1could be used for the fluorescent imaging and MR T2WI of pancreatic cancer in mouse.And the molecular probe was demonstrated to be effective in conjugating with pancreatic cancer cells on fluorescent images and caused obvious MR signal reduction under T2relaxo
7、metry in vitro.In vivo experiment, the molecular probe could be used for fluorescent labeling tumor tissue and detecting orthotopic pancreatic cancer in C57BL/6mouse as MR contrast agent.Conclusion The LyP-1immobilized MR-fluorescent dual-modality molecular probe can actively target to mouse orthoto
8、pic xenograft of pancreatic cancer, which is hopeful to the application in early probing and diagnosis of pancreatic cancer by multimodal imaging.Keyword： Pancreatic neoplasms; Molecular probe; Dual-modality; Magnetic resonance imaging; Fluorescent imaging; Received： 2017-04-10由于多数胰腺癌在发现时已属晚期或已经存在远处
9、转移, 超过 80%的胰腺癌患者无法进行治愈性切除, 因此提高胰腺癌的早期诊断率尤为重要1-2。MRI 广泛应用于对肿瘤的诊断, 通过 MRI 对比剂可改变组织周围外部磁场以获得高质量的图像3。目前临床应用的主要 MRI 对比剂弛豫效率较低且缺乏组织特异性, 新型 MRI 对比剂的研发已成为目前的研究热点。本研究通过在 C57BL/6 小鼠胰腺癌细胞株 Pan02 及其相应的裸鼠原位移植胰腺癌中 p32 的异常膜表达, 设计一种新型环形多肽 LyP-1 (Cys-Gly-Asn-LysArg-Thr-Arg-Gly-Cys) 靶向性磁共振荧光双模态分子探针, 评价小鼠原位胰腺癌的免疫荧光显像和
10、 MR 成像效果。1 材料与方法1.1 p32 在胰腺癌组织和细胞系中的表达1.1.1 胰腺癌细胞系和细胞培养小鼠胰腺癌细胞系 Pan02 购自 Frederick 国家癌症研究实验室 (Maryland, 美国) , 保存于含有 10%胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 的 RPMI 1640 (Gibco 公司, California, 美国) 和谷氨酰胺中。小鼠内皮细胞系 MS1 由中国科学院的样品培养保藏中心细胞库提供。所有细胞系均培养于 5%CO2的 37加湿器培养箱中。1.1.2 建立 C57BL/6 小鼠原位胰腺癌模型将 15 只 68 周龄、体质量 1
11、822g 的雌性 C57BL/6 小鼠以 1%戊巴比妥腹腔注射麻醉。参照 Jiang 等4的方法建立原位胰腺癌荷瘤 C57BL/6 小鼠模型。局部备皮、消毒后, 于腹腔左上部位处行 1.5cm 长的纵向切口。将脾脏掀起并暴露胰腺尾部, 将含 110 个 Pan02 细胞的 20L 悬浮液用 27 号针头注射器注入胰腺实质, 将脾脏和胰腺放回腹腔, 并以连续 2 层丝线缝合封闭腹腔。在 1 周内每天监测小鼠的术后状态和伤口愈合情况。1.1.3 p32 蛋白免疫荧光染色将人胰腺癌、正常胰腺组织、原位小鼠胰腺癌和小鼠正常组织 (均购自上海斯莱克实验动物有限公司) 切除后立即放入 4%多聚甲醛, 浸泡
12、 15min, 后放入 10%蔗糖溶液中连续浸泡 1h, 并在 30%蔗糖溶液中浸泡至过夜。将组织放入 OCT 复合液中, 于-20冷冻并进行 4m 组织切片。使用以下一抗:兔抗-p32 (CST 公司, 美国) 、山羊抗 EpCAM (Santa-Cruz 公司, 美国) 、Cy2-耦联的驴抗兔 (Jackson Immuno Research 公司, 美国) 和 Cy3-耦联的驴抗山羊抗体 (Jackson Immuno Research 公司, 美国) 。二抗用于在荧光显微镜下与一抗交联发光。DAPI 复染用于检测细胞核位置。1.1.4 p32 表达在细胞系和组织提取的总蛋白和膜蛋白检测
13、获得细胞系并用 PBS 漂洗 2 次后, 用 16 000G 离心力裂解细胞系并测得总蛋白。通过具有原位胰腺癌的 C57BL/6 小鼠获得新鲜肿瘤组织、胰腺、心脏、肝、脾、肺、肾, 并在裂解液中进行匀浆, 再用 16 000G 离心力离心并测得总蛋白。使用跨膜蛋白提取试剂盒 (Merck 公司, 德国) 提取细胞系和组织的膜蛋白。按照 BCA 蛋白浓度测定试剂盒所测的蛋白质浓度, 将总蛋白和被提取的膜蛋白用SDS-PAGE 分离并转移至 PVDF 膜。对 p32 的检测:采用兔抗-p32 (11 000 稀释) 的一抗在 4下孵育过夜, 洗膜后加入辣根过氧化氢酶标记的羊抗兔 IgG 二抗继续孵
14、育。最后, 用增强型 ECL 发光试剂盒检测信号。1.2 LyP-1 靶向性磁共振荧光双模态分子探针的合成和表征所有化学试剂在使用前均被进一步纯化, 实验中使用去离子水。1.2.1 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针的合成根据 Liang 等5的方法合成均匀的磁性探针。将 5 ml 的磁铁矿正己烷分散体 (约 20mg/mL) 通过超声波处理 10min 使其均匀分布。再将 10ml 的乙醇与 10ml的曲拉通 X-100 的混合物加入 50ml 的环己烷。后加入 0.5ml 氢氧化铵溶液 (28%重量浓度比) , 以形成稳定的逆微乳液。在连续机械搅拌下加入 0.04ml 正硅酸乙酯
15、(tetraethyl orthosilicate, TEOS) , 并反应 24h, 以形成二氧化硅包被的磁性探针, 即 Fe3O4SiO2分散体。同时, 将 0.02g 的 3-氨丙基三乙氧基硅烷 (aminopropyltriethoxysilane, APTS) 溶解于包含有 0.01g 异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 的 5.0ml 乙醇。在暗箱中搅拌 12h 后将所得溶液与 TEOS (0.02ml) 一起加入 Fe3O4SiO2分散体, 然后将其放于暗处连续反应 12h。对产物经磁分离技术进行纯化和分离, 用乙醇洗涤 3 次,
16、 并在30真空干燥过夜, 获得镶嵌有 FITC 的磁性二氧化硅探针, 即 Fe3O4SiO2-FITC。收集获得的 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针并在磁性分离的乙醇溶液中洗涤后, 重新分散于 30ml 乙醇中备用。固体重量约为总重量的 0.6%。1.2.2 LyP-1 在 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针上的耦联为进一步将功能性 LyP-1 分子黏附于 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针, 将0.02ml-巯丙基三乙氧基硅烷 (-mercaptopropyltriethoxysilane, MPTS) 加入 20 ml 含 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探
17、针的乙醇分散液 (重量浓度比 0.6%) 。经 12h 反应后, 被SH 基团 (巯基) 修饰过的探针经磁场 3 次分离纯化以去除多余的 MPTS 后, 将其分散到乙醇 (40 ml) 与马来酰亚胺-LyP-1 的化合物中以备进一步反应。将 2ml 马来酰亚胺-LyP-1 肽 (0.01g) 溶液加入乙醇分散探针溶液, 反应 6h。通过离心收集样品, 并用乙醇洗涤 3 次, 于 30真空干燥, 最终获得 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 探针。1.2.3 表征采用 BrukerD8 高级 X 线衍射仪, 通过 Ni 过滤 Cu-K 射线 (40kV, 40mA) 记录粉末 X
18、 线衍射 (XRD) 图像。采用 Micromeritics ASAP 2420 分析仪在 77K 下测量氮吸附等温线。在测量前, 将探针样品于 50下真空脱气 4h。用布鲁诺尔-埃米特-特勒 (BruknollEmmett Tler, BET) 方法在吸附数据 c 表面积为 0.05至 0.35 内计算特定网络连接中的相对压力范围。通过 Barrett-JoynerHalenda (BJH) 模型, 在相对压力 P/P0 为 0.992 时由吸附量估计总孔体积, 计算来自等温线的吸附分支的孔体积和孔径分布。在 200kV 下操作 JEOL 2011 透射电子显微镜拍摄探针图像。将探针样品首先
19、分散于乙醇中, 而后用覆碳铜栅进行分析。在 20kV 时采用 Philips XL30 电子显微镜, 记录扫描电子显微镜 (scan-ning electron microscope, SEM) 图像。在细金属薄膜上喷涂探针样品, 以激光共聚焦显微镜拍摄玻片上 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2样品的荧光图像, 激发波长为480nm, 发射波长的滤色片为 515565nm。采用 Vario EL元素分析仪测量C、H、N 和 S 元素的含量。1.3 与细胞系结合的探针数量测算将 Pan02 及 MS1 细胞以 110 个/孔接种于 6 孔板, 每孔加入 2ml 完全培养基。过夜培养使细胞融合
20、后, 更换新鲜的细胞培养基, 其中含有单一PBS、Fe 3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 或 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2 (并按照梯度浓度 5、10、20、40、80g/ml 配制) 。再次培养 4h, 去除培养基。PBS 洗涤细胞 3 次后用胰蛋白酶处理, 2%多聚甲醛固定、离心, 并悬浮于 1ml PBS 中。采用 Becton Dickinson FACS Calibur 流式细胞仪分析进行检测, 每个浓度设置3 个重复测量。1.4 细胞系的体外 MRI对 6 孔板浓度梯度培养的 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 或 Fe3O4SiO2-FIT
21、CmSiO2探针细胞系 (5、10、20、40g/ml) 进行消化、离心后, 细胞悬浮于 1%的琼脂糖。采用 Siemens Magnetom Trio 3.0T MR 扫描仪, 八阵列环形线圈。扫描序列与参数:T2WI, TE 13.8 ms, TR4 000ms, 层厚 2mm, 层间距 1mm, FOV 120mm120mm, 矩阵 128128, NEX 1。图 1 p32 在胰腺癌组织和细胞系中的表达 A.人和小鼠的胰腺癌和癌旁胰腺细胞中 p32 表达的荧光染色 (绿色) , 同时标有 EpCAM (红色) , 细胞核用 DAPI 复染 (蓝色) , 比例尺为 50mm (40) ;
22、B、C.Western Blot 检测 p32 总蛋白 (B) 表达和在提取细胞、组织中的膜蛋白表达 (C) 下载原图1.5 C57BL/6 小鼠全身给药后观察探针在原位胰腺癌组织内的分布对原位胰腺癌荷瘤 C57BL/6 小鼠于建模 3 周后腹腔注射 1%戊巴比妥钠 (70mg/kg 体质量) , 经尾静脉注射含 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 或Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针的分散 PBS (铁浓度 0.1mM) , 共 0.2ml。4h 后, 处死 12 只小鼠, 并同时切除肿瘤、胰腺、肝、脾、肾、心、肺, 固定、切片 (厚度 4m) , 荧光显微镜下观察。
23、1.6 C57BL/6 小鼠原位胰腺肿瘤的体内 MR 成像麻醉剩余的 3 只小鼠模型, 进行 MR 扫描。经尾静脉注入含 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 或 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针的 PBS 0.2 ml (铁浓度 0.1mM) 。扫描序列与参数:T2WI, TR 2 000ms, TE22.5ms, 层厚 1 mm, 层间距 1 mm, FOV 120 mm120 mm, 矩阵 256160, NEX 1。在 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 或 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针注射前、注射后 1、2、4、24h 获取 MR
24、 图像。2 结果2.1 p32 在胰腺癌组织和细胞系中的表达p32 蛋白在 C57BL/6 衍生的胰腺癌细胞系和其相应的肿瘤组织中有表达。免疫组化染色可见胰腺癌组织中的 p32 蛋白表达;标记的 EpCAM 可区分癌细胞与基质细胞。多数 p32 表达细胞为上皮来源 (EpCAM 双阳性染色) , 少数表皮细胞来源于间质细胞, 见图 1A。蛋白免疫印迹结果显示, 小鼠胰腺癌细胞系 Pan02 和小鼠内皮细胞系 MS1 的总蛋白 p32 表达量相同, 而 Pan02 膜表面的 p32 含量高于 MS1。在肿瘤组织提取的膜蛋白中 p32 的表达水平也高于荷瘤 C57BL/6 小鼠正常器官中的相应部位
25、, 而在肿瘤组织和正常组织的全蛋白中 p32 表达水平相似, 见图 1B。2.2 LyP-1 靶向性磁共振-荧光双模态分子探针的特征多功能探针表示为 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2, 平均直径 45nm 且具有良好的核-壳结构 (图 2A) 。投射电子显微镜 (transmission electron microscopy, TEM) 图像可见暗的磁芯被灰色多孔二氧化硅壳包围, 且孔隙直径约 2.0nm (图 2A) 。SEM 图像显示多功能核-壳探针均有良好的分散性, 其平均直径约 45nm, 与TEM 结果一致 (图 2B) 。2.3 流式细胞术测定和体外 MR 成像与 Fe3O
26、4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 探针共同培养 4 h 后, Pan02 细胞平均荧光强度急剧增加 (即使浓度低至 5g/ml) , 见图 3A。随浓度的增加, 荧光强度略有增加, 达平台期的浓度为 40g/ml。而非靶向 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针培养的 Pan02 细胞的荧光强度仅为 LyP-1 探针培养的 50%左右。随 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 探针浓度增加, Pan02 的 T2WI 信号明显减低, 即越来越多的磁性探针与 Pan02 细胞结合。而 Pan02 细胞与 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2共培养后并未观察到明显的
27、MR 对比度变化, 即两者结合不佳。MS1细胞组中无明显信号减低 (图 3B) 。图 2 磁共振-荧光双模态分子探针的形态特征 A.透射电子显微镜图像;B.扫描电子显微镜图像 下载原图图 3 流式细胞术和体外磁共振成像的分析 A.平均荧光强度的比较;B.Pan02 和MS1 细胞与不同浓度的探针温育后的 T2WI 信号变化 (1:Pan02+Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1;2:Pan02+Fe3O4SiO2-FITCmSiO2;3:MS1+Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1;4:MS1+Fe3O4SiO2-FITCmSiO2) 下载原图2.4 多功能探针在带
28、有原位胰腺癌的 C57BL/6 小鼠系统给药后的组织分布在注射 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 探针的小鼠肿瘤组织中有 FITC 标记的探针积聚。虽然探针呈不均匀分布, 但其分布与 p32 蛋白高度重叠。除几个粗荧光颗粒残留在肝脏和脾脏, 在心脏、肺或肾中几乎均未检测到荧光探针。在注射 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针的荷瘤 C57BL/6 小鼠中, 因缺乏高度分散的探针和肿瘤细胞的特异性相互作用, 在肿瘤组织中无明显的荧光探针积累 (图 4) 。2.5 体内 MRI 比较 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 探针给药前后的 T2WI 信号发现,
29、给药后 1h 在肿瘤区域的 T2WI 信号逐渐减少, 4h 达到最低强度。即使在给药 24h 后, 由于二氧化硅壳的保护, 磁性探针的稳定性仍良好, 肿瘤区域的信号降低仍然存在 (图 5) 。在注入 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2探针的小鼠肿瘤组织中未观察到明显的 MRI 信号变化。3 讨论本研究表明特有的 p32 蛋白在 C57BL/6 衍生的胰腺癌细胞系和其相应的肿瘤组织中均有表达, 且 p32 在小鼠 C57BL/6 原位胰腺癌中的表达远多于其在癌旁胰腺组织中的表达。在磁性探针的二氧化硅壳中掺入 FITC 有利于体外利用流式细胞术定量研究功能性探针与细胞的结合6-7。本研究结果证
30、实, 即使被固定于多功能探针的表面, LyP-1 也可以特异结合 Pan02 细胞。由于 MS1 缺乏 p32 的表达, 无论探针是否与 LyP-1 肽连接, MS1 几乎不能捕获探针, 产生的荧光强度也非常低。基于荧光标记和 P32 受体免疫组化染色, 本研究表明 LyP-1 与其相应的 p32 受体结合具有高度靶向性。MRI 强度主要由探针的浓度决定6-11。本研究中, 采用 MRI 用于研究测量Pan02 和 MS1 细胞与不同浓度的探针孵育后的 T2WI 信号变化, 体内实验进一步证实超微超顺磁性 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 探针因其具有超顺磁性, 可用于 MR
31、 成像, 且耦联的 LyP-1 可实现其在胰腺癌的高度靶向性, 从而在分子水平上实现 MR 成像。本研究发现 p32 在小鼠胰腺癌细胞系 Pan02 及其同系原位移植瘤中膜异常表达。p32 配体 (LyP-1) 与 FITC 标记的磁性介孔二氧化硅探针结合, 可精确检测胰腺癌, 为设计多功能 LyP-1 耦联的探针用于胰腺癌的早期诊断奠定了基础。此外, 本研究胰腺癌模型建立于有免疫活性的 C57BL/6 小鼠, 相信 LyP-1 耦联的磁性探针也可为胰腺癌免疫治疗的研究提供新的思路。图 4 多功能探针在带有原位胰腺癌的 C57BL/6 小鼠系统给药后的组织分布 (200) A.被注射 Fe3O
32、4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 探针的小鼠;B.被注射Fe3O4SiO2-FITCmSiO2 探针的荷瘤 C57BL/6 小鼠 下载原图图 5 MRI 比较载有胰腺癌的 C57BL/6 小鼠给药前后 T2WI 信号的变化 A.注入Fe3O4SiO2-FITCmSiO2-LyP-1 探针后即刻 (A) 、1h (B) 、2h (C) 、4h (D) 、24h (E) ;注入 Fe3O4SiO2-FITCmSiO2 探针后即刻 (F) 、1h (G) 、2h (H) 、4h (I) 、24h (J) 下载原图参考文献1Siegel R, Naishadham D, Jemal A.Ca
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