1、气相、液相色谱技术及应用,昆虫生理毒理组,一、色谱学发展简史 二、色谱学基本原理 三、色谱仪的基本结构,一、色谱学发展简史 二、色谱学基本原理 三、色谱仪的基本结构,色谱法（chromatography）是20世纪初由俄国植物学家Tswett发明并命名的 1903年，他做了一个著名的实验，把干燥的叶用石油醚萃取后，将少量的萃取液倾入填充有沉降CaCO3的直立玻璃管柱的顶端，然后用石油醚洗脱，发现叶中的色素在CaCO3柱上互相分离，形成不同颜色的色带。他把这种方法命名为色谱法（Chromatography）。,1931年，Kuhn和Lederer用填充氧化铝粉末的柱管将胡萝卜素中两种性质非常相似
2、的烃的异构体（-和-胡萝卜素）分离成功，才引起人们的注意，认识到色谱法在分离混合物方面有着广阔的前景。 1940-1943年，Tiselius发展了吸附色谱，并由于在吸附色谱和电泳等方面做出的重要贡献而获得1948年的诺贝尔化学奖。 1941年，Martin和Synge在研究氨基酸分离时又发明了分配色谱法，他们因此获得了1952年诺贝尔化学奖。,一、色谱学发展简史 二、色谱学基本原理 三、色谱仪的基本结构,色谱是一种分离技术，当这种分离技术应用于化学分析，就是色谱分析 色谱分析的基本要求是实现各混合物的分离 它的分离原理是使混合物中各组分在两相间进行分配：即固定相、流动相 固定相分两类：活性固
3、体、活性液体 流动相一般为惰性气体或有机溶剂,1.色谱法分类按两相物理状态分类： 气-固色谱（gas-solid chromatography, GSC） 气-液色谱（gas-liquid chromatography, GLC） 液-固色谱（liquid -solid chromatography, LSC） 液-液色谱（liquid-liquid chromatography, LLC）按固定相形态分类：填充柱色谱 柱色谱 毛细柱色谱（开管式色谱）,1.色谱法分类按分离过程物理化学原理分类： 吸附色谱：用固体吸附剂做色谱固定相，样品各组分在吸附剂上吸附力大小不同。 分配色谱：用液体做固定相
4、，利用试样组分在固定相中溶解、吸收或吸着能力不同，因而两相分配系数不同进行分离。 离子交换色谱：离子交换剂为固定相，分离离子型化合物 还有：离子对色谱、凝胶色谱、络合色谱、亲和色谱等。,2.色谱过程:由于各组分在固定相的分配系数或吸附和脱附能力有差异，各组分在色谱柱中的滞留时间也就不同，即它们在柱中向前移动的速率不同。随着流动相不断流过，组分在柱中两相间经过了反复多次的分配和平衡过程，当移动一定柱长以后，试样中各组分即可得到较完整的分离。,色谱图的基本结构：,1基线 2色谱峰 3峰高与峰面积 4 保留时间,色谱图：,色谱图：,一、色谱学发展简史 二、色谱学基本原理 三、色谱仪的基本结构,三、色
5、谱仪的基本结构 3.1 气相色谱仪 3.2 液相色谱仪,三、色谱仪的基本结构 3.1 气相色谱仪 3.2 液相色谱仪,3.1气相色谱仪的基本结构,3.1气相色谱仪的基本结构,流动相：气-液色谱分离中载气是惰性的，仅携带样品通过色谱柱。气-固色谱载气与组分一起与固体吸附剂作用，因而对气谱分离具有一定影响。 一般载气主要为：氮、氢、氦、氩、空气、氧气、二氧化碳等。 要求：纯度高,3.1 气相色谱仪的基本结构,进样系统：进样就是把试样快速、准确的加到色谱柱头。若试样为纯液体或溶液，则要求在进样系统中瞬间气化。进样系统包括进样口、气化室。气化室的温度通常比试样中最难气化的组分的沸点高50。,3.1 气
6、相色谱仪的基本结构,气谱柱：色谱柱包括填充柱和毛细柱，填充柱是在柱内均匀、紧密填充固定相颗粒的色谱柱。填充柱管通常用玻璃、金属（不锈钢、铜、铝）或聚四氟乙烯制成。柱长1-3m。填充剂可以是吸附剂（气-固色谱），也可以是涂有固定液的载体（气-液色谱）。毛细柱一般为开管柱，即在毛细柱内壁上涂有固定液。,3.1 气相色谱仪的基本结构,固定相:气-固色谱以固体吸附剂作为固定相，例如：炭质吸附剂、硅胶、氧化铝等。气-液色谱以涂有固定液的载体作为固定相。固定液系涂渍在载体表面上起分离作用的物质，在操作温度下不易挥发的物质。例如：聚硅氧烷 。,3.1 气相色谱仪的基本结构,检测器：是能检测色谱柱流出组分及这
7、些组分量的变化的器件，其功能是将经色谱分离的组分的物质信号转化为易于测量的电信号，故也称为“换能器”。最常用的检测器是热导检测器（TCD）和火焰离子化检测器（FID）。此外，电子俘获检测器（ECD）和火焰光度检测器（FPD）也用得比较多。,问题：,1、为什么程序升温可以更好的实现混合物的分离？,问题：,恒温气相色谱的柱温恒定在试样平均沸点，如试样的沸程很宽，则低沸点组分因柱温太高而色谱峰窄，相互重叠，而高沸点组分又因柱温太低，洗出很慢，有些甚至不能洗出如果采用程序升温，采用足够低的初始温度，低沸点组分最先洗出，得到很好分离，随着柱温升高，较高沸点的组分也能较快洗出，得到良好的峰形,问题：,2、
8、为什么需要分流？由于开管柱载气体积流速很小，将样品从汽化室冲洗到色谱柱需要较长时间，导致进样器内色谱带扩张。此外，开管柱样品容量小，采用填充柱常规进样方式，引入样品量将超过色谱柱负荷,问题：,3、气谱峰的拖尾与哪些因素有关？如何消除？,问题：,与载体、样品类型、进样量等因素有关。样品含脂肪烃、芳香烃、烯烃等成较弱的拖尾；含羟基、羧基的醇、酸等严重拖尾；脂类拖尾较小。进样量小，拖尾弱，进样量大，拖尾严重。,问题：,尽量减少进样量 形成衍生物,使用气相色谱注意事项,综上所述，使用仪器时，应注意：1.样品要进行净化，提纯2.进样量要控制在一定范围内3.进样要迅速4.柱温要控制在300 以内，以免损害
9、柱子,三、色谱仪的基本结构 3.1 气相色谱仪 3.2 液相色谱仪,3.2 液相色谱的基本结构,流动相：种类较多。改变流动相的性质和组成，是提高色谱系统分离度和分析速度的重要手段 基本要求：保持色谱柱的稳定性、化学惰性、必须适合所使用的检测器、具有溶解样品的能力、溶剂的清洗和更换方便、毒性小、价格便宜、纯度高,3.2 液相色谱的基本结构,色谱柱：采用优质不锈钢管或硬质玻璃管。最好是直形柱。装柱方法复杂，需要高压泵加压。 硅胶是高效液相色谱应用最多的固定相填料。最重要的有两种：表面多孔层硅胶，全多孔微粒硅胶。,3.2 液相色谱的基本结构,高压泵：它将流动相在高压下连续不断地送入色谱系统。高压泵的
10、性能直接影响整机的稳定性、重复性和分析精度。它应具有如下性能：流量稳定；流量范围宽，且连续可调；输出压力高、密封性能好；耐腐蚀；操作、更换溶剂方便。,3.2 液相色谱的基本结构,检测器：常用的有紫外检测器（ultraviolet detector, UV）和荧光检测器（fluorescence detector, FD）。,两种色谱法的特点,1 、气相色谱法 （1）高选择性：能够分离分析性质极为相近的物质 （2）高效能（3）高灵敏度 （4）分析速度快 但由于它要求试样必须能够气化，使其应用受到一定限制。,两种色谱法的特点,2、高效液相色谱法（HPLC） （1）高效 （2）高速 （3）较高灵敏度
11、 （4）高度自动化,高效液相色谱法具有应用范围广的优点，表现在：,（1）HPLC不受试样挥发性和相对分子质量的限制，可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物，还可用于各种离子的分离。 （2）HPLC不仅可利用被分离组分的极性差别，还可利用组分分子尺寸大小的差别、离子交换能力的差别以及生物分子间亲和力的差别进行分离。它还可以用多种溶剂作为流动相，对于性质和结构类似的物质，分离的可能性比气相色谱法更大。 （3）HPLC易于收集流出的组分，可利用制备柱进行较大量的制备。,气相色谱仪的应用,多重联用气相色谱-质谱（GC-MS）液相色谱-质谱（LC-MS）曾经是实验室里最需要并被认为是一
12、定会出现的技术装备。 今天的色谱技术发展是日新月异，不但与质谱连用，还与液谱、红外光谱仪、EAG等连用，大大的加大了其应用范围。,气相色谱仪与EAG连用,气相色谱在昆虫学中的应用,气相色谱应用于昆虫化学生态学昆虫性信息素的研究 昆虫抑卵信息素的 研究,气相色谱在昆虫学中的应用,气相色谱应用于昆虫化学生态学昆虫性信息素的研究 昆虫抑卵信息素的 研究,气相色谱在昆虫学中的应用,气相色谱在昆虫学中的应用,在昆虫分类中的应用 利用气相色谱技术对昆虫表皮碳氢化合物进行分析，并以此来对昆虫进行分类鉴定，是近年来昆虫分类研究的一种新方法。它主要用于近缘种及种下类群的分类研究。 例如：用气相色谱(GC)分析冈
13、比亚按蚊（Anopheles gambiae）复合组中两个近缘种An. arabiensis、An. gambiae，结果发现C25-39的化合物分布有种间差异。,岛津气谱仪操作过程：,1.开氮气，平衡十分钟 2.打开气相色谱仪开关，转换器开关，计算机开关 3.打开Class-GC10程序 4.调出realtime 系统，设置程序升温，点击system on，激活 5.开氢气、空气，平衡十分钟 6.点火,岛津气谱仪操作过程：,关机 1.设置降温程序：进样口、柱温、检测器都为25，等待降温。 2.降温之后，关闭程序 3.关机，关闭色谱仪，转换器，拔掉电源。 4.关氢气、氮气、空气。 5整理桌面，
14、关灯。,Class-GC10工作站,工作站结构包括：修改和设定气谱条件部分(configuration)，实时分析系统（real time analysis)，分析数据和修改文件部分(post run analysis)等。 它可以把电信号传输到电子计算机上，并且进行分析。大大减轻了研究者的劳动量。,Class-GC10工作站的操作,打开real time analysis，打开setup窗口，进入Temp窗口，设置柱温，检测器，进样口温度及升温程序，点击system on，打开GC Monitor。 等到窗口出现Ready，进入Sample Login窗口，输入分析试样资料，保存。 进样，点击start,开始分析。,谢谢,
