1、染色体识别技术及其在园艺植物上的应用进展 舒巧利 陈志 党江波 杨星 孙海艳 梁国鲁 洪棋斌 向素琼 西南大学园艺园林学院 成都理工大学信息科学与技术学院 西南大学柑桔研究所 摘 要： 综述染色体制备和识别技术发展历程以及这些技术在园艺植物上的应用, 以期为园艺植物染色体结构与行为研究、系统演化分析、重要农艺性状相关基因定位、分子辅助新品种选育等提供参考。关键词： 园艺植物; 染色体识别; 核型; 带型; 荧光原位杂交; 作者简介：向素琼 E-mail:;Tel:023-68250383收稿日期：2017-05-26基金：国家自然科学基金项目 (31272138) Progress of Ch
2、romosome Identification Technology and Application on Horticultural PlantsSHU Qiaoli CHEN Zhi DANG Jiangbo YANG Xing SUN Haiyan LIANG Guolu HONG Qibin XIANG Suqiong College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University; College of Information Science and Technology, Chengdu Univer
3、sity; Citrus Research Institute, Southwest University; Abstract： This paper mainly reviewed the advances of chromosome specimen preparation, identification technology and application on horticultural plants, which would provide some references for chromosome structure research, phylogeneticy relatio
4、nship analysis, gene locating of important agronomic traits and molecular assistant new varieties selection of horticultural plants.Keyword： horticultural plant; chromosome identification; karyotype; banding; fluorescence in situ hybridization; Received： 2017-05-26染色体是细胞内遗传物质的载体。染色体是 Hofmeister 于 18
5、48 年在研究紫鸭跖草的花粉母细胞中观察到核的消失和球状小体的出现时加以描绘的, 但当时并未被命名, 直到 1888 年由 Waldeyer 将其命名为染色体。Morgan 于 1906 年确定了基因在染色体上呈线性排列并通过细胞分裂遗传给后代, 由此关于染色体结构和行为与生物性状的关系以及基因在染色体上分布的研究逐步开展起来 (Gill et al., 2008;Scholes, 2012;Sharma晁无疾和段丛, 1985;陈春丽等, 2003) 。压片法对去壁要求较低且材料不易丢失, 经压片后染色体可能会出现粘连、变形甚至断裂的现象。该法适用于大量材料的倍性鉴定、染色体计数、初步的染色
6、体形态观察 (OstergrenAhloowalia, 1965) 。经酶解去壁低渗后的材料多采用涂片法, 该法可能会使染色体丢失, 但减少了机械力对染色体的损伤, 维持了其原本的形态。涂片法适用于染色体的核型分析与倍性鉴定 (宋文琴等, 1985;张毓芳和袁妙葆, 1995;梁国鲁等, 2012) 。酶解适度时可采用滴片法, 虽然操作较复杂, 对细胞解离要求较高, 但染色体标本背景较浅 (RonildoChirino et al., 2014) 。Kirov 等 (2014b) 在滴片法的基础上运用蒸汽处理使染色体分散良好, 形态更加伸展, 并在 28 种植物上运用。由于个性差异, 不同植物
7、材料染色体标本制作的各个环节均有所差异, 但总体都遵循去壁后分散细胞的方法。因此, 研究者主要通过各自材料特点优化制片条件来制备所需的染色体 (Dang et al., 2015;涂红艳等, 2016) 。2 染色体识别技术的发展2.1 核型分析技术染色体识别经历了从外部形态到内部结构的多种识别技术的发展。染色体的形态是生物进化的表现, 同时也是生物的固有特征, 对染色体形态的分析即为核型分析。1921 年 Belling 首创压片法开启了植物染色体核型研究的大门。传统的核型分析是指染色体组在有丝分裂中期的表型, 包括染色体数量、大小和外部形态特征。它在最初的染色体识别研究中扮演了重要的角色。
8、人类的核型分析已可通过计算机自动进行, 并在遗传病诊断方面有着广泛的应用 (Schrock et al., 1996) 。陈瑞阳等 (2009) 运用压片法和去壁低渗法结合半自动核型分析软件对中国的 140 科 656 属 1 563 种主要经济植物进行了核型分析, 编撰了染色体图谱, 为中国经济植物的基因组学的研究奠定了坚实的基础。但是, 某些形态极其相似或部分区段发生了变异的染色体, 核型分析技术难以准确识别, 这就促进了学者们对染色体内部性质和结构的探索, 于是出现了染色体显带技术。2.2 染色体显带技术1968 年 Caspersson 等 (1968) 首次建立了染色体显带技术, 通
9、过各种染料的使用让染色体纵轴上的纹路得以显现, 这是染色体识别从外部形态研究向内部结构研究的一个转折点。此后, 美国细胞遗传学家 Yunis (1976) 又在原有技术的基础上建立了高分辨显带法, 这使得染色体带型更加清晰可靠。这种着色深浅相间的带纹对大多数染色体来说是独特的, 若染色体结构发生变异, 带纹也可能会发生变化, 因此可用带型来区分各条染色体以及初步鉴定染色体的变异。常用的有 C 带、G 带显带技术。C 带主要显示异染色质所在区域, 如着丝粒、随体等, 带型稳定, 应用广泛, 已经在玉米 (Carvalho梁国鲁等, 1990) 。伴随着这几种主要的带型分析方法的应用, 银染法、N
10、 带、R 带和 T 带等类似的带型分析方法也逐步发展起来。其实 Caspersson 等 (1968) 最先建立的染色体显带技术是荧光显带技术, 仅用荧光染料氮芥喹叶因处理染色体就可得到 Q 带。但由于这种荧光染料的各种缺点以及显带工具的局限性使得该技术未得到广泛应用。随着几种新荧光染料, 如 4, 6 二脒基2苯基吲哚 (4, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 、色霉素 A3 (chromomycin A3, CMA) 和碘化丙啶 (Propidium iodide, PI) 等的应用极大地促进了荧光显带技术的发展。Bickmore (2001) 发现经 D
11、API 染色后染色体带型稳定且不易褪色, 在众多植物的带型分析中得到应用 (Kim et al., 2002;Karlov et al., 2003;Liu et al., 2004) 。2.3 染色体原位杂交技术2.3.1 探针类型的发展许多染色体较小、浓缩程度较高且形态相似的物种, 染色体经过各种显带处理后只产生较少甚至不产生清晰的带纹, 不能够区分所有染色体。而 Gall 和Pardue (1969) 、John 等 (1969) 、BuongiornoNardelli 和 Amaldi (1970) 建立的染色体原位杂交技术弥补了这一缺点。将标记的核酸探针与细胞中的核酸进行杂交称为原位
12、杂交。而该技术最早使用的探针是 DNA 重复序列。由于在不同染色体上组成、分布、位置和重复数的不同, 被广泛应用于染色体识别中, 主要包括 r DNA 基因、串联重复序列和转座子等 (PardueGaginskaia向素琼等, 2007) 。此后, 低拷贝序列与全基因组序列也加入到探针的制备行列。以大片段克隆如细菌人工染色体 (BAC) 、酵母人工染色体 (YAC) 和哺乳动物人工染色体 (MAC) 等为探针的荧光原位杂交技术可定位低拷贝序列并绘制遗传图谱 (KempskiZhong et al., 1999;Kirov et al., 2014a) 。利用一个物种的全基因组 DNA 为探针,
13、 直接与其他物种的基因组杂交即基因组原位杂交 (Genomic In Situ Hybridization, GISH) 技术, 现多用于异源多倍体和种属间杂交渗入系的染色体识别 (Jellen et al., 1994;李宗芸等, 2013;Zheng et al., 2014) 。另外, 寡核苷酸也可用作探针, 主要包括寡脱氧核糖核苷酸探针和寡核糖核苷酸探针 (MateraFrischer et al., 1996) 。只需已知待测对象的部分核酸序列就可轻易合成寡核苷酸探针。该类探针是单链, 相对分子质量小, 因此其杂合效率高。研究者们多采用双标记和多标记的寡核苷酸探针来提高信号的灵敏度
14、(Stoecker et al., 2010;Schimak et al., 2015) 。实际上, 从全基因组到单条染色体或染色体上某一区域的不同核酸片段, 以及发掘的分子标记、人工合成的核酸序列都可成为染色体原位杂交的探针, 只是单拷贝或低拷贝序列存在难以杂交和不易检测的困难。2.3.2 探针标记方法与检测系统最初的原位杂交是采用含有放射性同位素的核苷酸掺入探针来进行标记并采用放射自显影进行检测。1981 年 Langer 等 (1981) 首次采用生物素标记的核苷酸探针进行杂交试验并用荧光显微镜来检测, 避免了放射性同位素的不安全性, 开创了非放射性原位杂交。1985 年, Raybur
15、n 和 Gill (1985) 首次将非放射原位杂交技术应用到植物染色体识别上。根据非放射性原位杂交中标记和检测特点的不同可分为直接标记法和间接标记法。直接标记是指掺入到探针中的标记物在杂交后可被直接检测到, 这种标记物多为可在激发光下发出荧光的物质, 常用的荧光素标记物有异硫氰酸荧光素 (FITC) 、氨甲基香豆素醋酸酯 (AMCA) 和罗达明衍生物 (TRITC) 等 (佘朝文和宋运淳, 2006) 。间接标记是指掺入到探针中的标记物不能被直接观察到, 必需通过偶联复合物专一地结合到杂交后的探针标记物上, 通过特殊的检测方法来显示杂交位点, 常用的标记物有生物素和地高辛。直接标记的探针杂交
16、后经过简单冲洗就可镜检, 省去了间接标记的探针杂交后需要偶联抗体的检测步骤, 但却不能像间接标记的探针那样进行多步骤信号放大, 灵敏性不如间接标记, 但靶序列较大时还是比较可靠的。以荧光素直接或间接标记的探针在细胞制片上进行原位杂交的技术即荧光原位杂交 (FISH) 。如今, 标记物除上述物质外, 还有近期发展起来的量子点 (Quantum dots, QD) , 如发荧光的纳米金刚石和镧系元素等, 都是一种新型荧光纳米材料, 具有宽激发窄发射、荧光寿命长不易猝灭、表面可进行多种修饰等特点 (Chan et al., 2005;Loannou et al., 2009;Parker3D-FIS
17、H 能观察到小至 1 Mb 的染色质的空间结构 (Solovei et al., 2002) ;Immuno-FISH 与 QD-FISH 都可检测到单拷贝基因, 前者还可定位蛋白质的相对位置 (Boersma-Vreugdenhil et al., 2003;Namekawa邹铅, 2013) 。ND-FISH 技术现多采用 SSR 标记为探针, 所用的染色体也无需变性, 但对含高度螺旋的染色体不适用。该技术已在黑腹果蝇、黑麦、玉米、大麦、小麦、芝麻等上有所应用 (Cuadrado et al., 2009;常晓媛等, 2013;刘艳阳等, 2013;Fu et al., 2015) 。3
18、染色体识别在园艺植物上的应用进展3.1 核型分析技术的应用陈瑞阳等 (1993, 2003) 对 64 科 205 属 356 种园林花卉植物以及 29 科 52 属261 种中国果树及其野生近缘植物进行了核型分析。此外, 该技术被用于园艺植物亲缘关系分析、进化研究、倍性鉴定、杂种真实性确认等方面 (Acosta et al., 2005;Marasek et al., 2006;Iovene et al., 2008;刘慧民等, 2010;Lao et al., 2012;She, 2016) 。曾佳诗等 (2015) 对 4 个不同株型和花色的勋章菊进行了核型分析, 发现红纹、星白和日出3
19、 个外引的品种亲缘关系较近, 与中国勋章菊亲缘关系较远。李桂芬等 (2013) 用去壁火焰低渗法对 21 个枇杷属和 1 个近缘属材料做了核型分析, 发现其核不对称性逐渐增强, 表明枇杷属植物正在不断进化。Fatima 等 (2015) 用核型分析方法鉴定了金诺橘的三倍体和甜橙的四倍体植株。Nathewet 等 (2009) 先后以 60%乙酸和1.5%乳丙酸地衣红对八倍体草莓杂交后代, 以及智利草莓染色体染色得到了清晰的核型, 可清楚识别每一染色体。刘学生等 (2013) 通过对苹果枣进行核型分析以及其染色体减数分裂行为观察, 初步鉴定苹果枣为天然同源三倍体。王金耀等 (2014) 用常规压
20、片方法首次得到当代月季 Kardinal、Solidor 和Yuzen 的核型, 并通过杂种后代的染色体核型初步鉴定了 F1代杂种的真实性。Bhadra 和 Bandyopadhyay (2016) 用常规压片方法发现野山姜、舞花姜、艳山姜是对称型核型, 就染色体长度和着丝粒指数而言, 它们存在低水平的种间及种内变异。虽然核型分析技术在园艺植物上的应用正在不断推广, 但还是远低于大田农作物。3.2 染色体显带技术的应用显带技术在园艺植物的染色体识别上起到了一定作用。梁国鲁等 (1990) 用胰酶法首次在茶树伸长的染色体上成功诱导出高分辨 G 带, 使茶树的早前期、晚前期、前中期的每一染色体上都
21、呈现清晰而丰富的 G 带带纹, 初步识别了该基因组中的各条染色体。Hu 等 (2011) 用 C 带技术研究 5 种不同颜色的风信子, 发现它们的 C 带基本都聚集在着丝粒和长臂上, 再结合染色体核型清楚区分了5 种风信子的每条染色体。Yamamoto 等 (2005) 用 CMA 荧光显带技术研究了来自日本的中熟、晚熟柑橘和酸橙的染色体, 根据染色体上 CMA 带的位置与数量将其分成 5 类染色体组型, 区分出了 7 类柑橘和酸橙并且发现它们的亲缘关系越近其带型就越相似。Yasuda 等 (2015) 依据 CMA 显带技术与已知数据认为椭圆金柑、圆形金柑、金弹是金柑属的 3 个基本种, 而
22、其它 3 个种则是它们之间的天然杂交产物。但显带技术本身也有一定的局限, 胡凤荣等 (2009) 用改良的 Giemsa C 带法对细叶百合进行 C 带研究, 发现细叶百合有 6 条染色体没有带纹, 有带纹的染色体其带纹多集中出现在染色体长臂及着丝粒区域, 因此无法区分每一条染色体。3.3 染色体原位杂交技术的应用3.3.1 重复序列的荧光原位杂交识别染色体高等植物核基因组最大的特征是含有大量保守的重复序列, 如 r DNA、卫星重复序列等。运用重复序列的荧光原位杂交技术对该类序列进行染色体定位构建了黄瓜、莴苣、芦笋、百合、绣球花、山茶花、杧果等园艺植物 r RNA 基因的物理图谱 (Hosh
23、i et al., 1999;Miyamoto et al., 1999;Matoba et al., 2001;GuLaere et al., 2008;Yonemori et al., 2010;Deng et al., 2012a) 。Kumar 等 (2014) 定位了田菁的 r RNA 基因, 发现该基因间的间隔序列在长度上存在着变异。保守的重复序列在进化历程中发生着变异, 同一物种不同染色体上各 r RNA 位点变异频率并非完全相同 (Nguyen et al., 2016) 。因此可根据重复序列位置、数量的不同来区分非同源染色体以及不同的染色体组 (Li et al., 2016
24、) 。Deng 等 (2012b) 通过对 45S r DNA 定位研究, 识别了菠菜的性染色体。He 等 (2015) 运用萝卜染色体上卫星重复序列CL1、CL25 以及 5S r DNA、45S r DNA 为探针的 FISH 技术发现萝卜的全基因组中含有 31%的重复序列且识别了萝卜的每条中期染色体。Moraes 等 (2007) 运用 CMA 带型技术和以 r DNA 为探针的 FISH 技术对葡萄柚的核型多样性进行了探究, 结果发现葡萄柚Duncan、Foster的 CMA 带型、r DNA 位点皆与葡萄柚Flame、Henderson、Marsh、Rio Red不同, 这表明栽培种
25、葡萄柚存在着遗传变异。Rho 等 (2012) 用 r DNA 为探针的荧光原位杂交技术, 鉴别了 3 个不同种的草莓并获得了更为精确的核型。Lee 等 (1998) 运用该技术发现天蓝韭在经愈伤组织培养过程中存在高比例的倍性变异。周树军等 (2008) 利用 FISH 技术鉴别了麝香百合 (Lilium longiflorum) 、柠檬色百合 (Lilium leichtlinii) 、天香百合 (Lilium auratum) 和豹纹百合 (Lilium pardalinum) 。3.3.2 GISH 技术的应用通过基因组原位杂交, 不仅可以鉴定属间的亲缘关系, 还可以检测外源染色体或片段
26、。李宗芸等 (2013) 利用 GISH 技术, 研究了甘蓝基因组与芸薹属其他 5个近缘物种基因组间的相互关系, 发现甘蓝与白菜型油菜、甘蓝型油菜基因组的分化程度较小, 与黑芥基因组的分化程度较前者高, 与芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥间的亲缘关系介于二者之间。Kitajima 等 (2007) 以椪柑、柚子的基因组 DNA 为 GISH 的探针, 再结合 CMA、DAPI 染色技术发现温州蜜柑的 6 对染色体与椪柑染色体有较高同源性, 与柚子染色体的同源性次之, 而另外 6 条杂合的染色体与它们的亲缘关系不明。Zheng 等 (2014) 用 GISH 技术发现异源四倍体白菜的染色体上存在重复序列
27、插入和删除现象。张云霞等 (2015) 利用栽培黄瓜基因组 DNA 与 45S r DNA 为探针的荧光原位杂交技术, 一次性快速显示基因组串联重复序列的分布, 同时发现染色体上该类序列的位点和拷贝数在黄瓜变种间表现出明显的分化。Tonosaki 等 (2014) 将该技术用于鉴别白菜与甘蓝单体附加系。此外, GISH 技术还在风信子、菊、草莓、葱属、忍冬 (Abd El-TwabBarba-Gonzalez et al., 2006;Budylin et al., 2014;Jang et al., 2015;MiyashitaLiu et al., 2016) 等园艺植物上有所应用。3.3
28、.3 BAC-FISH 与 TSA-FISH 技术的应用番茄、洋葱、蔷薇属植物、柑橘类植物等, 它们的染色体小, 研究进程缓慢, 其单拷贝序列则更是难以用于研究。BAC-FISH 和酪胺信号放大 FISH (TSA-FISH) 等技术为这类植物染色体的研究提供了新的细胞遗传学标记。Zhong 等 (1999) 以含抗根结线虫基因 Mi-1 的 BAC 克隆与含酸性磷酸酶基因 Aps-1 的 YAC 克隆为探针作用在番茄粗线期染色体上定位了这两种基因。Shearer 等 (2014) 运用BAC-FISH 和光学标测技术纠正了番茄基因组支架重排问题。Lou 等 (2010) 根据马铃薯、番茄、茄
29、子的荧光原位杂交图谱发现了它们的 6 号染色体存在臂内与臂间倒位现象。Silvokleio 等 (2014) 用该法与 CMA/DAPI 染色技术通过比较细胞遗传图谱发现柑橘属和枳属具有同源性。Kirov 等 (2014a) 将 TSA-FISH技术与现代分子标记技术相结合定位光叶蔷薇的 3 个连锁群, 并且成功将小至1 kb 单拷贝基因定位在中期染色体上。次年 Kirov 等 (2015) 运用高分辨率的TSA-FISH 和多色 TSA-FISH 技术成功将 7 个基因定位到光叶蔷薇粗线期染色体上, 将蔷薇属单拷贝基因的物理作图分辨率提高了 20 倍。低拷贝序列的研究不仅有益于物理图谱的构建
30、, 还能用于近缘物种间亲缘关系的鉴定。Szinay 等 (2012) 用番茄和马铃薯 BAC 克隆为探针的 m FISH 技术, 以跨种杂交后代中染色体发生了重排的植株为材料, 研究茄科作物的进化历程, 发现 Solanum etuberosum 与番茄的分类地位更近, 而 S.lycopersicoides 与 S.pennellii 具有相同的分类地位。3.3.4 Fiber-FISH 技术的应用Fiber-FISH 技术在识别与定位染色体亚微结构以及构建精确物理图谱上作出了贡献。Jackson 等 (1998) 用 BAC 克隆为探针杂交, 在拟南芥 2 号染色体纤维上发现两处间隙分别约
31、为 31 和 500kb, 并且以此建立拟南芥更为精细的物理图谱。同年, Zhong 等 (1998) 用该项技术观察了番茄染色体纤维的端粒和亚端粒结构, 发现它们具有染色体特异性且间隔区重复序列存在着变异。Hernandez-Castellano 等 (2017) 以寡核苷酸为探针杂交在拟南芥的染色质纤维上, 有效定位了 mi RNAs。Lavania 等 (2004) 以 r DNA 为探针杂交, 在吊兰 (Chlorophytum) 的染色质纤维上发现 C.borivillianum 与 C.comosum 的 r DNA数与位置存在着变异, 估测了 C.comosum 的 45S r
32、DNA、5S r DNA 的长度。Knaap 等 (2005) 从潘那利番茄渗入系与具 sun 基因 (控制番茄果形的基因) 的番茄杂交后代中选取具 sun 基因植株, 运用 Fiber-FISH 技术第 1 次构建了具sun 基因位点的遗传图谱, 且发现 sun 基因位点附近易发生等位基因变异。王三红等 (2014) 用以苹果自交不亲和基因座上的 4 种 BAC 为探针杂交在染色体纤维上, 结果将两个未深入研究的 BAC 克隆定位到了Florina染色体上且得出其大小。Mehrotra 等 (2015) 用高分辨率的 Fiber-FISH 技术揭示了菊花染色体上的卫星重复序列以及其基因组的进
33、化历程。相信在不久该项技术将应用于更多的植物 (Dechyeva徐延浩等, 2007;Maghuly et al., 2010;Jiang, 2011;张婷等, 2014) 。Fransz 等 (1996) 用双色荧光原位杂交技术定位了转基因矮牵牛的单拷贝基因, 发现了基因重排现象。喻凤和窦全文 (2013) 采用苜蓿 E180重复序列和 45S 核糖体基因为探针, 以双色荧光原位杂交的方法对 2 种紫花苜蓿有丝分裂中期染色体进行定位分析, 快而准地将两种紫花苜蓿区别开来, 并建立了分子核型。吴春红等 (2014) 从早熟的白菜基因组中提取 Cot-1 DNA 用生物素标记作探针, 25S r
34、 DNA 用地高辛标记为探针进行双色荧光原位杂交试验, 再结合已公布的核型创建了 1 个更加精确的白菜核型。Nowicka 等 (2016) 以着丝点重复序列、胡萝卜特殊重复序列、微型反向重复转座子元件为探针用多色荧光原位杂交技术识别了野生胡萝卜的染色体对, 使该野生胡萝卜的核型更加精确。3.3.6 CP 与 ND-FISH 的应用染色体涂染技术 (CP) 可一次性研究染色体片段或整条染色体变异, 有助于物理图谱的构建。Lysak 等 (2001) 以不同的 BAC 克隆为探针涂染在拟南芥处于不同分裂期的 4 号染色体上, 有助于识别同源染色体。Lou 等 (2014) 用基于单拷贝基因的染色
35、体涂染技术构建了栽培黄瓜的精确核型, 识别了处于中期、粗线期的每条染色体。此外, 发现 4 号染色体上具有非线性区域, 由于该区域存在差异, 因此在栽培黄瓜、甜瓜和刺角瓜染色体上的相关研究需用不同的涂染方式, 且构建了栽培黄瓜、甜瓜在该区域的比较染色体图谱。与传统 FISH 相比, ND-FISH 省时、省力, 最大限度地保持了染色体的形态特征。Cuadrado 等 (2009) 报道了以两个 21 nt 的人工寡核苷酸为探针作用在紫背万年青的未变性的染色体上, 无论该染色体处于有丝分裂期还是减数分裂期皆可于 1 h 内在紫背万年青的染色体端粒处观察到强信号;此外, 还发现端粒序列还存在于紫背
36、万年青的某些臂间区域。4 问题与展望植物染色体的识别较人类和动物染色体识别发展较晚, 虽然随着技术更新也经历了从外部形态到内部结构分子水平的研究过程, 但有待深入。随着显微技术、制片技术、染色技术和相应物理化学技术的发展, 由单条染色体到几条染色体识别再到全套染色体识别, 已成为植物遗传材料创建和种质资源利用的有力工具。传统的染色体识别方法, 主要通过核型、带型来识别染色体, 这对一些拥有较大染色体且亲缘关系较远的物种来说是可行的。然而对于很多亲缘关系近和有着较小染色体的植物, 很难通过传统技术进行准确识别。显然, 基于不同探针的原位杂交技术对染色体的识别更为准确、有效, 然而小片段低拷贝 D
37、NA 探针在染色体上较难检测, 需从 BAC 等文库中选出含特异序列的克隆作为探针, 但这些探针的准备和标记费时费力。而寡核苷酸探针用来 FISH 分析则相对简便, 同时寡核苷酸探针易通过商业途径购买, 价格也相对较低, 随着 FISH 相关技术的完善与发展, 利用寡核苷酸探针进行 FISH 分析一定会得到广泛应用。进行染色体识别研究时, 由于每种技术会有不同程度的自身局限性, 对不同物种的染色体识别有着明显的优势与劣势。这时就需要将不同技术有机结合, 弥补相互之间的技术局限, 从而准确识别每条染色体甚至染色体上的某一特异性位点, 如近年发展起来的 CGH、Immuno-FISH、QD-FIS
38、H 等多种新技术相结合共同实现染色体的识别。CGH 技术对近缘物种未知序列变异研究有巨大潜力, 将 CGH 技术中所用的中期染色体换为染色体纤维相信会在一定程度上提高染色体识别的分辨率。量子点荧光原位杂交技术是新兴技术, 优点颇多。园艺植物染色体识别较人类、动物、粮食作物等发展起步更晚。高粱 (杨慧勇等, 2015) 、棉花 (Gan et al, 2011) 等农作物早已深入到功能基因的研究, 研究手段也较为成熟。园艺植物染色体识别虽已逐步跨入分子水平, 但仅仅停留在 DNA 片段的研究上, 单个基因的研究很少, 有用的功能基因的研究也不多, 且仅对模式植物研究得较为深入 (Sharma&Lavania, 2016) 。因此园艺植物尤其是一些染色体小又高度杂合的类型以及染色体形态相似的材料, 其染色体研究进展缓慢、识别困难, 至今难以对所有染色体精确识别和核型分析。因此需要寻找更多的特异性分子探针, 再结合成像技术等的发展与应用才能取得令人满意的结果。相信未来会有更多更新的技术应用到园艺植物染色体识别的研究中, 也一定会在园艺植物遗传研究和辅助育种中起到重要作用。
