1、新罗丹明酰胺基硫脲荧光探针在水溶液中对 Hg2+的识别 时蕾 鹿泽华 龚毅君 毕晶晶 麻娜娜 徐晶晶 张贵生 河南师范大学化学化工学院河南省有机功能分子创制与药物创新重点实验室 摘 要： 设计并合成了一类罗丹明酰胺基硫脲 Hg2+荧光探针, 通过 1HNMR 谱和 13C 谱进行结构表征。采用紫外-可见光谱和荧光光谱研究了探针 RFS 对 Hg2+的光谱响应。结果表明, 探针罗丹明 B 酰胺基邻氟苯基硫脲 (RFS) 在水溶液中 (HEPES 缓冲溶液 pH7.2) 对 Hg2+表现出高选择性, 并具有快速、灵敏的显色和 Off-On 荧光增强效应。探针与 Hg2+作用后, 溶液颜色由无色变为
2、红色, 在 110mol/L 范围内, 探针的荧光强度与 Hg2+浓度呈线性关系。比较了因取代基的电子效应不同对探针灵敏度的影响, 通过激光共聚焦成像实现了探针 RFS 在 Hela 细胞内对Hg2+的识别检测, 表明探针 RFS 可用于检测细胞内的汞离子。关键词： 罗丹明酰氨基硫脲; Hg2+荧光探针; 水溶液; Hela 细胞; 作者简介：张贵生, E-mail:收稿日期：2017-04-21基金：国家自然科学基金 (21605039, 21603062) Rhodamine thiosemicarbazide probes for detecting Hg2+ in aqueous so
3、lutionSHI Lei LU Ze-hua GONG Yi-jun BI Jing-jing MA Na-na XU jing-jing ZHANG Gui-sheng School of Chemistry and Chemical Engineering, Henan Key Laboratory of Organic Functional Molecule and Drug Innovation, Henan Normal University; Abstract： Three of rhodamine-base fluorescent probes, which were conf
4、irmed by 1HNMR and 13CNMR detection were designed and synthesized. The interactions between Hg2+ and probes were investigated via UV absorption spectroscopy and fluorescence spectrum. The results showed that the probe RFS has good selectivity, rapid, sensitive and off-on fluorescence responses to Hg
5、2+ in water. After the addition of Hg2+ , the probes solution changed from colorless to red and showed a good linear relationship with Hg2+ in the range of 1 10 mol/L. Additionally, the probes have the detection limit of 0. 76 10-7, 0. 6 10-7 and 1. 7 10-7mol/L, respectively, suggesting their high s
6、ensitivities for Hg2+ detection and showed that the different substituents electonic effect had influence on the sensitivity of the three probes. The probe RFS was successfully used to detect Hg2+ in Hela cells in aqueous solution by laser confocal scanning microscope.Keyword： Rhodamine thiosemicarb
7、azide; Fluorescent probe for Hg2+; Aqueous solution; Hela cells; Received： 2017-04-21汞作为一种剧毒重金属, 其二价离子在低浓度时对生物体就表现出极强的生理毒性1, 建立快速、高效的汞离子检测方法在生命科学、医学、环境保护等领域中具有重大意义2。荧光分析法以其高灵敏度、高选择性、快速便捷等优点在重金属离子识别检测领域成为研究热点。罗丹明类化合物具有光稳定性好, 荧光量子产率高等光物理性质, 以罗丹明为发色团的基于 OFF-ON 机理的重金属离子探针被大量合成出来。但这些探针所用的溶液体系往往含有如乙醇、乙腈等有
8、机溶剂, 在纯水溶液中能有效检测痕量 Hg 的报道并不多11,12, 而对于识别基团的电子效应差异对探针灵敏度的影响则少见报道13,14。本课题组以罗丹明 B 为原料, 与水合肼反应成罗丹明酰肼, 再分别与邻氟、邻三氟甲基、邻甲氧基苯异硫氰酸酯反应制备罗丹明酰胺基硫脲探针 RFS, RFT 和 RFM, 研究了 3 种探针对重金属离子的识别作用及电子效应不同对探针专一性及灵敏度造成的影响。1 实验部分1.1 仪器与试剂UV-2600 紫外可见分光光度计 (日本岛津) ;AC400 型超导核磁共振仪 (TMS 作内标, 瑞士布鲁克公司) ;UPLC-TQD 液相色谱串联四极杆质谱仪 (美国沃特斯
9、公司) ;F-4500 荧光分光光度计 (日本日立公司) ;FV 1000 激光共焦显微镜 (日本奥林巴斯公司) 。罗丹明 B、邻氟苯异硫氰酸酯 (阿法埃莎 (天津) 化学公司, A.R.) ;邻三氟甲基苯异硫氰酸酯 (北京百灵威科技公司, A.R.) ;邻甲氧基苯异硫氰酸酯 (梯希爱 (上海) 化学工业公司, A.R.) ;水合肼 (上海博迪化工公司, A.R. (80%, w/w) ) ;金属硝酸盐与硫酸盐为结晶水合物;蒸馏水为二次蒸馏制得。1.2 探针的制备及检测条件1.2.1 新罗丹明酰胺基硫脲 (RFS, RFT, RFM) 荧光探针分子的合成通过罗丹明 B 酰肼与不同取代的苯基异硫
10、氰酸酯的反应制备了 3 种新罗丹明 B酰胺基硫脲化合物。反应式见图 1。图 1 探针 RFS、RFT 与 RFM 的合成路线 Fig.1 Synthesis route of RFS, RFT and RFM 下载原图实验方法:在 50 m L 的圆底烧瓶内将罗丹明 B (1.78 g, 4 mmol) 溶于 20 m L无水乙醇溶解。搅拌下加入 1.6 m L 浓度为 80%的水合肼溶液, 回流 7 h, TLC监测反应终点。将反应体系冷却至室温, 柱层析 (乙酸乙酯:石油醚=1:1, V/V) 分离得罗丹明酰肼, 产率为 90%。称量邻氟苯异硫氰酸酯 (0.0752 g, 0.5 mmol
11、) 和罗丹明酰肼 (0.2292 g, 0.5 mmol) 至 25 m L 的圆底烧瓶内, 加入 5 m L 干燥异丙醇, 85油浴中搅拌下回流 10 h, TLC 监测反应完全。中性氧化铝作为固定相进行柱层析 (石油醚:乙酸乙酯=10:2, V/V) 分离纯化, 得白色粉末, 罗丹明 B 酰胺基邻氟苯基硫脲 (RFS) , 产率 80%。M.P:127C-129C, H NMR (400 MHz, CDCl 3) :8.07 (d, J=7.1 Hz, 1H) , 7.697.56 (m, 3H) , 7.557.48 (m, 1H) , 7.45 (d, J=8.0 Hz, 1H) ,
12、7.38 (t, J=7.4 Hz, 1H) , 7.29 (d, J=7.5 Hz, 1H) , 7.23 (t, J=7.6 Hz, 1H) , 7.06 (s, 1H) , 6.476.37 (m, 4H) , 6.16 (dd, J=8.8, 2.5 Hz, 2H) , 3.27 (tt, J=14.9, 7.6 Hz, 8H) , 1.08 (t, J=7.0 Hz, 12H) .C NMR (101MHz, CDCl3) 181.92 (s) , 166.88 (s) , 154.24 (s) , 150.08 (s) , 149.27 (s) , 134.76 (s) , 134
13、.32 (s) , 129.07 (d, J=3.7 Hz) , 127.80 (d, J=5.2 Hz) , 126.53 (d, J=14.5 Hz) , 124.78 (s) , 123.94 (s) , 108.34 (s) , 103.86 (s) , 98.12 (s) , 77.46 (s) , 77.14 (s) , 76.83 (s) , 67.31 (s) , 44.39 (s) , 12.54 (s) , LC-MS:m/z=610。称取邻三氟甲基苯异硫氰酸酯 (0.0752 g, 0.5 mmol) , 邻甲氧基苯异硫氰酸酯 (0.0752 g, 0.5 mmol) 分
14、别与罗丹明酰肼 (0.2292 g, 0.5 mmol) 反应, 得到相应的罗丹明 B 酰胺邻三氟甲基苯基硫脲 RFT (产率 82%) , M.P:120C-123CH NMR (400 MHz, CDCl3) :7.97 (d, J=7.2 Hz, 1H) , 7.767.67 (m, 2H) , 7.54 (dtd, J=24.2, 7.4, 1.1 Hz, 2H) , 7.227.15 (m, 2H) , 7.03 (td, J=7.8, 1.5 Hz, 1H) , 6.986.88 (m, 2H) , 6.39 (d, J=8.8 Hz, 2H) , 6.33 (d, J=2.5 H
15、z, 2H) , 6.12 (dd, J=8.9, 2.5 Hz, 2H) , 3.19 (dd, J=7.0, 4.5 Hz, 8H) , 1.02 (t, J=7.0 Hz, 12H) 。C NMR (101 MHz, CDCl 3) :183.76 (s) , 163.57 (s) , 152.22 (s) , 149.00 (s) , 148.86 (s) , 133.94 (s) , 134.62 (s) , 129.41 (s) , 126.61 (d, J=4.9 Hz) , 126.06 (d, J=4.7 Hz) , 125.49 (s) , 125.05 (s) , 123
16、.88 (s) , 108.57 (s) , 103.15 (s) , 97.49 (s) , 77.66 (s) , 77.34 (s) , 75.73 (s) , 66.39 (s) , 44.47 (s) , 13.17 (s) LC-MS:m/z=661。罗丹明 B 酰胺基邻甲氧基苯基硫脲RFM (产率 85%) , M.P:115C-117CH NMR (400 MHz, CDCl3) :8.15 (s, 1H) , 8.05 (d, J=7.0 Hz, 1H) , 7.977.90 (m, 1H) , 7.61 (ddd, J=14.6, 7.4, 1.2 Hz, 2H) , 7.
17、487.41 (m, 2H) , 7.137.07 (m, 1H) , 7.01 (td, J=8.0, 1.6 Hz, 1H) , 6.42 (d, J=2.5 Hz, 2H) , 6.40 (d, J=2.5 Hz, 2H) , 6.16 (dd, J=8.8, 2.4 Hz, 2H) , 3.34 (q, J=7.0 Hz, 8H) , 1.17 (t, J=7.0 Hz, 12H) 。C NMR (101 MHz, CDCl 3) :180.37 (s) , 161.45 (s) , 154.77 (s) , 148.92 (s) , 148.34 (s) , 133.63 (s) ,
18、 131.31 (s) , 128.66 (s) , 127.02 (d, J=4.9 Hz) , 126.76 (d, J=4.7 Hz) , 125.24 (s) , 124.78 (s) , 123.73 (s) , 108.17 (s) , 103.49 (s) , 97.70 (s) , 76.56 (s) , 76.09 (s) , 75.33 (s) , 64.16 (s) , 54.62 (s) , 43.89 (s) , 12.88 (s) LC-MS:m/z=623。1.2.2 探针溶液的制备和检测方法配置浓度为 1.010mol/L 的 RFS 探针 DMSO 储备溶液
19、10 m L 以及浓度为1.010mol/L 的不同阳离子 HEPES 储备溶液 10 m L。测试前用 HEPES 缓冲溶液 (p H7.2) 上述储备液稀释到所需浓度。离子选择性实验配制溶液浓度为1.010mol/L, 荧光滴定实验所用探针及 Hg 的浓度区间为1.0101.010mol/L。所有测试都在定容、混合 5 min 后进行。将 3 m L 溶液转移到 1 cm 光程的双通石英比色皿中, 测量荧光强度 F (ex=568 nm, 激发狭缝宽度 5.0 nm, 发射狭缝宽度 3.0nm, 仪器灵敏度为中) 。同时, 在相同条件下测定不含金属离子的空白溶液作对照。探针 RFT 以及
20、RFM 以同样的方法进行制备与检测。通过裸眼比色检测, 发现只有探针存在的溶液呈无色, 紫外照射下无荧光。加入 Hg 后, 溶液颜色迅速变为粉红色, 紫外照射下出现较强红色荧光, 而加入其它金属离子如:K, Na, Ag, Mg, Ca, Ba, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Zn, Fe, Fe 时均无明显变化。因此系统研究了探针对 Hg 的选择性识别作用。1.2.3 细胞成像实验步骤将人宫颈癌细胞 (Chuman cervical carcinoma cell, Hela) 用磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 润洗后用 2 mmol/L 的 RFS (含有 1%DMSO 的 P
21、BS 缓冲溶液) 在 37下培养 30 min, 用 PBS 缓冲溶液清洗 3 次, 再将人宫颈癌细胞分别用 0.2, 0.5和 2 mmol/L 的 Hg Cl2的 PBS 缓冲溶液 37下培养 30 min, 再次用 PBS 缓冲溶液清洗 3 次, 用 Olympus FV 1000 激光共焦显微镜观察共焦荧光成像。2 结果与讨论2.1 p H 和时间对探针稳定性的影响配制不同体系的缓冲溶液 (p H 1.014.0) , 考察了探针 RFS 检测 Hg 的 p H 范围, 实验测得探针 RFS 本身荧光强度在 p H 1.014.0 范围内没有变化。加入等当量 Hg 后, 探针荧光在 p
22、 H 6.08.0 时, 强度几乎不变, 而在 p H8.0 时荧光强度都随着 p H 增大而减小, 所以本文中探针的离子选择性、竞争性、浓度滴定等均在 p H7.2 的 HEPES 缓冲溶液中进行。2.2 紫外和荧光光谱实验测试了探针 RFS 的紫外和荧光光谱。如图 2A 所示, 在紫外吸收光谱中探针RFS 在 568 nm 处几乎没有吸收峰。加入 110mol/L 的 Hg 后, 在 568 nm 处出现一个较明显的吸收峰。如图 2B 所示, 探针 RFS 的荧光光谱现象基本一致。RFT 与 RFM 的紫外与荧光光谱显示相似结果, 3 种探针都能够与汞离子产生响应。2.3 离子选择性与共存
23、性实验测定探针 RFS 在 568 nm 的光源激发下, 加入不同离子前后荧光光谱的变化。结果发现, 当溶液中存在 110mol/L Hg 时, 探针溶液在 589 nm 处荧光强度迅速增强至 475, 而空白探针溶液以及加入 110mol/L 的 K, Na, Ag, Mg, Ca, Ba, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Zn, Fe, Fe 等离子在 589 nm 处均无明显荧光发射, 而在补加 110mol/L 的 Hg 后, 体系在 589 nm 处同样发射出较强荧光。说明探针 RFS 对 Hg 具有较高的选择性识别能力。2.4 线性关系研究了固定探针 RFS 浓度
24、(10mol/L) 后, 加入不同浓度的 Hg 荧光强度的变化。如图 3 (A) 所示, 当体系内 Hg 浓度逐渐增大后, 体系在 589 nm 处荧光强度有明显的增强。探针分子荧光信号与 Hg 浓度在 110mol/L 范围内呈线性关系, 曲线方程 y=49.952x-31.333。由公式 LOD=3/K (n=6) 算出其检测限为0.7610mol/L。在荧光最大值 589 nm 处对 Hg 的荧光滴定曲线得出探针 RFT和 RFM 检测限分别为 0.610mol/L 和 1.710mol/L。探针 RFM 在相同测试条件时 589 nm 处的荧光强度过低, 如图 3 (B) 所示, 苯环
25、上取代基为甲氧基即供电子基时探针 RFM 对汞离子识别灵敏度较差, 苯环上取代基为吸电子基 (F or CF3) 时探针 RFS, RFT 对汞离子识别灵敏度较好。图 2 探针 RFS (10mol/L) 未加入 (a) 和加入 (b) Hg (10mmol/L) 后的紫外吸收图 (A) 和荧光光谱图 (B) (ex=568 nm) Fig.2 Absorption (A) and fluorescence (B) emission (ex=568 nm) spectra 下载原图a-未加入 Hg2+;b-加入 Hg2+图 3 探针 RFS 的荧光滴定光谱 (A) 和探针 RFS (a) 、R
26、FT (b) 和 RFM (c) 与Hg 荧光光谱 (B) Fig.3 Fluorescence titration of RFS (A) and fluorescence spectra (B) of RFS (a) , RFT (b) and RFM (c) RFS:c (Hg) =0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10mol/L; (B) c (Hg) =c (RFS, RFT and RFM) =10mol/L 下载原图2.5 反应机理参考文献15及对探针结构的分析, 以及对探针 RFS 与 Hg 反应后产物的核磁共振氢谱解析 (H NMR (400 M
27、Hz, CDCl 3) 9.55 (s, 1H) , 8.26 (d, J=7.8 Hz, 1H) , 7.84 (t, J=7.2 Hz, 1H) , 7.70 (t, J=7.7 Hz, 1H) , 7.63 (t, J=7.5 Hz, 1H) , 7.25 (d, J=7.4 Hz, 1H) , 7.08 (d, J=9.4 Hz, 2H) , 6.97 (d, J=7.8 Hz, 1H) , 6.93 (d, J=5.5 Hz, 1H) , 6.89 (d, J=7.3 Hz, 1H) , 6.77 (d, J=9.4 Hz, 2H) , 6.68 (s, 2H) , 3.53 (q,
28、 J=6.9 Hz, 8H) , 1.24 (t, J=6.9 Hz, 12H) , 可推测出罗丹明氨基硫脲类探针化合物是由分子中硫原子与汞离子反应成硫化汞沉淀, 从而导致罗丹明内酰胺的螺环结构开环而产生强荧光, 达到检测 Hg 的目的, 如图 4 所示。2.6 探针检测 Hela 细胞内 Hg为评价探针 RFS 在活细胞内检测 Hg 的能力, 将探针用于人体宫颈癌细胞 (Hela) 的激光共聚焦荧光成像。如图 5 所示, 使用 FV 1000 激光共焦显微镜观察共焦荧光成像, 能够明显观察到加入 Hg 后 Hela 细胞的荧光呈像现象。图 4 探 RFS 与 Hg 的反应机制 Fig.4 T
29、he reaction mechanism of probe RFS with Hg 下载原图图 5 探针 RFS (5mol/L) 对 Hela 细胞中 Hg 的荧光检测 Fig.5 Hgdetection in Hela cells by probe RFS (5mol/L) :Bright field images (a, d) , fluorescence images (b, e) and overlay images (c, f) of Hela cells incubated with RFS (a-c) as well as RFS and Hg (d-f) 下载原图a-探针暗
30、场图 (5mol/LRFS+0mol/L Hg2+) ;b-探针明场图 (5mol/L RFS+0mol/L Hg2+) ;c-a 和 b 的叠加图 (5mol/L RFS+0mol/L Hg2+) ;d-探针在 Hela 细胞中检测 Hg2+暗场图 (5mol/L RFS+10mol/L Hg2+) ;e-探针在 Hela 细胞中检测 Hg2+明场图 (5mol/L RFS+10mol/L Hg2+) ;f-d 和 e的叠加图 (5mol/LRFS+10mol/L Hg2+) 3 结论设计、合成了一类新罗丹明酰胺基硫脲荧光探针 RFS, RFT 和 RFM, 紫外可见光谱和荧光光谱研究表明探
31、针 RFS 对 Hg 具有专一的选择性及高灵敏度, 在110mol/L 浓度范围内探针荧光强度与 Hg 浓度呈较好的线性关系。在罗丹明探针的苯基邻位上引入了极性较强的基团, 如氟、三氟甲基等, 增加了水溶性, 在中性 HEPES 缓冲溶液中就能实现对 Hg 的识别, 并成功地将探针 RFS 应用于Hela 细胞中 Hg 的检测及生物成像, 表明该探针具有一定的应用价值。比较了3 个探针识别 Hg 的性能差异, 结果表明苯基上的吸电子基团更有利于增强探针的灵敏度和荧光强度。这类罗丹明硫脲探针是反应型探针, 专一性和灵敏度高, 进一步改进罗丹明的结构, 提高其吸收波长, 设计近红外或双光子探针是我
32、们下一步的研究方向。参考文献1Sandra C, Hagar Siebner, Danika L, et al.Environ Sci Technol, 2013, 47 (7) :3082 2Garima P, Ajaya K.Singh, Surendra P, et al.Microchemical J, 2016, 128:55 3Priyanka S, Syed S, Razi R, et al.Anal Chem, 2014, 86 (17) :8693 4Huang Q, Zhou Y, Zhang Q Y, et al, Sensors and Actuators B, 201
33、5, 208:22 5Zhang S W, Adhikari R, Fang M.ACS Sens, 2016, 1 (12) :1408 6Gong Y J, Zhang X B, Zhang G S, et al.Chem Sci, 2016, 7 (3) :2275 7Gao M X, Zou H Y, Li Y F, et al.Anal Chem, 2017, 89 (3) :1808 8Han W Q, Tian M Z, Feng F, et al.Chin J Anal Lab, 2017, 36 (3) :273 韩文强, 田茂中, 冯峰, 等.分析试验室, 2017, 36
34、 (3) :273 9Sun P, Wan K, Swamy K, et al.Dyes and Pigments, 2013, 99 (2) :323 10Lin Y, Wei L, Yi X, et al.Chem Eur J, 2012, 18 (9) :2700 11Anju M and Renuka N.Appl Mater Interfaces, 2016, 8 (22) :14125 12Liu S Y, Xie Y G, Wang D W, et al.Mercury ion fluorescence sensor and its synthesis method and ap
35、plication CN 103254891 A, 2003, 8:21刘顺英, 谢叶归, 王东伟, 等.汞离子荧光传感器及其合成方法和应用, 中国专利, CN 103254891 A, 2013, 8:21 13Gong Y J, Zhang X B, Zhuo C, et al.Analyst, 2012, 137 (4) :932 14Jagannath K, Shyam B, Debabrata D, et al.Chem Phys Lett, 2017, 673:84 15Ko S, Tae J, Shin I, et al.J Am Chem Soc, 2006, 128 (43) :14150
