蛋白质组学技术在脓毒症研究中的应用.doc

1、蛋 白 质 组 学技 术 在 脓 毒症 研 究 中 的应 用 绳建敏 张雅 静 天 津 市公 安 医院 内 一科 摘 要： 脓毒症是由感染引起的一种严重的病理状态, 在重症加强护理病房中致死率较 高。 对脓毒症的早期诊断可防止其进一步发展为败血症及休克, 进而导致器 官衰 竭和死亡。 目前临床上对该病尚缺乏特异且及时的诊断手段, 难以区分脓毒症和 其他炎症反应。 基于质谱的蛋白质组学能高通量分析脓毒症患者体内蛋白及翻译 后修饰水平的表达变化, 有利于该病的早期诊断和预后生物标志物的发现, 并 能初步反映脓毒症患者机体的生理病理变化。 关键词 ： 脓毒症; 蛋白质组学技术; 生物标志物; 作 者

2、简 介： 绳建敏, E-mail: Application of Proteomics in the Study of Sepsis SHENG Jianmin ZHANG Yajing Department One of Internal Medicine, Tianjin Police Hospital; Abstract ： Sepsis is a serious pathological condition caused by infection, which has higher mortality rates in intensive care unit. Early diagno

3、sis is key to prevent sepsis from developing into severe sepsis and shock, which can result in multiple organ dysfunction syndrome and death. There is currently no specific and timely diagnosis to differentiate sepsis from other inflammations in clinical. Mass spectrometry-based proteomics is a high

4、-throughput tool to analyze differential expression or post-translation modification of proteins during sepsis progression, which is helpful to discover the early diagnostic and prognositic biomarkers, and preliminarily reflect the pathophysiological changes of the patients with sepsis. Keyword ： Se

5、psis; Proteomics technology; Biomarkers; 脓毒症是指由感染引起的全身反应综合征, 临床证实有细菌存在或高度可疑感 染灶。 脓毒症的病死率较高, 是导致非心血管疾病重症加强护理病房患者死亡的 首要原因, 通常发生在严重烧伤、创伤以及大手术后1。据美国疾控中心数据 统计, 每年有超过150 万脓毒症患者, 其中约有25 万例死亡, 而2013 年脓毒症 的医疗费用更是高达 237 万美元。 脓毒症是感染进程中的一种状态, 能进一步发 展成败血症及休克, 导致器官衰竭和死亡2, 而早期诊断可尽可能 地遏制病情 的恶化。 目前临床上尚缺乏特异且及时的诊断手段,

6、脓毒症诊断指南是建立在感 染和至少有两项全身炎症反应综合征症状的基础上, 与非感染病症的临床表现 容易混淆, 更不易区分病原微生物种类3-5 。现有的脓毒症分子机制研究方法 多样, 包括蛋白质组学、基因组学、转录组学和代谢组学等6。蛋白质组学专 注于组织、 器官或细胞全套蛋白质的研究, 可高通量分析上千种蛋白表达 及翻译 后修饰水平的变化, 寻找诊断和预后的标志物, 提供发病机制的相关信息7。 与传统的技术比较, 蛋白质组学技术具有高通量、高灵敏度和高特异性6。现 就蛋白质组学在脓毒症生物标志物发现及其机制研究中的应用予以综述。 1 蛋白质组学在脓毒 症生物标志物发现中的应用 生物标志物是由机

7、体产生的一类特异性物质, 能反映疾病的发生、 发展。 脓毒症 生物标志物有望用于诊断病原菌 感染、 病情的严重程度及药物的治疗效果。 理想 的生物标志物应快速且特异性区分脓毒症与其他非感染性炎症反应。 目前有超过 178 种蛋白被报道可用于脓毒症的诊断, 其中包括降钙素原8、 C 反应蛋白9、 白细胞介素610, 可溶性受体如髓系细胞表达的触发受体 111等, 但是这些 标志物均有一定的局限性, 缺乏特异性, 尚未有一种生物标志物能单独用于脓 毒症的诊断。 然而, 蛋白质组学能高通量展现不同样本中的差异蛋白, 是筛选生 物标志物较有潜力的一种手段12。 自蛋白质组学概念提出以来, 已有相关研究

8、将其用于脓毒症生物标志物的筛选。 以动物为模型建立的脓毒症模型可控性强, 能最大限度地控制影响因素, 样本 平行性强, 来源简单, 可分析血、尿标本及组织7。早期对盲肠结扎穿孔小鼠 血样进行研究, 采用双向荧光差异电泳与质谱联用技术分析蛋白组, 发现62 种 特征峰, 其中热稳定性糖蛋白在脓毒症发作 24 h 后下降50%, 该蛋白与钙稳态、 胰岛素敏感性有关13 。 研究报道, 采用二维电泳与基质辅助激光解吸电离飞行 时间质谱验证了差异蛋白 抗胰蛋白酶、 血液结合素、 激肽原、 酸性糖蛋白、 载脂蛋白A1 及补体 C3, 并发现脓毒症在发病过程中, N 连接糖蛋白上的糖链发生变化14 。 受

9、技术条件的限制, 当时测得的蛋白大多数是血浆中的高丰度蛋白, 且在炎症反应中会出现类似的变化, 因此其发展为生物标志物的可能性较小。 随 着技术的发展, 液相质谱联用逐渐取代了传统的二维电泳分离蛋白模式, 在蛋 白定量的灵敏度、准确性及通量方面均有了较大的提升。Jiao 等15 利用同位 素标记相对和绝对定量技术研究脓毒症大鼠模型, 筛选出了多聚素 1、 胶原凝集 素1、羧肽酶 N、丝氨酸蛋白酶和血小板因子 4 为潜在的诊断生物标志物, 而多 聚蛋白1、血小板碱性蛋白, 纤维蛋白原 、 为预后生物标志物。后期有研 究提出穿透素的还原状态可作为脓毒症的诊断指标16。 然而, 以动物模型筛选的生物

10、标志物能否同样适用于人类, 还需不断进行研究 验证。 除了进一步在临床样本上验证筛选出来的生物标志物, 还可以直接采用临 床样本进行筛选。 与动物模型不同, 临床样本较复杂, 且个体差异大, 样品要求 量亦较大。Hattori 等17基于蛋白质组学筛选差异性代谢物, 并借助蛋白质印 迹法和酶联免疫吸附测定对结果进行了验证, 发现在脓毒症患者血清中人软骨 糖蛋白39、人脂质运载蛋白 2、钙结合蛋白 S100A9 这3 种蛋白含量增加, 视黄 醇结合蛋白和维生素 D 结合蛋白含量下降。 酶联免疫吸附测定结果显示, 在脓毒 症患者血清中人软骨糖蛋白 39 升高, 且在重症加强护理病房血培养为阳性、脓

11、 毒症休克及氢化可的松替代治疗的患者升高尤为明显, 并与白细胞介素 6 水平 呈正相关。人软骨糖蛋白 39 是否可以作为新的诊断脓毒症的标志物, 仍需进一 步验证。 有研究报道, 在多发性骨髓瘤患者血清和冠状动脉疾病中人软骨糖蛋白 39 均发生了变化18-19。早期正常人的尿液中一直被认为是无蛋白的, 但Su 等20分析了脓毒症患者的尿液样本, 鉴定得到了 130 种尿蛋白, 其中 34 种出 现了差异性表达, 这些差异性表达的蛋白质主要参与抗炎、 免疫、 结 构或细胞骨 架过程。在这34 种蛋白质中, 最终筛选出 5 种蛋白质, 包括钙黏蛋白 1、触珠 蛋白、补体3、1 抗胰蛋白酶和血浆铜蓝

12、蛋白作为脓毒症鉴定的生物标志物。 蛋白翻译后修饰作为蛋白质组学重要的一部分, 其被报道可用于发现生物标志 物, De Coux 等21 收集了脓毒症患者血浆中的 N 连接糖肽进行比较分析, 包括 66 种幸存者及 60 种非幸存者的特征性糖肽, 发现幸存者体内激肽原含量上升, 而组织蛋白酶L1、骨膜素, 中性粒细胞明胶酶蛋白 及其相关脂质运载蛋白, 血 管细胞黏附因子水平下降。 此外, 还发现幸存者依赖于外在的补体和凝血级联反 应, 而非幸存者则依赖于内在的途径。 2 蛋白质组学在脓毒 症机制研究中的应用 蛋白质组学作为一种发现手段, 逐渐应用于疾病分子机制方面的研究。 蛋白质组 学可用于复杂

13、样本研究, 包括来源于脓毒症患者或模型的不同组织、免疫细胞、 体液样本。 血浆和尿液样本可提供循环系统的相关信息, 而组织如肝、 心脏可以 直接反映内脏的受损伤情况。 目前蛋白质组学在机制研究中的应用还处于初期阶 段, 采用该方法分析脓毒症发展过程中的异常蛋白, 有利于进一步了解脓毒症 的发病机制。 脓毒症的发病机制较复杂, 涉及宿主与病原体之间的影响, 复杂的 多系统作用网络为脓毒症的研究亦带来较多困难, 故其发病机制尚未明确。 脓毒 症是由机体受到病菌入侵的过度炎症所致, 已报道的发病机制包括炎性细胞过 渡活化和炎性介质泛滥、促炎介质/抗炎介质平衡失调、肠屏障功能受损及细菌 移位、免疫系统

14、功能障碍, 多个系统过渡激活以及机体代谢障碍等22 。早期Qian 等23基于蛋白质组学从脓毒症患者的血浆中鉴别出了一系列与炎症有关 的蛋白质, 如C 反应蛋白、 血清淀粉样蛋白 A 和脂多糖结合蛋白等。 Dear 等24 对3 个月月龄的C57BL/6 小鼠采用盲肠穿刺方法建立脓毒症模型, 对小鼠肝脏中 的蛋白进行分析, 发现在肝脏中发生变化的蛋白涉及一系列反应, 其中包括急 性期反应、 凝血途径、 内质网应激、 氧化应激、 凋亡、 线粒体电子转移蛋白及一 氧化氮代谢。进一步研究发现脓毒症小鼠体内亲环素含量 升高, 当抑制其受体 CD147 后, 脓毒症诱导的肾功能障碍亦减轻, 同时细胞因子

15、减少, 提示 CD147 有望 成为脓毒症新的治疗靶点。 脓毒症患者体内凝血途径过度表达在相关研究中均有 报道7,25, 炎症促进高凝状态, 而血栓形成过程中产物同时可以引起炎症。 在 炎症-血栓网络中, 血小板发挥重要作用, 可释放多种促凝及促炎的蛋白质 26 。研究报道, 脓毒症患者血小板中有 5 种蛋白质过度表达, 包括 EF 手型钙 结合蛋白、肌动蛋白、白细胞介素 1、糖蛋白 和B27。 脓毒症多发于新生儿和老年人, 其与年龄有关, 随着年龄的增长, 发病率亦升 高, 但具体机制尚未明确。 有研究针对社区获得性肺炎患者样本进行蛋白质组学 分析, 按年龄划分成两组, 一组为5065 岁患

16、者, 另一组为7085 岁患者, 研究 发现18 种急性期蛋白, 包括C 反应蛋白、 脂多糖结合蛋白、 抗胰凝乳蛋白酶 在略年轻的患者体内存在差异性表达, 而在 发展成严重脓毒症的老年患者体内 水平较低, 故反应轻的炎症反应有可能使脓毒症的发生风险增加。 与年龄较大的 患者比较, 患严重脓毒症的年轻患者体内凝血途径过度表达, 其中包括纤维蛋 白原和血管性血友病因子, 且在不同年龄段患者体内, 脂质代谢水平也呈现差 异性, 载脂蛋白 M 在老年患者中高表达, 反映炎症反应降低, 脓毒症病死率升 高28。 3 蛋白质组学在临床 研究中的限制 研究报道, 基于蛋白质组学发现的生物标志物, 结果能用于

17、临床诊断的则较少 7 。OVA1 试剂盒是第一个通过蛋白质组学发现, 最终被美国食品药品管理局批 准用于临床诊断卵巢癌的试剂盒29。OVA1 由5 种蛋白组成, 包括 CA125、 转甲 状腺素蛋白、载脂蛋白 A1、2 微球蛋白和转铁蛋白。除了 CA125, 其他4 种蛋 白均由蛋白质组学手段发现, OVA1 能提高卵巢癌检测的灵敏度, 同时提高卵巢 癌患者的存活率29 。 蛋白质组学在脓毒症研究中发挥重要作用, 但是该技术在临床中的研究仍存在 诸多限制。 首先, 蛋白质组学是一个通量低且耗时的技术。 由于蛋白质组学样品 前期处理复杂, 且对样本的处理要求较高, 需要有专业人士进行蛋白质组学的

18、 研究。 质谱对蛋白质组学样品的分析耗时长, 由于临床研究一般要求的样品量较 大, 故需要较长时间进行数据采集。 蛋白质组学定量方法包括标记定量和非标记 定量, 标记定量常用技术包括同位素标记相对和绝对定量, 串联质谱标签、 体内 稳定氨基酸同位素标记, 同位素标记相对和绝对定量每组最多标记 8 个样本, 串联质谱标签最多可达 11 个样本, 而体内稳定氨基酸同位素标记常用于两组或 三组样本研究。 标记定量相对准确, 但价格昂贵, 不适合大样本量分析30。现 有的非标记定量方法包括数据依赖采集和数据非依赖采集技术。 数据依赖采集是 蛋白质组学中应用广泛的一种质谱采集技术, 但其采集的数据缺失值

19、较多, 其信息局限在高丰度蛋白, 且前期需要预分;数据非依赖采集技术能较好地弥补数 据依赖采集缺失值多的缺点, 且能采集到大部分中度丰度以上的蛋白信息, 但 数据非依赖采集前期需要建立数据库, 对于低丰度蛋白不起作用31 。 其次, 现 有的蛋白质组学研究很多局限在样本量, 由于样品基数少, 得到的信息亦有影 响。 对脓毒症患者而言, 因缺乏及时的诊断方法, 使样本的采集较为困难。 并且, 样本采集时间、 类型、 储存时间的多样性, 亦影响样品分析结果的可重复性。 有 研究以动物建立脓毒症模型, 其可控性较临床样本强, 但动物很难模拟出人的 生理状态, 故实验结果未必适用于临床患者。 蛋白质组

20、学是一个交叉学科, 数据 的统计分析至关重要, 如何从海量的信息中发现真正有价值的信息, 就需要统 计学专业人员从专业角度寻找差异性的蛋白, 并需临床医师挑选潜在的生物标 志物, 最后以蛋白质组学发现的候选生物标志物以其他的生物学手段进行验证, 如多反应监测或酶联免疫吸附测定, 其花费大、 耗时长29。 就目前 蛋白质组学 研究的现状, 大部分蛋白质组学的相关研究均以找到差异性的生物标志物或可 能影响的通路为结局, 其缺乏生物学的解释和意义, 并限制了蛋白质组学的应 用。 4 小结 蛋白质组学技术发展迅速, 随着质谱技术的不断改进, 其灵敏度、 覆盖率、 定量 的准确性均在不断提升。 尽管目前

21、蛋白质组学仍存在诸多问题, 但仍然是脓毒症 研究中较有潜力的一种技术方法。 未来以蛋白质组学为手段寻找生物 标志物, 应 该是以临床样本为对象, 大样本分析筛选验证, 从而寻找脓毒症明确的生物标 志物。 单一的蛋白质组学难以解决生物学问题, 但蛋白质组学与分子生物学结合 可以深入研究疾病的机制, 故应以蛋白质组学为扫描手段, 找到症结, 以分子 生物学深入研究, 更大地发挥蛋白质组学的价值, 深入探究脓毒症的发病机制, 从而推动脓毒症的研究进展。 参考文献 1Angus DC, Van Der Poll T.Severe sepsis and septic shockJ.N Engl J Me

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