1、鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及进化树分析吴翠娟 1,2，李福宝 1*李刚 2,3，张坤 2，吴玉寒 4，谢玉洁 4（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036 ；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100093；3.动物营养学国家重点实验室，北京 100093；4.合肥中大生物技术发展有限公司，安徽 合肥 230088）摘要：从北京大兴区鸭场和安徽合肥肥西鸭场中分离感染菌株，通过对病鸭的临床症状和从病鸭及死鸭的剖检病变分析，疑似鸭疫里氏杆菌病例进行病料的细菌分离，并对分离的病菌进行形态培养、PCR检测、琼扩试验和外膜A蛋白的克隆，结果鉴定为鸭疫里氏杆菌，分别命名为BJY-2、BJ
2、YX-1和AH-1。并将测序结果与GenBank上公布的我国常见几种血清型相关序列进行比对，通过进化树分析结果发现BJY-2的外膜蛋白序列与FJ765034-RA2的最近；BJYX-1的外膜蛋白序列与FJ765033-RA1的相同；AH-1的外膜蛋白序列与5个血清型的较远。关键词：鸭疫里氏杆菌；分离；克隆；进化树分析鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌( Riemerella anatipestifer, RA)引起的鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种急性或慢性传染病 1，主要侵害27周龄雏鸭，是现代养鸭业中造成小鸭严重死亡的主要传染病之一。我国郭玉璞等 2于1982年在北京首次发现此病,此后在全国各地等
3、许多地区均有发生本病的报道。该病病原为鸭疫里氏杆菌,已报道有21种血清型3-4 , 各种血清型之间很少有交叉保护性 5。其中血清型1型、2型临床上最为常见, 且致病力最强。外膜A蛋白 (OmpA)具有很强的免疫原性，它可以激发机体的体液免疫反应还可以引起细胞免疫，而且具有交叉保护作用 6。吴芳等 7用抑制性差减杂交(SSH)试验发现，OmpA基因还与RA毒力有关。本研究对分离出的3株RA的OmpA基因进行克隆和序列分析，旨在从系统进化角度探讨分离株与其它血清型之间的毒力关系。并为其临床诊断和分子鉴定提供一定的理论依据。一 材料与方法（一）发病情况2008 年 10 月，北京大兴相继几个鸭场 2
4、 周龄雏鸭和成年鸭均有发病，且发病率高达10%。同期，安徽合肥肥西鸭场 6 周龄鸭发病，两个地区的病鸭发病状况相似，主要临床症状：精神萎靡，排黄白色或黄绿色稀便，咳嗽，从眼睛和鼻腔流出多量粘性或浆性分泌物，腹泻、头颈歪斜、不时甩头、有的脚肢麻痹、卧地不起，濒死期呈角弓反张。尸体剖检主要病理变化：鼻腔内积有粘液性分泌物；脑膜充血；心包内积有淡黄色纤维性渗出液，心包膜增厚；肝肿胀，表面覆盖一层淡灰色纤维素样膜；心包液混浊，心包表面有针尖大小的干酪样结节。 （二）病料来源及分离菌的鉴定1.病料来源病鸭来自北京大兴区和安徽合肥地区自然发病鸭场，无菌采取濒死期鸭的心血、脑、肝组织。2.培养性状观察各组织
5、分别接种于麦康凯培养基、鲜血琼脂平板和鸭疫里氏杆菌营养琼脂平板（简称RA 板） 。其中 RA 板置烛缸中培养，麦康凯和血平板常规培养均 37 24h48h，观察细菌的生长情况、菌落特征及溶血情况等。3.形态及染色特性将分离菌株接种于 RA 板, 37 烛缸法培养 24 h 后的培养物进行革兰氏和瑞氏染色, 光学显微镜下观察细菌的形态和染色特性。4. PCR 鉴定 对疑似鸭疫里氏杆菌病例进行 PCR 检测，采用引物 8P1、P2 可扩增 809bp 的 DNA 片段。引物序列为：P1：5ACTCAAGGAAGAGCGGATCA 3 ；P2：5GCTTCAGCAGAACCAACTCC 3 ，PCR
6、反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析。（三）琼扩实验 按文献 9方法：取大量接种于 RA 板培养物，悬浮于 1ml 的 8.5% NaCl 中，在沸水中煮沸 5min，冷却后，4000r/min 离心 5min，上清液即为琼扩抗原。操作按常规方法进行，中间孔加抗原，外周孔加阳性、阴性血清。放入湿盒内 37 48h72h，观察反应结果。（四）基因克隆、测序及序列分析 阳性 PCR 产物采用 DNA 回收试剂盒回收目的片段，然后连接 pGM-T 载体，转化到TOP10 感受态细胞，经蓝白斑筛选阳性克隆，并送至上海生工生物工程公司测序。目的片段的回收、连接及转化均按文献 10 报道的方法进行。采用 DNA
7、Star 软件对 3 菌株的OmpA 基因序列与国内常见血清型菌株的相应序列进行分析比较，绘出系统进化树。2 结果（一）细菌的分离及培养特性病料接种RA板，经37烛缸法培养24h48h后，为光滑、微突起、透明、奶油状、直径为lmm2.0 mm菌落。鲜血琼脂上长出乳白色、半透明、微凸起的圆形菌落。接种在麦康凯琼脂平板上均不生长。（二） 形态及染色特性细菌纯固体培养物经革兰氏染色结果为阴性、无芽孢的小杆菌，见稍长的丝状菌状；瑞氏染色呈两极浓染。（三） PCR 鉴定结果 不同鸭场分离株进行 PCR 扩增，产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析均出现 809 bp 大小的目的片段 见图 1 。 （四）琼扩
8、试验结果在阳性血清和抗原孔之间产生明显的特异性沉淀线，阴性血清与抗原无沉淀线。（五） 菌株 DNA 序列分析利用 DNA Star 对 3 株的 OmpA 核苷酸序列进行分析显示：BJYX-1 与 RA1 型和 RA2 型株图 1 3 分离株 RA 的 PCR 扩增结果注：1. DL5000Marker；2.BJY-2；3.BJYX-1；4.AH-1；5.Control的同源性为 100%，与 RA3 型、RA4 型和 RA5 型株同源性均为 99.9%，只有 1 个核苷酸差异；BJY-2 与 RA1 型和 RA2 型株的同源性最高为 99.8%，只有 2 个核苷酸差异，与 RA3 型、RA4
9、型和 RA5 型株同源性均为 99.6%；AH-1 与 RA1 型和 RA2 型株的同源性最高为 99.3%，与 RA3型、RA4 型和 RA5 型株同源性均为 99.1%。但 BJYX-1 和 BJY-2 分离株与 AH-1 分离株的同源性分别为 99.3%和 99.0%，差异较大。比对证实该目的片段为 RA 的 OmpA 基因序列 见表 1。（六）系统进化树分析BJYX-1 株、BJY-2 株和 AH-1 株和中国常见的 5 种血清型的进化树分析表明：BJY-2 与FJ765034-RA2 的 OmpA 序列最近，说明 BJY-2 分离株与 RA2 型毒力和血清型靠近；BJYX-1与 FJ
10、765033-RA1 的 OmpA 序列相同，说明 BJYX-1 分离株与 RA1 型毒力和血清型靠近；AH-1 与 5 个血清型代表序列较远 见图 2。表 1 3 株 RA 分离株 OmpA 基因与标准株 RA1、RA2、RA3、RA4 和 RA5 型同源性比较（%）注：1. BJYX-1; 2.BJY-2; 3.AH-1; 4.FJ765033-RA1; 5.FJ765034-RA2;809bpbp5000300020001000750500250100图 2 3 株 RA 分离株 OmpA 基因与标准株 RA1、RA2、RA3、RA4 和 RA5 型系统进化树3 讨论与小结本实验对分离菌
11、的培养特性和形态观察、PCR 试验、琼扩试验，以及 OmpA 基因测序，确定 2008 年 10 月北京大兴区和安徽合肥肥西鸭场中流行的传染性疫病，均是由 RA 引起的鸭疫里氏杆菌病。通过测序结果和 GenBank 上公布的我国常见 5 种血清型的 OmpA 比对分析，BJYX-1 与 RA1 型和 RA2 型株的同源性均为 100%，但进化树显示与 RA2 近； BJY-2 与 RA1型和 RA2 型株的同源性均为 99.8%，与 RA1 近；AH-1 与 RA1 型和 RA2 型株的同源性均为99.3%。但北京大兴的 BJYX-1 和 BJY-2 分离株与安徽合肥肥西 AH-1 分离株的同
12、源性差异很大，也许是属于这 5 型之外的其他血清型；这和 RA 复杂的血清型的相关报道是一致的。外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分，具有免疫原性且能诱导保护性免疫反应 11。吴芳等 7通过抑制性差减杂交试验发现外膜蛋白为 RA 可能的毒力基因，但没有发现明确区分 RA 毒力和非毒力菌株的标志基因。近年来，用于预防鸭疫里氏杆菌感染的疫苗，虽有灭活苗、弱毒苗、亚单位疫苗等, 但由于 RA 的多血清型，且菌苗所诱导的免疫力具有血清型特异性，所以效果不佳。因此理想的菌苗应含有主要血清型菌株，以提供有效的保护。周祖涛等 11通过对 OmpA 的研究来说明 OmpA 是 RA 最主要的外膜蛋白，而且
13、各血清型的 OmpA 蛋白同源性较高，因此可以用 OmpA 基因的表达产物建立 ELISA 方法检测 RA 所有的血清型。当前鸭疫里氏杆菌感染呈全球性流行, 是造成养鸭业经济损失的最主要传染病之一, 其血清型之多、地域分布之广、加之用药治疗易产生耐药性, 使得对该病的防制工作相当繁重 12。因此建议预防此病（1）加强饲养管理和场区环境卫生，定期进行场地消毒，杜绝或减少各种应急因素的产生。 （2）对于鸭疫里氏杆菌发病严重地区,建议在饲料中定期按疗程添加一些敏感药物进行预防，但注意不能滥用，以防鸭产品的药物残留，而影响其产品对人的安全性。参考文献：1 BW 卡尔尼克主编高福,刘文军主译. 禽病学(
14、第十版) M. 北京:北京农业大学出版社, 1999.2 郭玉璞,陈德威,范国雄,等 北京鸭鸭传染性浆膜炎的调查研究J.牧兽医学报, 1982, 13 (2) : 1013 Huang B S, Kuang J. Development of an EL ISA using a recombinant 41 kDa patial protein for the detection of R iem erella anatipestifer in-fection in ducks J . VeterinaryMicrobiology, 2002, 88: 339-349.4 Subramania
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