1、毒害艾美耳球虫配子体 Engam59 基因的克隆表达及其表达产物的免疫原性分析 刘丹丹 曹李琴 朱玉兰 许金俊 陶建平 扬州大学兽医学院江苏省高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 摘 要： 提取毒害艾美耳球虫配子体总 RNA, 应用 RT-PCR 扩增得到 Engam59 基因, 对其克隆测序并进行序列分析。结果表明, Engam59 基因全长为 1 473 bp, 为一个完整的开放阅读框, 编码 490 个氨基酸, 具有 1 个酪氨酸-丝氨酸富集区和 1 个脯氨酸-甘氨酸富集区, 与柔嫩艾美耳球虫 Etgam59 基因的同源性为 93.4%。选择该基因编码的第 211432 位氨基酸
2、间的肽段进行截短表达, 获得的重组蛋白大小在 27.69 ku 左右, 主要以包涵体的形式存在。Western-blot 分析结果显示, 该重组蛋白能被小鼠抗重组蛋白多克隆抗体和毒害艾美耳球虫病鸡康复血清识别, 表明该重组蛋白具有很好的免疫原性。本研究结果为进一步探析毒害艾美耳球虫配子体蛋白的功能与研制鸡球虫病基因工程疫苗奠定了基础。关键词： 毒害艾美耳球虫; Engam59 基因; 克隆; 原核表达; 免疫原性分析; 作者简介：刘丹丹 (1984-) , 女, 河北霸州人, 讲师, 博士, 主要从事兽医寄生虫病防治技术研究。作者简介：陶建平, 教授, 博士, 主要从事兽医寄生虫病及其诊断与防
3、治技术的研究, E-mail:收稿日期：2017-07-13基金：国家重点研发计划项目 (2017YFD0501205) Cloning and expression of Engam59 gene from Eimeria necatrix gametocyte and immunogenicity analysis of its expressed productLIU Dan-dan CAO Li-qin ZHU Yu-lan XU Jin-jun TAO Jian-ping Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control
4、of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses/College of Veterinary Medicine, Yangzhou University; Abstract： Total RNA was isolated from Eimeria necatrix gametocytes.It was used as templates for RT-PCR amplification.A 1 473 bp nucleotide sequence of c DNA had 93.4% identity to that of Etgam59
5、 of E.tenella.The c DNA ORF encoded a 490-amino acid protein containing a tyrosine-serine-rich region and a proline-glicine-rich region.The fragment of Engam59, aa 211432, was cloned into the bacterial expression vector and expressed in Escherichia coli BL21 cells.The recombinant gametocyte protein
6、had a molecular weight of 27.69 ku and was predominately expressed in the insoluble inclusion bodies.At last, the specific expression was confirmed by Western-blot using anti-His monoclonal antibody.And it could also be recognized by anti-recombinant protein polyclonal antibodies and convalescent se
7、rum.In addition, these findings presented a potential target for future recombinant subunit vaccines against coccidiosis.Keyword： Eimeria necatrix; Engam59 gene; cloning; prokaryotic expression; immunogenicity analysis; Received： 2017-07-13鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡消化道引起的一种寄生性原虫病1, 在我国每年对该病的防治耗费高达 3 亿6 亿元2。毒害艾
8、美耳球虫 (Eimeria necatrix) 是鸡球虫病的重要病原之一, 其第一代和第二代裂殖子主要发生于小肠中段, 而配子生殖只发生于盲肠3, 因此在与其他种类球虫的混合感染中, 毒害艾美耳球虫往往受竞争性抑制而使其生殖潜能降低, 故采用活疫苗免疫预防鸡球虫病的鸡群在 2 月龄左右时经常暴发毒害艾美耳球虫病4-5。长期以来, 鸡球虫病的防治主要依赖药物。但由于耐药性虫株、药物残留肉蛋与污染环境等问题, 使得鸡球虫病的防治方法由药物防治转向免疫预防6。目前已有的商品化鸡球虫病亚单位疫苗由 3 种从巨型艾美耳球虫 (E.maxima) 配子体提取的蛋白研制而成7, 临床研究与应用证实该疫苗具有
9、较好的免疫保护力8-9。迄今为止, 有关毒害艾美耳球虫的配子体蛋白及其编码基因国内外还鲜有相关报道。本研究从毒害艾美耳球虫的配子体中克隆了 1 个基因, 在对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的抗原表位分析的基础上进行了原核截短表达, 并对重组蛋白的特异性与免疫原性进行了分析。1 材料与方法1.1 虫株毒害艾美耳球虫扬州株10, 由扬州大学兽医学院寄生虫学教研室经单卵囊分离建株, 定期传代保种。试验之前, 卵囊通过鸡体传代增殖。1.2 实验动物黄羽肉鸡购自中国农业科学院家禽研究所育种中心, 雏鸡出壳后即运回实验室, 饲养在无球虫环境中, 自由采食和饮水。1.3 质粒与菌种原核表达载体 p ET-28
10、a (+) 购自 Invitrogen 公司。克隆载体 p GEM-T Easy购自 Promega 公司。宿主菌大肠杆菌 DH5 和 BL21 (DE3) 均由本实验室保存。1.4 主要试剂RT-PCR 试剂盒, Solution连接试剂盒, 高保真 Taq DNA 聚合酶均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。RNA 抽提试剂盒购自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。透明质酸酶购自 Promega 公司。RNA 酶抑制剂 (RNAsin) 、各种限制性内切酶、1 kb DNA Marker、标准低分子质量蛋白 Marker、预染蛋白 Marker 均购自 Fermentas 公司。抗 Hi
11、s 标签单克隆抗体, HRP 标记的家兔抗小鼠 Ig G、家兔抗鸡 Ig G, 均购自 BBI 公司。1.5 引物的设计与合成根据柔嫩艾美耳球虫 (E.tenella) 基因组数据库 (http:/www.genedb.org/genedb/etenella/) 中已经收录的 Etgam59 基因序列 (EIMER_contig_00030093.12) 设计特异性引物11, 上游引物:5-ATGACTCG-TC TCGCCGCCTGCGCTG-3;下游引物:5-TTA-CTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCC-3。预计扩增得到 1 644 bp 左右的特异性片段。引物由华大基因生物公
12、司合成。1.6 毒害艾美耳球虫配子体的提取以 3.510 个毒害艾美耳球虫孢子化卵囊接种无球虫黄羽肉鸡, 感染后第 158小时剖杀取盲肠, 按照彭昊等11的方法纯化配子体, 分装后保存于-70备用。1.7 配子体总 RNA 的提取所用试剂和器皿经过无 RNA 酶处理, 然后按 RNA 提取试剂盒说明书进行。1.8 Engam59 基因的 RT-PCR 扩增参照 Ta Ka Ra RNA LA PCR Kit (AMV) 试剂盒说明书扩增 Engam59 基因。1.9 PCR 产物的克隆与测序将含有目的片段的 RT-PCR 产物经试剂盒纯化回收后, 克隆到 p GEM-T Easy 载体中, 构
13、建重组载体 p GEM-T-Easy-Engam59。经过蓝白斑筛选后, 随机挑取白斑提取质粒, 通过 Eco R双酶切, 选取阳性克隆送往华大基因生物公司测序。1.1 0 Engam59 基因核苷酸序列与编码蛋白序列分析将测序得到的 Engam59 序列与数据库中收录的 Etgam59 和 Emgam56 基因进行核苷酸序列比对, 并对其编码的氨基酸进行序列分析。1.1 1 原核表达载体的构建1.1 1.1 引物的设计与合成对 Engam59 基因进行序列分析后, 根据质粒 p ET-28a (+) 上具备的酶切位点, 选取 Eco R和 Hind两个酶切位点, 设计得到的特异性引物为:上游
14、引物:5-CCGGAATTC-GCTGAGGAGGATATTGTGAAG-3, 含 Eco R酶切位点和 3 个保护性碱基;下游引物:5-CCGAAG-CTTTTATGCTGGGTAGGCGGGGTA-3, 含 Hind酶切位点和 3 个保护性碱基。预计扩增片段的长度为 687 bp。引物由华大基因生物公司合成。1.1 1. 2 表达片段的 PCR 扩增50 L PCR 反应体系:5 L 的 10反应缓冲液, 浓度为 10 mol/L 的上、下游引物各 1 L, 4 L d NTP (10 mmol/L) , 37.5L H2O, 0.5 L Ta Ka Ra LA Taq 酶, 1 L 模板
15、 p GEM-T-Easy-Engam59。反应程序:95预变性 5 min;95变性 30 s, 58退火 30 s, 72延伸 1 min, 共 30 个循环;72, 延伸 10 min。反应结束后, 用 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测。1.1 1. 3 原核表达载体的构建将 PCR 产物和 p ET-28a (+) 分别进行 Eco R+Hind双酶切, 取 50 ng 双酶切载体 p ET-28a (+) 以及 50 ng 双酶切的 PCR 产物, 总体积到 10 L, 加入等体积 solution, 16连接过夜。取 10 L 连接产物转化感受态细胞 DH5。经过卡那霉素抗性筛选后
16、, 挑取单克隆, 过夜培养, 通过菌液 PCR 鉴定挑选阳性克隆, 送往华大基因生物公司测序。1.1 2 重组蛋白的诱导表达与 SDS-PAGE 分析将测序正确的重组质粒 p ET28a-Engam59 转化感受态 BL21 (DE3) , 单菌落接种到 LB 培养液 (含 100 g/m L 卡那霉素) 中, 37200 r/min 振荡培养过夜, 按 1100 转接种 10 m L 含相同质量浓度抗生素的 LB 中, 37200 r/min 振荡培养 4 h, 加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG, 同时设置不含插入片段的 p ET-28a (+) 转化菌和 BL21 为对照, 3
17、7200r/min 诱导 4 h, 用 12%SDS-PAGE 检测表达结果。1.1 3 表达产物特异性的检测将诱导的阳性重组菌、p ET-28a (+) 质粒转化菌和 BL21 蛋白进行 12%SDS-PAGE, 并转移到硝酸纤维素 (NC) 膜上, 转印结束后将 NC 膜放置在含 30 g/L BSA 的封闭液中室温封闭 1.5 h, 随后以小鼠抗 His 标签单克隆抗体 (BBI, USA) (用封闭液稀释至 1 g/m L, 共 15 m L) 为一抗, 37作用 1.5 h, TBST 洗涤 5 min, 重复 3 次;接着用 HRP 标记的家兔抗小鼠 Ig G 为二抗, 用封闭液按
18、 15 000 稀释, 室温下作用 1.5 h, TBST 洗涤 5 min, 重复 3 次;最后用 DAB 缓冲液显色 1 min, 去离子水漂洗终止反应后室温干燥, 观察结果。1.1 4 重组蛋白的可溶性分析4 m L 重组菌诱导后离心洗涤菌体, 悬浮于 500L PBS 中, 冰浴中进行超声裂解 (功率 30 W, 开 2s, 关 3 s, 5 min) , 412 000 r/min 离心 15 min, 分别取上清和沉淀 (沉淀用 500 L PBS 稀释) , 进行 SDS-PAGE 分析, 以确定融合蛋白的存在形式。1.1 5 重组蛋白的免疫原性分析具体方法同 1.13, 一抗为
19、小鼠抗重组蛋白多克隆抗体和毒害艾美耳球虫病鸡康复血清, 二抗分别对应为 HRP 标记的家兔抗小鼠 Ig G 和 HRP 标记的家兔抗鸡Ig G。小鼠抗重组蛋白多克隆抗体由纯化的重组蛋白常规免疫 BALB/c 小鼠, 经 3 次免疫后, 摘除眼球采血分离血清获得;毒害艾美耳球虫病鸡康复血清由毒害艾美耳球虫孢子化卵囊免疫 15 日龄雏鸡, 经 3 次低剂量免疫后, 收集静脉血液分离血清获得。2 结果2.1 Engam59 基因的扩增、克隆与酶切鉴定成功扩增出 Engam59 基因序列, 大小约为 1 473bp (见图 1) 。将蓝白斑筛选得到的克隆经过 Eco R双酶切后, 出现了一条 2 99
20、7 bp 左右和一条 1 491 bp左右的目的条带 (酶切后含有载体上的部分序列, 约为 18 bp) (见图 2) 。图 1 Engam59 的 RT-PCR 扩增 Fig.1 Amplification of Engam59 gene by RT-PCR 下载原图M:DNA 分子质量标准;1:Engam59 基因的扩增产物 M:1 kb DNA Marker;1:Amplified Engam59 gene图 2 重组质粒酶切产物的鉴定 Fig.2 Identification of Engam59 recombinant plasmid di-gested by restriction
21、 enzyme 下载原图M:DNA 分子质量标准;1, 2:重组质粒的 Eco R酶切产物 M:1 kb DNA Marker;1, 2:Eco Rdigestion products from the recombinant plasmid2.2 序列测定与序列比较将酶切鉴定为阳性的克隆 p GEM-T-Easy-Engam59 送往华大基因生物公司测序。得到的 Engam-59 基因序列的长度为 1 473 bp, 为一个完整的开放阅读框。鉴于国内尚无对 Engam59 基因序列的分析报道, 将所测序列与发表在 Gene DB 中的 Etgam59 序列以及 Gen Bank 中的 Emg
22、am56 序列进行比对。Engam59 与Etgam59 的同源性为 93.4%, 而与 Emgam56 的同源性为 61.4%, 显示该基因种间保守。2.3 氨基酸序列分析经 Lasergene7.0 软件分析, Engam59 基因编码区全长为 1 473 bp, 编码 490 个氨基酸, 分子质量为 52.81 ku, 等电点 (PI) 为 5.09, p H 值为 7.0 时电离点为-9.592, 其中氨基酸构成为 122 个疏水性氨基酸 (A, I, L, F, W, V) , 41个强酸性氨基酸 (D, E) , 31 个强碱性氨基酸 (K, R) , 159 个极性氨基酸 (N,
23、 C, Q, S, T, Y) 。该基因编码蛋白富含酪氨酸、脯氨酸、丝氨酸和甘氨酸, 分别占总氨基酸含量的 6.5%、9.8%、7.1%和 9.8%, 主要集中于第 220445 位。预测蛋白的螺旋、折叠以及转角等二级结构, 显示此富集区的转角结构较多, 利于抗体结合, 具有抗原表位的可能性较大。用在线软件 (http:/imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl) 预测抗原决定簇 (见表 1) , 其中有 5 个位于此富集区, 预示其可能在免疫原性方面发挥重要作用。将此蛋白与 Et GAM59 和 Em GAM56 进行比对, 显示蛋白间存在一定的同源性, 预测此蛋
24、白可能为配子体蛋白, 在卵囊壁的形成过程中起到一定作用。表 1 抗原决定簇预测 Table 1 Antigenic determinants prediction 下载原表 2.4 原核表达载体的构建与诱导表达以构建的 p GEM-T-Easy-Engam59 载体为模板, 成功扩增出与预期结果相符且大小为 687 bp 左右的特异性片段 (见图 3) , 并将此片段连接到原核表达载体 p ET-28a (+) 中, 构建质粒 p ET28a-Engam59 后成功转化 DH5。通过菌液 PCR鉴定后选取阳性克隆进行测序, 结果显示, 连接到载体上的基因序列与预期完全一致。p ET28a-En
25、gam59 转化 BL21 的重组菌经诱导表达后进行 SDS-PAGE 分析, 融合蛋白的分子质量为 27.69 ku 左右。同时, 以 p ET-28a (+) 转化菌和BL21 未转化菌的表达产物作为对照, 经相同条件诱导后均未出现特异条带 (见图 4) 。图 3 p GEM-T-Easy-Engam59 的 PCR 鉴定 Fig.3 PCR identification of p GEM-T-Easy-Engam59 下载原图M:DNA 分子质量标准;1、2:Engam59 基因的 PCR 产物 M:1 kb DNA Marker;1, 2:PCR products of Engam59
26、 gene图 4 重组蛋白表达产物的 SDS-PAGE 分析 Fig.4 SDS-PAGE analysis of expressed recombinant pro-tein 下载原图M:蛋白质分子质量标准;1:p ET28a-Engam59/BL21 的 IPTG 诱导表达产物;2:p ET-28a (+) /BL21 的 IPTG 诱导表达产物;3:BL21 的 IPTG 诱导表达产物M:Protein molecular weight Marker;1:p ET28a-Engam59/BL21 induced by IPTG;2:p ET-28a (+) /BL21 induced b
27、y IPTG;3:BL21 induced by IPTG2.5 重组蛋白的特异性检测与可溶性分析Western-blot 分析结果 (见图 5) 显示, 重组蛋白能被抗 HIS 单克隆抗体特异性识别, 证实 Engam59 基因在体外被成功表达。可溶性分析结果 (见图 6) 显示, 重组蛋白主要以包涵体的形式存在。2.6 重组蛋白的免疫原性分析Western-blot 分析显示, 重组蛋白能被小鼠抗重组蛋白多克隆抗体 (见图 7) 以及毒害艾美耳球虫病鸡康复血清所识别 (见图 8) 。图 5 融合蛋白特异性的 Western-blot 鉴定 Fig.5 Western-blot analys
28、is of recombinant protein 下载原图M:预染蛋白质分子质量标准;1:p ET-28a (+) /BL21 的 IPTG 诱导表达产物;2:BL21 的 IPTG 诱导表达产物;3:p ET28a-Engam59/BL21 的 IPTG 诱导表达产物M:Prestained protein molecular weight Marker;1:Product from p ET-28a (+) /BL21 induc e d by IPTG;2:Pr oduc t fr om BL21 induc e d by IPTG;3:Product from p ET28a-Eng
29、am59/BL21 induced by IPTG图 6 重组蛋白的可溶性分析 Fig.6 Solubility analysis of fusion protein 下载原图M:蛋白质分子质量标准;1:重组菌诱导后的超声裂解液上清;2:重组菌诱导后的超声裂解液沉淀 M:Protein molecular weight Marker;1:Supernatant of bacterial sonicates;2:Sediments of bacterial sonicates图 7 小鼠抗重组蛋白多克隆抗体的 Western-blot 检测 Fig.7Western-blot analysis
30、by mouse anti-recombinant protein polyclonal antibodies 下载原图M:预染蛋白质分子质量标准;1:p ET28a-Engam59/BL21 的 IPTG 诱导表达产物;2:p ET-28a (+) /BL21 的 IPTG 诱导表达产物;3:BL21 的 IPTG 诱导表达产物M:Prestained protein molecular weight Marker;1:p ET-28a-Engam59/BL21 induced by IPTG;2:p ET-28a (+) /BL21 induced by IPTG;3:BL21induce
31、d by IPTG3 讨论在 7 种鸡球虫间毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫的亲缘关系最近12, 为此本试验根据柔嫩艾美耳球虫 Etgam59 的基因序列设计 1 对特异性引物, 用 RT-PCR 方法直接从毒害艾美耳球虫配子体中扩增基因, 结果成功扩增到了毒害艾美耳球虫 Engam59 基因, 与 Etgam59 基因序列比较发现两者间的同源性高达93.4%, 显示鸡球虫 gam59 基因较为保守。图 8 毒害艾美耳球虫康复血清的 Western-blot 检测 Fig.8 Western-blot analysis by anti-E.necatrix serum 下载原图M:预染蛋白质分子
32、质量标准;1:p ET28a-Engam59/BL21 的 IPTG 诱导表达产物;2:p ET-28a (+) /BL21 的 IPTG 诱导表达产物;3:BL21 的 IPTG 诱导表达产物M:Prestained protein molecular weight Marker;1:Product from p ET28aEngam59/BL21 induced by IPTG;2:Product from p ET-28a (+) /BL21 in duced by IPTG;3:Product from BL21 induced by IPTG球虫配子体蛋白是卵囊壁蛋白的前体蛋白11,
33、 在氨基酸序列上具有特征和特殊的结构域, 其中 Em GAM56 和 Em GAM82 蛋白均富含 1 个酪氨酸-丝氨酸富集区和 1 个脯氨酸-甲硫氨酸富集区, 此类富集区在囊壁的硬化和延伸方面发挥重要作用13。本课题组的前期研究结果显示, Et GAM59 蛋白中含有 1 个酪氨酸-丝氨酸和 1 个脯氨酸-甲硫氨酸富集区, 并通过免疫荧光定位试验证实, 此蛋白参与了卵囊壁的形成14。对本研究中获得的 Engam59 基因编码的氨基酸序列分析显示, En GAM59 蛋白也含有 1 个酪氨酸-丝氨酸和 1 个脯氨酸-甘氨酸富集区, 表明该基因为毒害艾美耳球虫的配子体蛋白基因, 推测该基因在卵囊
34、壁形成过程中发挥重要作用。用软件预测 En GAM59 蛋白的抗原性, 显示共有 13 个抗原决定簇, 其中位于第211432 位的酪氨酸-脯氨酸富集区和丝氨酸-苏氨酸富集区有 5 个抗原决定簇, 该类富集区也存在于巨型艾美耳球虫、堆形艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白中11,15, 提示该区域具有共同的抗原决定簇, 用该区域多肽免疫鸡可能会产生交叉免疫保护力。因此, 本研究选择该肽段进行截短表达, Western-blot 分析结果显示重组蛋白能被毒害艾美耳球虫病鸡康复血清所识别, 表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。本研究结果为进一步探析毒害艾美耳球虫配子体蛋白的功能与研制鸡球虫病基因工程
35、疫苗奠定了基础。参考文献1SHARMAN P A, SMITH N C, WALLACH M G, et al.Chasing the golden egg:vaccination against poultry coccidiosisJ.Parasite Immunol, 2010, 32 (8) :590-598. 2HAO L, LIU X, ZHOU X, et al.Transient transfection of Eimeria tenella using yellow or red fluorescent protein as a markerJ.Mol Biochem Par
36、asitol, 2007, 153 (2) :213-215. 3BELLI S I, SMITH N C, FERGUSON D J.The coccidian oocyst:a tough nut to crack!J.Trends Parasitol, 2006, 22 (9) :416-423. 4刘梅, 李建梅, 刘丹丹, 等.一毒害艾美耳球虫田间分离株耐药性分析J.中国家禽, 2011, 33 (24) :30-35.LIU Mei, LI Jian-mei, LIU Dan-dan, et al.Studies of anticoccidial drug resistance o
37、f an Eimeria necatrix field isolateJ.China Poultry, 2011, 33 (24) :30-35. (in Chinese) 5MCDOUGALD L R, FULLER A L, MCMURRAY B L.An outbreak of Eimeria necatrix coccidiosis in breeder pullets:analysis of immediate and possible long-term effects on performanceJ.Avian Dis, 1990, 34 (2) :485-487 6PEEK H
38、 W, LANDMAN W J.Coccidiosis in poultry:anticoccidial products, vaccines and other prevention strategiesJ.Vet Q, 2011, 31 (3) :143-161. 7WALLACH M G.The development of Cox Abic a novel vaccine against coccidiosisJ.World Poultry, 2002, 18:2-4. 8DALLOUL R A, LILLEHOJ H S.Poultry coccidiosis:recent adva
39、ncements in control measures and vaccine developmentJ.Expert Rev Vaccines, 2006, 5 (1) :143-163. 9BELLI S I, WITCOMBE D, WALLACH M G, et al.Functional genomics of gam56:characterisation of the role of a 56 kilodalton sexual stage antigen in oocyst wall formation in Eimeria maximaJ.Int J Parasitol, 2
40、002, 32 (14) :1727-1737. 10李建梅.四种鸡艾美球虫 ITS 区序列分析及毒害与巨型或柔嫩艾美球虫间在免疫上相互影响的研究D.扬州:扬州大学, 2011.LI Jian-mei.Cloning and sequencing analyze of the internal transcribed spacer of ribosomal DNA for four species of Eimeria and immunological interaction between E.necatrix and E.maxima or E.tenellaD.Yangzhou:Yangzhou Univercity, 2011. (in Chinese)
