1、利用野生抑制探针提升对BRAF V600E基 因痕量突变检测的研究和临床应用 彭佳 朱川 魏昆 黄庆 府伟灵 陆军军医大学第一附属医院检验科 中国人民解放军 第 324 医院体检中心 摘 要： 目的 BRAF V600E 基因痕量突变的筛查可以避免肿瘤患者无效治疗的情况出现。 方法 用内部竞争性扩增片段提高野生抑制型 (WTB) 探针对野生型 BRAF V600E 基因的抑制, 提高发生痕量突变的 BRAF V600E 基因型的检出率。结果 当模板 DNA浓度在 50 2 00ng/L 时, 构建的痕量基因突变实时荧光定量检测方法能够完 全屏蔽BRAF V600E 野生型基因扩增。该检测方法的
2、灵敏度可以达到 0.1%, 符合 基因痕量突变检测技术灵敏度的要求。在 50 例疑似结直肠癌患者的结直肠镜活 检组织中, 构建的该方法检测到 BRAF V600E 基因痕量突变的标本为 8例 (16.0%) , 具备较高的检出率。结论 构建的基因痕量突变的检测方法能够对临 床标本中BRAF V600E 基因痕量突变做快速、简便、低成本的定量分析。 关键词： BRAF V600E基因; 基因痕量突变; 结直肠肿瘤; 锁核酸; 作者简介：彭佳, 女, 主管技师, 主要从事临床分子诊断研究。 作者简介：黄庆 通信作者;E-mail:Dr.Q.H; 作者简介：府伟灵 共同通信作者, E-mail:we
3、iling_。 基金：国家高技术研究发展计划 (863计划) 资助项目 (2011AA02A121) Study and clinical application of wild-type blocking probe for improving trace amount mutation detection of BRAF V600E gene PENG Jia ZHU Chuan WEI Kun HUANG Qing FU Weiling Department of Clinical Laboratory, First Affiliated Hospital of Army Medical
4、 University; Physical Examination Center, 324 Hospital of PLA; Abstract： Objective To study the screening of trace amount mutation of BRAF V600 Egene for avoiding the appearance of ineffective treatment in cancer patients.Methods The internal competitive amplification fragments were used to improve
5、the inhibition of wild-type blocking (WTB) probe on wile-type BRAF V600 E gene to increase the detection efficiency of BRAF V600 Egenotype of trace amount mutation occurrence.Results When the template DNA concentration was 50-200 ng/L, the constructed trace amount gene mutation real time fluorescenc
6、e quantitative detection method could completely block the amplification of the wildtype BRAF V600 Egene.The sensitivity of this assay reached as high as 0.1%, which was in line with the sensitivity requirement for the gene trace amount mutation detection technique.In the colorectal biopsy tissues f
7、rom 50 cases of suspected colorectal cancer, 8 cases (16.0%) of BRAF V600 Egene trace amount mutation were detected by using this constructed method, which had higher detection rate.Conclusion The constructed gene trace amount mutation detection method can make the rapid, simple and low cost quantit
8、ative analysis for BRAF V600 Egene trace amount mutation in clinical samples. Keyword： BRAF V600Egene; gene trace amount mutation; colorectal neoplasms; locked nucleic acid; BRAF基因位于表皮生长因子受体 (EGFR) 信号通路的下游, 其突变同样能引发 蛋白激酶 (MAPK) 途径持续性激活, 从而使得表皮细胞生长不受正常调控, 导 致组织过度增生, 最终发生恶变1-2。 对结直肠癌患者的突变基因的研究发现, KRAS
9、基因的第 12、 13 密码子、 BRAF基因的第 600位密码子最容易发生基因突变, 二者具有排他性3-4。部分直肠癌患者接受爱必妥或帕尼单抗治疗无疗效的内 在原因就是在部分KRAS基因检测结果为阴性的患者中实质上存在着BRAF基因的 突变, 两种基因的排他性特征决定二者都是独立预测指标, 因此BRAF 基因的突变检测很有必要5-6。对众多的野生型基因而言, 在肿瘤发生的早期出现突变 的基因十分微量, 为了进一步提高 BRAF V600E 基因痕量突变的检出率, 野生抑 制型探针在同一个聚合酶链反应 (PCR) 的反应体系中会相互竞争结合模板互补 区域。阻断野生型 PCR产物的形成, 在野生
10、抑制型 PCR (WTB-PCR) 的基础上增 加了内部竞争性扩增片段, 引物与目标基因扩增同时, 可以用来降低高循环数 出现的碱基错配现象, 提高检出率实验结果符合基因痕量突变检测条件, 能够 运用于临床标本BRAF V600E 基因痕量突变的检测7-8。 1 材料与方法 1.1 材料 HT-29 细胞株来自美国组织培养库包含杂合突变的 BRAF V600E。来自美国组织培 养库的SW480细胞株是纯合野生型。DNA来源于第三军医大学西南医院门诊及住 院患者血液或者组织, 患者均为汉族, 本研究得到西南医院伦理委员会批准, 并与患者或其监护人签订了知情同意书。 疑似结直肠癌患者直肠镜活检组织
11、经磷 酸盐缓冲液洗涤后严格按试剂盒 (中国上海基因科技有限公司) 说明书进行操 作, 提取好的 DNA用微量分光光度仪测量浓度, 每个标本测3次取平均值。 1.2 仪器与试剂 内参基因引物终浓度 500nmol/L (SW-329/330) 荧光探针终浓度为100nmol/L (SW-1294) , BRAF V600E 基因引物终浓度为 500nmol/L (SW-458/461) 荧光探针 终浓度为250nmol/L (SW-467) , 锁核酸探针 (SW-356) 终浓度为500nmol/L, 模板浓度为100ng/L。 反应条件50, 2min;95, 2min;95, 15s;60
12、, 1min (循环60 次) , 酶为 2SuperMix-UDG。见表 1。 1.3 方法 同时加入锁核酸和作为内部竞争性扩增片段的内参基因引物对, 与发生痕量突 变的BRAF V600E基因同时扩增, 通过屏蔽BRAF V600E 野生型基因, 富集发生痕 量突变的BRAF V600E 基因, 定量检测BRAF V600E 基因特异性探针的荧光强度, 通过目标基因与内参基因之间的 CT差值计算出突变等位基因的比例, 达到对 BRAF基因痕量突变定性或定量检测的目的。提高检测基因痕量突变效率的同时, 衡量反应体系中加入 DNA的总量。 1.4 统计学处理 采用Microsoft Excel
13、 2007、SPSS19.0软件进行数据分析, 计量资料以 表示, 组间比较采用方差分析, P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 反应体系对不同浓度野生型模版的屏蔽效果 实验中采用前期提取的本科室人员志愿者健康全血 DNA作为模板, 浓度分别为 50、100、150、200ng/L, 反应体系内参基因引物终浓度为 500nmol/L, 荧光 探针终浓度为100nmol/L;BRAF V600E 基因引物终浓度为 500nmol/L, 荧光探针 终浓度为250nmol/L, 锁核酸探针终浓度为 500nmol/L, 从表2可以发现, 随着 模板浓度增加, 不论加入WTB与否, LEP
14、TIN基因组CT值无显著变化。 而BRAV600E 基因扩增组在WTB作用下对 50200ng/L的野生型模板能有效屏蔽。 表1 合成的引物和探针序列 (53) 下载原表 表2 构建的反应体系对不同浓度野生型模版的屏蔽效果 循环 数) 下载原表 2.2 内部竞争性片段参与的反应体系灵敏度、特异度及重复性评价 为了解本研究构建的检测体系灵敏度、特异度和重复性, 将HT-29突变型 DNA 与SW480 野生型DNA 按照不同的比例进行混匀, 配制成BRAF V600E 突变率分别 为50%、25%、10%、1%、0.1%的不同DNA标本, 对应的突变模板量分别为 50 000、 25 000、1
15、0 000、1 000、100ng/L。结果见图 1扩增曲线所示, CT 值随着BRAF V600E基因突变率的降低而增加;图1曲线5 表示对0.1%的突变仍能够有效检出 符合检测基因痕量突变的水平。此外, 重复实验表明重复管的两个反应之间的 CT值差异小, 说明本检测体系的重复性较好;加入的内参基因扩增稳定, 曲线6 所示。依靠已知突变比例的 DNA模板及其对应的 CT值, 可以计算出扩增效能为 93.6% (r=0.960 6) , 见图2。 图1 反应体系的灵敏度及特异度检测 下载原图 注:1为加入含有 50%BRAF 突变型基因后的扩增曲线;2为加入含有25%BRAF 突变 型基因后的
16、扩增曲线;3为加入含有10%BRAF 突变型基因后的扩增曲线;4为加入 含有1%BRAF 突变型基因后的扩增曲线;5为加入含有 0.1%BRAF突变型基因后的 扩增曲线;6为内参基因 LEPTIN 扩增曲线;7 为空白对照没有扩增 图2 突变型基因扩增标准曲线 下载原图 2.3 检测临床标本中 BRAF V600E基因痕量突变对 50例临床结直肠疑似肿瘤患者活检标本 BRAF V600E 基因 痕量突变情况分析, 结果显示8例标本为阳性, 提示50例患者标本 BRAF V600E 基因痕量突变标本约占总数的 16%。图3a显示的是利用前期构建好的体系检测 出来的BRAF V600E基因突变标本
17、, 图3a中曲线2表示加入锁核酸后, 标本中的 BRAF V600E突变基因仍有扩增, 说明该标本发生了 BRAF V600E基因突变。图 3b 显示的是加入锁核酸后, 没有特异性基因扩增产出, 该标本没有发生 BRAF V600E基因突变。同时加入锁核酸前后, 内部竞争性扩增片段的扩增并不受影响, 且显示实验结果有较好的重复性。 为进一步确认 8例标本的突变情况, 将阳性标 本扩增产物和阴性标本扩增产物送交上海生物工程公司进行测序, 结果发现抽 检标本含有BRAF V600E基因T到A的突变, 如图4a中长箭头所指的波峰, 与病 理科小标本肠镜活检组织切片染色200倍镜下免疫组化分析结果相符
18、, 见图5a。 图4b、5b显示的是临床健康肠镜组织标本 BRAF V600E 基因扩增产物测序图和肠 镜活检组织切片染色图。 图3 临床肠镜组织标本 BRAF V600E基因扩增曲线 下载原图 注:a中 1为LEPTIN 基因扩增曲线;2为BRAF V600E 突变基因扩增曲线。b中1 为BRAF V600E 突变基因;2为LEPTIN基因扩增曲线 图4 临床肠镜组织标本 BRAF V600E基因突变位点扩增产物测序 下载原图 注:a发生 BRAF V600E 基因突变扩增产物测序图;b未发生BRAF V600E 基因突变 扩增产物测序图 图5 临床肠镜组织标本免疫组化切片 下载原图 注:a
19、肠镜组织标本中分化切片;b正常肠镜组织标本切片 (200) 3 讨论 研究发现, 大约有 8%的肿瘤患者携带有BRAF 基因突变, 不同肿瘤BRAF 基因突 变率是不一致的, 黑色素瘤、甲状腺瘤及结直肠肿瘤是突变率较高的类型9。BRAF V600E是BRAF基因突变的最多的一种, 位于11号外显子或者15号外显子, 占BRAF 基因突变的 60%100%10。临床用药中发现, 利用EGFR抗体治疗的肿 瘤患者中部分出现治疗失败或者效果不明显的情况, 这除了与之前发现的 KRAS 基因突变有着主要的关系外, BRAF V600E可能扮演着非常重要的角色, 临床抗 肿瘤药物治疗之前要进行 BRAF
20、 V600E基因突变的检测, 以避免无效治疗的情况 出现就显得尤为重要11。 常见的检测基因痕量突变的方法也多种多样, 如需要 特异性的聚合酶或者对模板 DNA要求特殊处理还需要采用凝胶电泳鉴别, 费时 费力。直接测序法是检测突变的金标准, 但需要突变比例达到 20%以上才能对突 变的基因进行有效检测, 而且检测成本较高, 综合其检出效率考虑也是没有广 泛用于临床标本检测的原因12。 为此, 研究者初步构建了基于内部竞争性扩增片段提高野生型抑制性 PCR扩增 特异性的基因痕量突变实时荧光定量检测方法, 该方法首先设计了针对 BRAF V600E基因有意义链互补的寡核苷酸, 该寡核苷酸有较强的抑
21、制性, 在反应中 称为野生抑制型探针即 WTB探针, WTB探针碱基序列与野生型模板有部分重叠, 在同一个反应体系中, 竞争性地结合野生型模板, WTB探针中的锁核酸与模板结 合效率更高, 占据了引物与模板的碱基互补结合区域, 引物与野生型模板无法 结合, 达到抑制野生型基因扩增的目的。 为了避免 WTB探针与模板结合区域产生 部分非目标突变基因的扩增, 导致假阳性结果, 特别加入内参LEP-TIN基因 HQ-329/330 作为内部竞争性扩增片段, 期望消耗反应体系中多余的 DNA聚合酶 和游离碱基片段, 从而增强WTB探针对野生型BRAF V600E基因模板的屏蔽能力, 提高基因痕量突变的
22、检测效率。同时由于加入的内部竞争性扩增片段并没有与 WTB探针相对应的结合位点, WTB探针只会特异性地与之配对互补的模板区域结 合, 而不会与内部竞争性扩增片段结合, 不影响其在反应体系里的扩增。 在临床标本的DNA中, 浓度大多在50150ng/L, 检测前期实验构建反应体系 中的WTB浓度能对不同浓度的DNA模板有效屏蔽就显得很有必要, 本研究构建的 方法可以对 50200ng/L 的野生型模板能有效屏蔽, 符合临床标本的 DNA浓度 检测范围。在灵敏度、特异度和重复性检测中, 本方法能在1 000倍的野生基因 型中检测到单拷贝的 BRAF V600E突变基因, 且扩增有较好的重复性,
23、见图1所 示。 依靠已知突变比例的模板 DNA模板及其对应的 CT值, 可以计算出扩增效能。 利用加入WTB探针前后CT差值及BRAF V600E突变率的数据分析, 计算出两者之 间的线性关系, 计算出标本中 BRAF V600E基因痕量突变的量。BRAF V600E 在对 临床50例疑似结直肠肿瘤患者的活检标本检测中, 对BRAF V600E基因突变检出 率为16.0%。对发生突变的标本分别进行组织切片染色分析和突变的标本的扩增 产物测序, 进一步验证了该方法的准确性。利用野生抑制探针提升 BRAF V600E 基因痕量突变检测比测序法更经济实用, 比传统免疫组化镜下检测更简便快速, 2h内
24、可以完成临床基因痕量突变 DNA检测, 有较强的临床实用价值。 参考文献 1CHEN D, ZHANG L Q, HUANG J F, et al.BRAF mutations in patients with non-small cell lung cancer:a systematic review and meta-analysisJ.PLoS one, 2014, 9 (6) :101354. 2KARAPETIS C S, JONKER D, DANESHMAND M, et al.PIK3CA, BRAF, and PTEN status and benefit from cetu
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