1、 葡萄糖对 L02 细胞 LXR 与 ANGPTL3 基因表达的影响作者：曾建涛，王继红，黄家利，程梅 【摘要】 目的： 研究葡萄糖对 L02 细胞肝 X 受体(LXR)与血管生成素样蛋白 3(ANGPTL3)基因表达的影响，探讨 LXR 在糖尿病和脂代谢联系中的作用. 方法： 用 5.6, 7.0, 11.1, 28.0 和 33.0 mmol/L 的葡萄糖培养 L02 细胞，5.6 mmol/L 组作为对照组.用胆固醇酶联法测定各组细胞内胆固醇含量，采用 RTPCR 方法检测LXR 和 ANGPTL3 的 mRNA 表达量. 结果： 高浓度葡萄糖可促进L02 细胞内胆固醇含量上调 LXR
2、和 ANGPTL3 mRNA 表达，变化差异均有统计学意义(P0.05). 结论： 高浓度葡萄糖增加ANGPTL3 表达，可能是通过增加细胞内总胆固醇含量而激活LXR，而 LXR 的激活则引起 ANGPTL3 基因的高表达. 【关键词】 血管生成素样蛋白 3；肝 X 受体 ； 糖尿病【Abstract】 AIM: To investigate the effects of glucose on expressions of LXR and ANGPTL3 in L02 cell, and to explore the relation of LXR with the development o
3、f diabetes mellitus accompanied with hyperlipoproteinemia. METHODS: L02 cells were cultured separately in mediums containing 5.6, 7.0, 11.1, 28.0 and 33.0 mmol/L glucose, among which 5.6 mmol/L glucose group was taken as control. Quantitative analysis of intracellular cholesterol content was perform
4、ed by cholesterol enzyme link assays. The LXR and ANGPTL3 mRNA were determined by reverse trancriptase polymerase chain reaction (RT PCR). RESULTS: The expression of LXR and ANGPTL3 mRNA increased with the increase of the glucose concentration. The levels had significant difference (P0.05). The cont
5、ents of total cholesterol also increased significantly in L02 cell, and had significant difference (P0.05). CONCLUSION: Glucose may interfere ANGPTL3 mRNA through incresasing total cholesterol, activating LXR. The activation of LXR upregulates the expression of ANGPTL3.【Keywords】 angiopoietinlike pr
6、otein 3; LXR; diabetes mellitus0 引言 肝 X 受体（liver Xactivated receptor, LXRs）是核受体超家族的成员，包括两种同源亚型 LXR(NR1H3)和LXR（NR1H2）. LXRs 作为甾醇类感受器调节一系列与脂质代谢相关基因的表达. 血管生成素样蛋白 3（angiopoietinlike protein 3, ANGPTL3）是新的 LXRs 靶基因，在脂质代谢中有重要作用1-2. 本研究以人肝细胞株 L02 为研究对象，从细胞水平研究葡萄糖对 LXR 和 ANGPTL3 基因表达的影响，探讨 LXR 在糖尿病和脂代谢联系中的作
7、用.1 材料和方法1.1 材料 人肝细胞株 L02（重庆医科大学基础医学研究所）；RPMI 1640 普通培养基（美国 Gibco 公司）；新生牛血清（杭州四季青公司）；RT 试剂盒（日本 Toyobo 公司）； PCR 试剂盒（广州东盛生物公司）；LXR, ANGPTL3 和 Actin 引物（上海生物工程公司合成）；胆固醇酶联试剂（浙江伊利康公司）；PCR 仪,GelDoc 100 凝胶成像仪（美国 BioRad 公司）. 1.2 方法1.2.1 细胞分组及培养 L02 细胞以每孔 3105 个细胞接种于培养板.在含 100 mL/L 新生牛血清的 RPMI 1640 培养液中培养 36
8、h后，随机分为 5 组（G1G5），分别在不同浓度葡萄糖的培养液中培养 24 h. G1 组为对照组.1.2.2 胆固醇含量测定 5 组 L02 细胞用 RPMI 1640 培养基培养 24 h 后，用 PBS 洗细胞 2 次，加细胞裂解液裂解细胞，30 min 后再超声裂解 4 次，4 12 000 g 离心 15 min. 用 Lowry 法测定细胞裂解液的蛋白质含量. 胆固醇酶联法测定细胞裂解液的胆固醇含量. 胆固醇含量参数以细胞裂解液胆固醇含量除以细胞裂解液蛋白质含量表示(mg/g).1.2.3 两种基因 mRNA 表达的检测 按试剂说明，常规方法提取细胞总 RNA，检测总 RNA 的
9、纯度和完整性 . 用 RTPCR 方法检测各基因的 mRNA 表达量. LXR 上游引物：TCC CAC GGA TGC TAA TG，下游引物： TCC CAG GAA TGT TTG CC. ANGPTL3 上游引物：TCC AGA ACA CCC AGA AGT AAC，下游引物：CCA GCC TCC TGA ATA ACC CT. Actin 上游引物：TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA，下游引物：TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG. . PCR 反应条件为：94预变性 4 min 后进行 94 30 s，55 30 s，72 1 min，共 3
10、5 个循环，72延伸 10 min. 取各基因扩增产物6 L 用于 25 g/L 琼脂糖电泳，溴化乙啶染色后采集图像,用ANGPTLl3，LXR 与 Actin 面积灰度值的比值表示各基因mRNA 的表达量. 统计学处理：用 SPSS 13.0 软件包进行统计分析. 数据以 xs 表示，多组均数的比较采用单因素方差分析，两两之间比较用 LSDt 检验，P0.05 为差异有统计学意义 .2 结果2.1 葡萄糖对细胞内胆固醇含量的影响 随着环境葡萄糖浓度增加， 细胞内胆固醇含量也不断增加， G1G5 五组间总胆固醇含量相比较，差异具有统计学意义(P0.05) . G2G5 组分别与 G1组相比，G
11、2 组的总胆固醇升高，但差异无统计学意义(P0.05) ，而 G3G5 组差异均有统计学意义(P0.05). G3 组，G4 组和 G5组三组间两两比较，差异均无统计学意义(P0.05，表 1).表 1 葡萄糖对 L02 细胞 ANGPTL3 与 LXR 表达和胆固醇含量的影响（略）aP0.05 vs G1.2.2 葡萄糖对 LXR 和 ANGPTL3 mRNA 表达的影响 随着葡萄糖浓度增加， LXR 和 ANGPTL3 的 mRNA 表达量均增加，G1G5 各组间相比较差异具有统计学意义(P0.05). G2 组与 G1组比较，LXR 和 ANGPTL3 的 mRNA 表达量升高，但差异无
12、统计学意义(P0.05)，G3G5 组分别与 G1 组比较，LXR 和ANGPTL3 的 mRNA 表达量差异均有统计学意义(P0.05). G3 组，G4 组和 G5 组三组间两两比较，差异均有统计学意义(P0.05，图1，2).M ：marker；15：依次为葡萄糖5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/L 组. 图 1 葡萄糖对 L02 细胞 LXR mRNA 表达的影响（略）M ：marker；15：依次为葡萄糖5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/L 组.图 2 葡萄糖对 L02 细胞 ANGPTL3 mRNA 表达的影响（略）2.3 葡萄糖对 AN
13、GPTL3 蛋白质表达的影响 在蛋白质表达水平，G2G5 组分别与 G1 组比较，差异均有统计学意义 (P0.05) .此外，G2G5 组间两两比较，除了 G4 组与 G5 组差异无统计学意义(P0.05)，其它各组间差异均有统计学意义(P0.05 ，图 3).15：依次为葡萄糖 5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/L 组.图 3 葡萄糖对 L02 细胞 ANGPTL3 蛋白质表达的影响（略）3 讨论 LXR 是配体激活的转录因子3，其最有效的内源性激动剂是胆固醇的衍生物.大量研究表明 LXRs 可调节一系列与脂质代谢相关基因的表达，而维持脂质代谢的平衡4.ANGPTL3
14、是典型的 LXR 靶基因，在其启动子区域有 LXR 反应元件5，ANGPTL3 主要通过抑制脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)的活性导致以及低密度脂蛋白(very lowdensity lipoprotein, VLDL)三酰甘油升高为主的高脂血症.已有研究表明，高浓度葡萄糖能上调细胞内 ANGPTL3 的 mRNA 和蛋白质表达，且在一定范围内呈正相关6. 本实验发现高浓度葡萄糖能增加 L02 细胞内胆固醇含量，但当葡萄糖浓度高于 11.0 mmol/L 后，葡萄糖对细胞内胆固醇的合成影响不明显，同时高浓度葡萄糖还上调了 LXR 和ANGPTL3 的表达.Kaplan 等7研究发现高胆固醇饮食的小鼠肝脏ANGPTL3 表达明显增加， LXR 激动剂 T090137 也会提高ANGPTL3 mRNA 的水平.这与本实验结果是相符合的.结合本实验结果和文献报道，我们可以推测高糖可能通过增加细胞内胆固醇含量而激活 LXR，LXR 的激活能引起 ANGPTL3 的 mRNA 和蛋白质高表达，ANGPTL3 高表达可导致脂类代谢紊乱.因此，良好地控制血糖浓度，能够有效地维持糖和脂类的代谢平衡，LXR 和ANGPTL3 可能成为联系糖和脂类的代谢的重要分子.【
