1、 清热祛湿益气法对 Con A 诱导急性肝损伤小鼠的超微病理研究作者：刘超 黄霞，孙为，刘惠霞【摘要】 目的观察清热祛湿益气法(QSYF)对 Con A 诱导肝损伤小鼠肝组织超微结构的影响。方法 Balb/c 雄性小鼠随机分为空白对照组，模型对照组，QSYF 低、中、高剂量组，予双蒸水(空白对照组、模型对照组)或 QSYF 药剂(QSYF 不同剂量组)，连续灌胃 7 d，空白对照组注射等量无菌 PBS 溶液，其他组静脉注射 Con A 复制肝损伤模型，6 h 后立即解剖肝脏，同部位取肝组织，进行电镜观察。结果模型对照组肝细胞出现许多细小脂滴, 内质网、线粒体数目明显减少，线粒体肿胀，嵴模糊。核
2、表面发芽现象并异染色质电子密度增高。QSYF 各组均无核表面发芽等现象，且随 QSYF 药液剂量增大上述病变明显减轻。结论 QSYF 对 Con A 诱导的肝损伤具有明显的拮抗作用。 【关键词】 清热祛湿益气法; 刀豆蛋白 A; 肝损伤; 超微病理; 小鼠清热祛湿益气法是中医临床治疗肝病的有效治则，多年来治疗乙肝、甲肝等肝脏疾病疗效显著。肝病的发病机制与 T 细胞功能紊乱密切相关1，而刀豆蛋白 A(Con A)可诱导小鼠发生 T 细胞依赖性急性肝损伤2，我们进行了清热祛湿益气法对该模型动物超微病理实验研究，以探讨清热祛湿益气法的作用机理。现报道如下。1 材料1.1 试剂刀豆蛋白 A(Con A
3、 )，美国 Sigma 公司产品，批号C2010。实验时用无菌 PBS 溶液配成 2mg/ml 的溶液备用; 戊二醛，上海国云集团化学试剂有限公司生产，批号 20040420。1.2 受试药物清热祛湿益气法(简称 QSYF)中药由虎杖、连翘、板蓝根、黄芪、西洋参、山药、五味子、甘草组成，经提取浓缩为药物浸膏液，每毫升含原生药 2 g，河南省中医药研究院中药分析室提供，批号 20060506。1.3 动物与分组 Balb/c 雄性小鼠 2328 g,河南省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(豫)2005-001 。2 方法动物随机分为 5 组。空白对照组和模型对照组分别给予双蒸水 0.4ml/
4、20g，QSYF 低、中、高剂量组分别给予 QSYF 药液5，10，15 g/kg，各组连续灌胃 7 d。第 7 天动物禁食 14 h 后，除空白对照组外，各组小鼠尾静脉注射 ConA 溶液 20 mg/kg，空白对照组小鼠注射等体积无菌 PBS 溶液，于注射后 6 h 处死小鼠，立即解剖肝脏，同部位剪取肝组织，做以下处理：将肝组织在蜡板上迅速切成 0.5mm3 的肝组织小块，放入预冷的 4%戊二醛 PBS 溶液中固定，锇酸后固定，常规制作超薄切片，进行透射电子显微镜观察。3 结果3.1 QSYF 对肝细胞超微结构的影响空白对照组肝细胞形态正常，核呈卵圆形，细胞质内线粒体丰富，线粒体嵴排列整齐
5、，含有丰富的粗面内质网，粗面内质网未见脱颗粒现象，胞质内未出现异常的形态结构。见图 1(a，b) 。模型组肝细胞形态多边形，肝细胞浆内出现许多细小脂滴;线粒体肿胀，数目明显减少，线粒体嵴变短或模糊消失，嵴内腔增大呈泡状;内质网也明显减少并呈泡状结构。细胞核可见出芽状态，异染色质电子密度增高，核仁电子密度也增高。见图 1(c，d)。SYF 低、中、高剂量组与模型组比较，随剂量增大肝细胞质内脂滴减少，线粒体、内质网增多，中、高剂量组肝细胞内线粒体嵴大部分排列整齐，细胞核异染色质明显减少，而常染色质明显增多;高剂量肝细胞内质网明显增多并呈多层状排列。各剂量组均未有细胞核出芽现象。见图 1(e,f,g
6、,h,i,j)。图 1 各组小鼠肝组织超微结构病理图片比较3.2 QSYF 各组肝细胞立体计量学定量观测结果每组动物随机取两只动物肝组织，各肝组织随机切 3 张切片。每张切片随机拍 5张照片，共计 30 张/组，进行立体计量学测定肝细胞线粒体的体密度(Vv) 、比表面() 、比膜面(m)和内质网比膜面及核染质常异染色质的体密度(Vv)、核比表面测量。结果显示，模型组与空白组比较线粒体 Vv、线粒体 、线粒体 m、内质网 m、核比表面测量值均显著降低，QSYF 中、高剂量组与模型组比较上述指标均明显升高，差异均有显著性意义(P0.05)。 见表 12。表 1 各组肝细胞线粒体体密度、比表面、比膜
7、面及内质网比膜面测得结果表 2 各组肝细胞细胞核异染色质、常染色质及核比表面的测量结4 讨论我们采用 ConA 复制肝损伤小鼠模型，小鼠血清 ALT，TBIL在注射后 6 h 达到峰值，与文献报道基本一致3 。通过对实验各组肝组织超微结构的观察分析显示，模型组肝细胞的损伤主要表现有肝细胞出现细小脂滴，说明部分肝细胞出现脂代谢障碍。其机理分析为肝细胞线粒体和内质网受到严重的损伤，造成能量代谢障碍，ATP 生成减少，同时蛋白质代谢也发生障碍;主要内质网明显减少且内质网内出现泡状结构的改变。从立体计量学测得的结果可以看出，线粒体的 Vv 明显减小，说明细胞内线粒体数目减少，线粒体的 缩小说明线粒体体
8、积增大,而线粒体的比膜面明显减少，提示线粒体体积增大是水肿造成的，而线粒体嵴缩短模糊或消失，嵴间腔扩大，因此比膜面减少而功能降低，生成 ATP 障碍。研究表明，模型组肝细胞的损伤主要严重影响细胞的能量代谢和蛋白质代谢，而对核酸的代谢影响不大,从核表面出现发芽的现象并有异染色质电子密度增高所提示，Con A 性肝损伤的发生机制与肝细胞凋亡有关，与文献报道相符4，5 。QSYF 各组在核形态结构上均未发现有核出芽现象和异染色质电子密度增高的现象，提示 QSYF 对 Con A 诱导的肝细胞凋亡具有拮抗作用,并随着剂量的增加肝细胞质内脂滴逐渐减少，线粒体、内质网增多，研究结果表明 QSYF 通过增强线粒体的数目和功能、增强蛋白质的代谢，发挥保护肝细胞的作用，减轻肝损伤，其量效关系呈正相关。【
