1、1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入 510 倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的 25100 倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的 410 倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，
2、样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1 5125；对于纯化蛋白质来说应为 1201 100 。凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖 2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为 2g/L 的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。3.加样与洗脱（1）加样量：加样量与测定
3、方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用 28Onm 波长测定吸光度，对一根 2cm6Ocm 的柱来说，加样量需 5mg 左右。一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高 )，分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的 510。样品体积过大，分离效果不好。对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每 mL 总床体积可加 0.30.5mg 溶质，使用体积约为 0.O2 倍总体积；而低吸水量凝胶如 Sephadex G75，每 mL
4、 总床体积加溶质质量为 0.2mg，样品体积为 0.Ol 倍总体积。（2）加样方法：如同离子交换柱层析一样，凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数 mL 洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。（3）洗脱：加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数 mL。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。
5、洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。若无此装置，可用控制操作压的办法进行。样品体积不宜过多，最好为床体积的 15% ，最多不要超过 10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过 4%。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和 pH 值。分离血清蛋白常用 0.020.1Mol/L pH 6.98.0 的 PBS 液（0.14Mol/L NaCl）和 0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl 缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl） 。凝胶再生和保存凝胶层析的载体不会与被分离的物质发生任何作用，因此凝胶柱在层析分离后稍加平衡即可进行下一次的分离操作。但使用多次后，由于床体积变小，流动速率降低或杂质污染等原因，使分离效果受到影响。此时对凝胶柱需进行再生处理，其方法是:先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分离。对使用过的凝胶，若短时间保存，只要反复洗涤除去蛋白质等杂质，加入适量防腐剂即可；若长期保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥等处理后，装瓶保存。规格：分子量测定一般用到葡聚糖凝胶 G-25、G-50 、G-75、G-100
