1、 培养基成分对彭泽贝母愈伤组织增殖及生物碱含量的影响【摘要】 目的研究 MS 培养基中大量元素、微量元素对彭泽贝母愈伤组织生长及生物碱含量的影响,筛选有利于彭泽贝母愈伤组织生长和生物碱积累的培养基配方。方法采用正交和单因素实验设计,以生长 40 d 的彭泽贝母愈伤组织的生长率和生物碱含量为指标,评价各因素对其影响的大小。结果各因素对彭泽贝母愈伤组织生长影响大小依次为 PCaKN,对生物碱积累影响大小依次为KNCaP;培养基中 NO3-N 含量较高时,有利于生物碱的积累;微量元素缺乏时均有利于彭泽贝母愈伤组织的生长,缺Cu、缺 I 时不利于生物碱的积累。结论有利于彭泽贝母愈伤组织生长和生物碱积累
2、的最佳组合分别为:N3P1K3Ca2、 N1P2K3Ca1;培养基中大量元素、微量元素对彭泽贝母愈伤组织生长及生物碱含量存在一定影响。 【关键词】 彭泽贝母 愈伤组织 生长量 生物碱Abstract:ObjectiveTo study the effect of large elements, trace elements of MS culture medium on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus ,and to select the culture medium which is ad
3、vantageous in its growth and alkaloid accumulation.MethodsWith the growth rate and alkaloid content of the 40 days callus as indexes, single-factor and orthogonal experimental design was conducted to evaluate the impact of various factors.ResultsThe effect of various factors on the growth of the cal
4、lus is PCaKN ,and on the alkaloids was KNCaP; the alkaloid content was higher when the proportion of NO3-N was higher than NH+4-N;Lacing trace elements were all advantageous in growth of the callus,but lacing I and Cu were not helpful to the accumulation of alkaloids. ConclusionThe best combination
5、of the various factors for the growth and the accumulation of alkaloids of the callus respectively is: N3P1K3Ca2、 N1 P2 K3Ca1; large elements, trace elements of MS culture medium have effects on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus.Key words:Fritillaria monantha Migo;
6、Callus; Alkaloids ; Growth 江西彭泽贝母 Fritillaria monantha Migo 主产于江西北部的彭泽、湖口、都昌、九江、瑞昌、修水等县,已被确定为国产贝母属植物在江西的新分布,彭泽贝母作川贝母使用已有多年的历史,现代药理学研究表明,彭泽贝母的药理、药效接近甚至优于几种常用贝母。近年来,其需求量增大,人们过度采挖,导致其野生蕴藏量锐减,加上人工栽培条件严格,有性繁殖年限长,无性繁殖系数低,病虫害防治难等,不能满足人们长期用药的需求。随着近年来对植物生物化学研究的深入,利用植物细胞、组织或器官培养获得并优化药用植物次生代谢产物,以及最终利用遗传工程制取次生代
7、谢产物以满足人类对药用植物的巨大需求,已成为当前药用植物生物技术领域的研究热点。大规模药用植物组织培养技术的成功,使药用植物组织细胞培养技术在中药领域得到了更深的研究和应用。本课题组研究了不同激素组合对彭泽贝母愈伤组织诱导的影响,并对其高产细胞做了筛选1,2。本文在此基础上研究了 MS 培养基中无机成分对其生长及生物碱含量的影响,为进一步工业化生产奠定基础。1 材料与仪器1.1 材料为本实验室继代培养的疏松的彭泽贝母愈伤组织。1.2 药品贝母素甲购自中国药品生物制品检定所,批号:110750-200607;氯仿、甲醇、氨水、溴甲酚绿、邻苯二甲酸氢钾等均为分析纯。1.3 仪器 UV7501 紫外
8、/可见分光光度计(无锡科达仪器厂);SW-CJ-2F 医用净化工作台(上海博讯);PB303-N 电子天平(瑞士梅特勒);全自动高压蒸气灭菌锅(上海博讯)等。2 方法2.1 培养条件以 MS 为基本培养基,NAA 2.5 mg/L+6-BA1.0 mg/L+KT 0.5mg/L 为激素组合置于温度(201),光照强度为 1 000-1 500lx,湿度为 100%光照培养箱内培养。2.2 生长量测定接种和取材前后均称量培养基的重量,计算接种量、收获量和增长率(每个处理 3 瓶):接种量=接种后瓶重(g)-接种前瓶重(g),收获量=收获前瓶重(g)-收获后瓶重(g),生长率(% ) =收获量(g
9、)100接种量(g)。2.3 对其生长及生物碱含量的影响以 N,P,K,Ca 为 4 个因素,MS 培养基中原浓度、 1/2 浓度、1/4 浓度 3 个水平,采用正交设计 L9(34)进行实验(见表 1),培养 40 d 后取出材料,测定生长率和生物碱含量。表 1 N,P,K,Ca 含量正交设计因素水平表(略)2.4 NH4+-N 与 NO3-N 对愈伤组织生长及生物碱含量的影响培养基中的氮源改用 KNO3 和 NH4Cl,总 N 浓度不变,研究其不同比例对彭泽贝母愈伤组织生长及生物碱含量的影响,处理见表 2。表 2 铵态 N 与硝态 N 对其生长及生物碱含量的影响(略)2.5 微量元素缺乏对
10、彭泽贝母愈伤组织生长及生物碱含量的影响以 MS 培养基为对照,把彭泽贝母愈伤组织接种到分别不加Fe,Mn ,B,Mo,Zn,I,Co,Cu 的培养基上,培养 40 d 后,取出材料测定生长率和生物碱含量。2.6 生物碱的提取与含量测定生物碱的提取与含量测定参考刘红宁3、上官一平4等的方法,并在此基础上做了改进。2.6.1 试剂的配制 pH 5.0 邻苯二甲酸氢钾缓冲液:称取 4 g 邻苯二甲酸氢钾,加热溶解并定容至 100 ml,用 0.2 mol/L NaOH 溶液调至 pH 5.0。0.04%溴甲酚绿溶液配制:精密称取溴甲酚绿 80 mg,加入少量 1 mol/L NaOH 溶液溶解,定容
11、至 200 ml,置阴暗处备用。2.6.2 标准溶液的配制精密称取浙贝甲素 0.006 3 g 置于 25 ml容量瓶中,加氯仿溶解,定容,得浙贝甲素标准溶液。2.6.3 标准曲线的制备精密吸取浙贝甲素标准液 1,3,5,7,9 ml,用氯仿定容至 10 ml,分别置分液漏斗中,加水 10 ml,溴甲酚绿溶液 2 ml 和邻苯二甲酸氢钾缓冲液 2 ml,再精密加入三氯甲烷 20 ml,密塞,摇匀,静置 30 min,分取氯仿层。另取氯仿 10 ml,同法操作,所得氯仿层为空白,在 411 nm 波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程 Y=12.071X+0.
12、100 5,R2=0.998 8。见图 1。2.6.4 最大吸收波长选择取 1 ml 标准溶液萃取的氯仿层,照紫外-可见分光光度法在 200800 nm 波长范围内进行扫描,此对照品在 411 nm 波长处有最大吸收峰,故选择 411 nm 为测定波长。 2.6.5 样品处理取彭泽贝母愈伤组织于 60干燥至恒重,粉碎,过4 号筛,精密称取贝母粉末 0.5 g,用 10%氨水 2 ml 湿润 30 min,加混合溶剂(氯仿甲醇=41)20 ml 超声提取 40 min,过滤,滤液于 60C 水浴蒸干,再用氯仿溶解,置分液漏斗中,加水 10 ml,溴甲酚绿溶液 2 ml 和邻苯二甲酸氢钾缓冲液 2
13、 ml,再精密加入三氯甲烷(总 30 ml),密塞,摇匀,静置 30 min,分取氯仿层,并定容至50 ml,另取氯仿 30 ml,同法操作,所得氯仿层为对照。3 结果3.1 培养基中 N、P、K、Ca 含量对愈伤组织生长及生物碱含量的影响见表 3。从表 3 可以看出,处理 7 愈伤组织增长率最大, 为 108.42%,处理 3 最小,仅为 38.11%;而生物碱含量最高的为处理 3,含量为 0.163%,最小的为处理 4,仅为 0.04%。通过直观极差比较可知,RPRCaRKRN,RKRNRCaRP,表明各因素中对彭泽贝母愈伤组织生长的影响大小依次为PCaKN,而对生物碱积累影响大小则为KN
14、CaP,有利于彭泽贝母愈伤组织生长的最佳组合为:N3P1K3Ca2,有利于彭泽贝母愈伤组织生物碱积累的最佳组合为:N1 P2 K3Ca1。表 3 N、P、K、Ca 含量对其生长及生物碱含量的影响(略)3.2 铵态 N 与硝态 N 对愈伤组织增殖及生物碱含量的影响见表 4。从表 4 可以看出,处理 5 彭泽贝母愈伤组织的平均增长率最高为 88.92%,即 NH4+/N03-为 1/2 时,其次为处理 3 为 83.08%,即 NH4+/N03-为 2/1 时,当培养基中仅为 NH4+-N 时,增长率只有8.68%,增长率最小的为空白对照,仅为 4.67%;当 NH4+/N03-为1/2 时生物碱
15、含量最高,达到 0.164%,培养基中 NH4+/N03-为1/2、1/4、仅 N0-3-N 时,生物碱含量均高于其他处理,在空白对照中生物碱含量最低。由此表明源对彭泽贝母愈伤组织的生长分化及生物碱的积累是有一定影响的,只有当不同形态的源比例适宜时,才有利于愈伤组织的增殖和生物碱的积累。表 4 铵态 N 与硝态N 对其生长及生物碱含量的影响(略)3.3 微量元素缺乏对彭泽贝母愈伤组织增殖及生物碱含量的影响见图 23。从图中可以看出,缺乏微量元素均有利于彭泽贝母愈伤组织的增殖,其中缺 Co 时增长率达到 128.19%,生物碱含量远远高于对照;缺 Zn、缺 Fe 时生物碱含量最高,达到了 0.2
16、34%,缺I、缺 Cu 不利于生物碱的积累。4 讨论 培养基的组成是植物生长的一个决定因素,不同植物对培养基有不同的要求,并对培养基中的不同成分有不同的敏感性。本试验发现,当 MS 培养基中 NO-3-N 的比例增高时有利于彭泽贝母愈伤组织中生物碱的积累。 微量元素在植物细胞生长中起着不可替代的作用,它们大多是酶的组成成分或活化剂,缺少其中一种就会代谢受阻,但是植物对其的需要量甚微,稍多就发生毒害。本文研究发现当培养基中缺 B、缺 Zn、缺 Cu、缺 Mo、缺Co、缺 Mn、缺 Fe、缺 I 时均有利于彭泽贝母愈伤组织的生长,但是缺 Cu、缺 I 时不利于生物碱的积累,与近几年研究的植物逆境有利于中药有效成分的积累相一致5。【