1、 浅要猪链球菌 9 型钦州株的分离及其cps9H 基因序列摘要 对临床疑似猪链球菌 9 型(SS9)的病料进行实验室诊断。通过实验室检测结果证实,分离菌属于 SS9,将其命名为 QZ49;扩增其cps9H 目的基因长为 389 bp;与 GenBank 上国内外 SS9 毒株核苷酸同源性介于 97.2 %99.5 %之间。 关键词猪链球菌 9 型;cps9H 基因;分离;序列分析 近年来,猪链球菌 9 型的流行趋势逐渐上升,在我国各省(市) 均有不同程度的发生和流行1-2,SS9 已逐渐成为危害我国养猪业发展的疫病之一。本研究就钦州疑似 SS9 症状的病料进行细菌分离、PCR 扩增,并进行测序
2、分析,以期为 SS9 的分子流行病学提供数据支持。 1 材料与方法 1.1 标准毒株及主要试剂 猪链球菌 9 型标准毒株(Y142 株)由广西动物疫病预防控制中心实验室提供。dNTP、Taq 酶、蛋白酶 K、SDS 、饱和酚等购自TaKaRa 公司;LB 培养基购自 GIBCOL 公司。 1.2 引物 根SS9 荷兰 5218 株设计扩增 cps9H 基因引物:cps9H1:5-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3;cps9H2:5-CCGAAG TATCTGGGCTACTG-3,预期扩增片段长约 389bp。 1.3 细菌培养、纯培养及涂片镜检 采集某猪场疑似 SS9 型症状的病料
3、接种鲜血琼脂培养基,37 培养 12 h 后观察。挑选可疑的单个菌落接种于链球菌增菌培养基中,37 培养 20 h 收取细菌液体培养物,涂片、革兰氏染色镜检。 1.4 细菌的涂片镜检与 DNA 的抽提 取细菌纯培养物,涂片、革兰氏染色镜检。之后取液体培养物 1.5 mL 按传统 DNA 抽提方法抽提 DNA,获得的 DNA 模板用于下一步操作。 1.5cps9H 基因扩增 取抽提的 DNA 模板进行 cps9H 基因的扩增,反应体系总体积 25 L,内含模板 2.0 L,加 10Reaction Buffer 2.5 L,dNTP(2.5 mmoL/L)2.0 L,Taq DNA 酶(5 U/
4、L)0.25 L,MgCl2(25 mmoL/L)1 L,上下游引物(25 pmoL/L)各 0.5 L,加 ddH2O 补至 25 L,置 PCR 仪中,95 预变性 5 min;94 变性 45 s,56 退火 45 s,72 延伸 60 s,30 个循环;72 延伸 10 min。完毕后取 PCR 产物 5 L在 10 g/L 琼脂糖凝胶上电泳,置凝胶成像系统中观察结果。 1.6cps9H 基因序列分析 PCR 阳性产物纯化后送宝生物工程(大连)有限公司测序。应用 DNAStar 软件将测序获得的 SS9 毒株 cps9H基因序列截短并进行整理,与国内外已发表的 SS9 cps9H 基因
5、序列进行核苷酸同源性分析,建立系统发育树。 2 结果与分析 2.1细菌培养特征 该细菌在鲜血培养基上菌落呈针尖大小,圆形隆起,湿润透明,灰白色,为 -溶血;在血清肉汤中管底混浊呈沉淀状。革兰氏染色为 G+菌。初步证实该分离菌属于猪链球菌 9 型。 2.2PCR 扩增结果 扩增产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳,得到单一的约 390 bp 大小的目的片段( 图 1)。 2.3 测序结果及核苷酸同源性分析 通过测序,得到 389 bp 核苷酸序列(图 2)。用 DNAStar软化进行同源性分析,QZ49 株与荷兰 5218 株的同源性是 98.7%;与广西 Y142、南京 HA070725、湖北
6、 HB21 都为 99.5%;与河南 HN、湖北 HB22 分别为 98.2%和 99.2%;与广州 GZ0565 同源性最低,仅为97.2%。 3 结论与讨论 在猪链球菌 35 个血清型中,cps9H与其他 34 个血清型的序列同源性都很低,是国内外目前利用 PCR 技术鉴别诊断猪链球菌 9 型引物的主要基因组。SS9 是继 SS2 型之后的主要流行血清型,主要流行于澳大利亚、德国、比利时和荷兰3。近些年来,在我国各省(市)也有关于 SS9 的报道4-6,研究证实了 SS9毒株确实已在钦州市的猪群中存在。序列分析结果显示,钦州分离株与国内外其他 SS9 毒株核苷酸同源性都较高。研究结果表明,钦州市现在流行的 SS9 毒株与国内外的流行毒株基本一致,没有发生太大的变异,预示在临床上重视控制 SS2 感染的同时 ,还应该加强防控 SS9,以防在钦州市猪群中形成大规模的流行。 4
