1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B 4 7 8 9.3 9 2 0 1 3食 品 安 全 国 家 标 准食 品 微 生 物 学 检 验 粪 大 肠 菌 群 计 数2 0 1 3-1 1-2 9 发 布 2 0 1 4-0 6-0 1 实 施G B 4 7 8 9.3 9 2 0 1 3I前 言本 标 准 代 替 G B/T 4 7 8 9.3 9-2 0 0 8 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 粪 大 肠 菌 群 计 数。本 标 准 与 G B/T 4 7 8 9.3 9-2 0 0 8 相 比，主 要 修 改 如 下：修 改 了 标 准 的 中 文 名 称；修 改 了
2、操 作 步 骤；增 加 了 附 录 B。G B 4 7 8 9.3 9 2 0 1 31食 品 安 全 国 家 标 准食 品 微 生 物 学 检 验 粪 大 肠 菌 群 计 数1 范 围本 标 准 规 定 了 食 品 中 粪 大 肠 菌 群 计 数 的 方 法。本 标 准 适 用 于 各 类 食 品 中 粪 大 肠 菌 群 的 计 数。2 术 语 和 定 义2.1 粪 大 肠 菌 群一 群 在 4 4.5 培 养 2 4 h 4 8 h 能 发 酵 乳 糖、产 酸 产 气 的 需 氧 和 兼 性 厌 氧 革 兰 氏 阴 性 无 芽 胞 杆 菌。该 菌群 来 自 人 和 温 血 动 物 粪 便，
3、作 为 粪 便 污 染 指 标 评 价 食 品 的 卫 生 状 况，推 断 食 品 中 肠 道 致 病 菌 污 染 的 可 能 性。3 技 术 要 求 设 备 和 材 料除 微 生 物 实 验 室 常 规 灭 菌 及 培 养 设 备 外，其 他 设 备 和 材 料 如 下：a)恒 温 培 养 箱：3 6 1;b)冰 箱：2 5;c)恒 温 水 浴 箱：4 4.5 0.2;d)天 平：感 量 0.1 g;e)均 质 器;f)振 荡 器;g)无 菌 吸 管：1 m L（具 0.0 1 m L 刻 度）、1 0 m L（具 0.1 m L 刻 度）或 微 量 移 液 器 及 吸 头;h)无 菌 锥
4、形 瓶：容 量 5 0 0 m L;i)无 菌 培 养 皿：直 径 9 0 m m;j)p H 计 或 p H 比 色 管 或 精 密 p H 试 纸。4 培 养 基 及 试 剂4.1 月 桂 基 硫 酸 盐 胰 蛋 白 胨（L a u r y l S u l f a t e T r y p t o s e，L S T）肉 汤：见 附 录 A 中 A.1。4.2 E C 肉 汤（E.c o l i B r o t h）：见 附 录 A 中 A.2。4.3 无 菌 生 理 盐 水：见 附 录 A 中 A.3。4.4 1 m o l/L N a O H：见 附 录 A 中 A.4。4.5 1 m
5、o l/L H C l：见 附 录 A 中 A.5。5 检 验 程 序粪 大 肠 菌 群 检 验 程 序 见 图 1。G B 4 7 8 9.3 9 2 0 1 32图 1 粪 大 肠 菌 群 M P N 计 数 法 检 验 程 序6 操 作 步 骤6.1 样 品 的 稀 释6.1.1 固 体 和 半 固 体 样 品：称 取 2 5 g 样 品，置 盛 有 2 2 5 m L 磷 酸 盐 缓 冲 液 或 生 理 盐 水 的 无 菌 均 质 杯 内，8 0 0 0r/m i n 1 0 0 0 0 r/m i n 均 质 1 m i n 2 m i n，制 成 1:1 0 样 品 匀 液，或 置
6、 2 2 5 m L 稀 释 液 的 无 菌 均 质 袋 中，用 拍 打式 均 质 器 拍 打 1 m i n 2 m i n，制 成 1:1 0 的 样 品 匀 液。6.1.2 液 体 样 品：以 无 菌 吸 管 吸 取 样 品 2 5 m L 置 盛 有 2 2 5 m L 磷 酸 盐 缓 冲 液 或 生 理 盐 水 的 无 菌 锥 形 瓶（瓶内 预 置 适 当 数 量 的 无 菌 玻 璃 珠）中，充 分 混 匀，制 成 1:1 0 的 样 品 匀 液。6.1.3 样 品 匀 液 的 p H 值 应 在 6.5 7.5 之 间，必 要 时 分 别 用 1 m o l/L N a O H 或
7、 1 m o l/L H C l 调 节。6.1.4 用 1 m L 无 菌 吸 管 或 微 量 移 液 器 吸 取 1:1 0 样 品 匀 液 1 m L，沿 管 壁 缓 缓 注 入 盛 有 9 m L 磷 酸 盐 缓 冲液 或 生 理 盐 水 的 无 菌 试 管 中（注 意 吸 管 或 吸 头 尖 端 不 要 触 及 稀 释 液 面），振 摇 试 管 或 换 用 1 支 1 m L 无 菌吸 管 反 复 吹 打，使 其 混 合 均 匀，制 成 1:1 0 0 的 样 品 匀 液。6.1.5 根 据 对 样 品 污 染 状 况 的 估 计，依 次 制 成 十 倍 递 增 系 列 稀 释 样
8、品 匀 液。每 递 增 稀 释 1 次，换 用 1 支 1m L 无 菌 吸 管 或 吸 头。从 制 备 样 品 匀 液 至 样 品 接 种 完 毕，全 过 程 不 得 超 过 1 5 m i n。6.2 初 发 酵 试 验检 样2 5 g(m L)样 品+2 2 5 m L 稀 释 液，均 质1 0 倍 系 列 稀 释月 桂 基 硫 酸 盐 胰 蛋 白 胨(L S T)肉 汤3 6 1 4 8 h 2 h不 产 气 产 气E C 肉 汤4 4.5 0.2 2 4 h 2 h不 产 气 产 气粪 大 肠 菌 群 阴 性 管 粪 大 肠 菌 群 阳 性 管查 M P N 表报 告 结 果G B
9、4 7 8 9.3 9 2 0 1 33每 个 样 品，选 择 3 个 适 宜 的 连 续 稀 释 度 的 样 品 匀 液（液 体 样 品 可 以 选 择 原 液），每 个 稀 释 度 接 种 3 管 月桂 基 硫 酸 盐 胰 蛋 白 胨（L S T）肉 汤，每 管 接 种 1 m L（如 接 种 量 需 要 超 过 1 m L，则 用 双 料 L S T 肉 汤），3 6 1 培 养 2 4 h 2 h，观 察 倒 管 内 是 否 有 气 泡 产 生，2 4 h 产 气 者 进 行 复 发 酵 试 验，如 未 产 气 则 继 续 培 养 至 4 8 h 2h。记 录 在 2 4 h 和 4
10、8 h 内 产 气 的 L S T 肉 汤 管 数。未 产 气 者 为 粪 大 肠 菌 群 阴 性，产 气 者 则 进 行 复 发 酵 试 验。如 采 用 多 个 稀 释 度，最 终 确 定 最 适 的 三 个 连 续 稀 释 度 方 法 参 见 附 录 B。6.3 复 发 酵 试 验用 接 种 环 从 产 气 的 L S T 肉 汤 管 中 分 别 取 培 养 物 1 环，移 种 于 预 先 升 温 至 4 4.5 的 E C 肉 汤 管 中。将 所 有接 种 的 E C 肉 汤 管 放 入 带 盖 的 4 4.5 0.2 恒 温 水 浴 箱 内，培 养 2 4 h 2 h，水 浴 箱 的
11、水 面 应 高 于 肉 汤 培 养 基液 面，记 录 E C 肉 汤 管 的 产 气 情 况。产 气 管 为 粪 大 肠 菌 群 阳 性，不 产 气 为 粪 大 肠 菌 群 阴 性。定 期 以 已 知 为 4 4.5 产 气 阳 性 的 大 肠 杆 菌 和 4 4.5 不 产 气 的 产 气 肠 杆 菌 或 其 他 大 肠 菌 群 细 菌 作 阳 性和 阴 性 对 照。6.4 粪 大 肠 菌 群 M P N 计 数 的 报 告根 据 证 实 为 粪 大 肠 菌 群 的 阳 性 管 数，查 粪 大 肠 菌 群 最 可 能 数（M P N）检 索 表（见 附 录 C），报 告 每 g(m L)粪
12、大 肠 菌 群 的 M P N 值。G B 4 7 8 9.3 9 2 0 1 34附 录 A培 养 基 和 试 剂A.1 月 桂 基 硫 酸 盐 胰 蛋 白 胨（L a u r y l S u l f a t e T r y p t o s e，L S T）肉 汤A.1.1 成 分胰 蛋 白 胨 或 胰 酪 胨 2 0.0 g氯 化 钠 5.0 g乳 糖 5.0 g磷 酸 氢 二 钾（K 2 H P O 4）2.7 5 g磷 酸 二 氢 钾（K H 2 P O 4）2.7 5 g月 桂 基 硫 酸 钠 0.1 g蒸 馏 水 1 0 0 0.0 m LA.1.2 制 法将 A.1.1 成 分
13、溶 解 于 蒸 馏 水 中，校 正 p H 至 6.8 0.2。分 装 到 有 玻 璃 小 倒 管 的 试 管 中，每 管 1 0 m L，1 2 1 高 压 灭 菌 1 5 m i n。A.2 E C 肉 汤（E.c o l i B r o t h）A.2.1 成 分胰 蛋 白 胨 或 胰 酪 胨 2 0.0 g3 号 胆 盐 或 混 合 胆 盐 1.5 g乳 糖 5.0 g磷 酸 氢 二 钾（K 2 H P O 4）4.0 g磷 酸 二 氢 钾（K H 2 P O 4）1.5 g氯 化 钠 5.0 g蒸 馏 水 1 0 0 0.0 m LA.2.2 制 法将 A.2.1 成 分 溶 解 于
14、 蒸 馏 水 中，校 正 p H 至 6.9 0.1。分 装 到 有 玻 璃 小 倒 管 的 试 管 中，每 管 8 m L，1 2 1 高 压 灭 菌 1 5 m i n。A.3 无 菌 生 理 盐 水A.3.1 成 分氯 化 钠 8.5 g蒸 馏 水 1 0 0 0.0 m LA.3.2 制 法G B 4 7 8 9.3 9 2 0 1 35称 取 8.5 g 氯 化 钠 溶 于 1 0 0 0 m L 蒸 馏 水 中，1 2 1 高 压 灭 菌 1 5 m i n。A.4 1 m o l/L N a O HA.4.1 成 分N a O H 4 0.0 g蒸 馏 水 1 0 0 0.0 m
15、 LA.4.2 制 法称 取 4 0 g 氢 氧 化 钠 溶 于 1 0 0 0 m L 蒸 馏 水 中。A.5 1 m o l/L H C lA.5.1 成 分盐 酸 9 0.0 m L蒸 馏 水 1 0 0 0.0 m LA.5.2 制 法移 取 盐 酸 9 0 m L，用 蒸 馏 水 稀 释 至 1 0 0 0 m L。G B 4 7 8 9.3 9 2 0 1 36附 录 B确 定 最 适 的 三 个 连 续 稀 释 度 方 法在 1 0-1 1 0-5五 个 连 续 稀 释 度 中 确 定 最 适 的 三 个 连 续 稀 释 度 方 法 如 下：a）有 一 个 以 上 的 稀 释 度
16、 3 管 均 为 阳 性。选 择 三 管 都 是 阳 性 结 果 的 最 高 稀 释 度 及 其 相 连 的 两 个 更 高 稀释 度（见 表 B.1 示 例 a、b，表 中 带 下 划 线 的 数 字 对 应 的 接 种 样 品 量 为 最 终 选 取 的 最 适 稀 释 度，下同）；在 未 选 择 的 较 高 稀 释 度 中 还 有 阳 性 结 果 时，则 顺 次 下 移 到 下 一 个 更 高 三 个 连 续 稀 释 度（见表 B.1 示 例 c）；如 果 中 间 有 某 个 稀 释 度 没 有 阳 性 结 果，但 更 高 稀 释 度 有 阳 性 结 果，则 将 此 阳 性 结果 加 到
17、 前 一 稀 释 度，进 而 确 定 三 个 连 续 稀 释 度（见 表 B.1 示 例 d）；如 果 不 能 按 照 这 个 原 则 找 到 三个 合 适 的 稀 释 度，则 选 择 前 一 个 较 低 的 稀 释 度（见 表 B.1 示 例 e）;b）没 有 任 何 一 个 稀 释 度 3 管 均 为 阳 性。如 果 没 有 一 个 稀 释 度 的 3 管 均 为 阳 性，则 选 择 三 个 最 低 稀 释 度（见 表 B.1 示 例 f）；如 果 在 更 高 的 没 有 被 选 择 的 稀 释 度 还 有 阳 性 结 果，将 此 阳 性 结 果 加 到 选 择 的最 高 稀 释 度，进
18、而 确 定 三 个 连 续 稀 释 度（见 表 B.1 示 例 g）。M P N 计 算 阳 性 结 果 的 选 择 示 例 见 表 B.1。表 B.1 关 于 M P N 计 算 阳 性 结 果 的 选 择 示 例示例编号接种样品量m L选择的三个连续稀释度阳性管数M P N/g(m L)0.1 g 0.0 1 g 0.0 0 1 g 0.0 0 0 1 g 0.0 0 0 0 1 ga 3 3 1 0 0 3-1-0 4 3 0b 2 3 1 0 0 3-1-0 4 3 0c 3 2 2 1 0 2-2-1 2 8 0d 3 2 2 0 1 2-2-1 2 8 0e 3 3 3 3 2 3
19、-3-2 1 1 0 0 0 0f 0 0 1 0 0 0-0-1 3g 2 2 1 1 0 2-2-2 3 5注：下划线表示应选择的连续稀释度。G B 4 7 8 9.3 9 2 0 1 37附 录 C粪 大 肠 菌 群 最 可 能 数（M P N）表每 g(m L)检 样 中 粪 大 肠 菌 群 最 可 能 数（M P N）的 检 索 见 表 C.1。表 C.1 粪 大 肠 菌 群 最 可 能 数（M P N）检 索 表阳性管数M P N9 5%置信区间 阳性管数M P N9 5%置信区间0.1 0.0 1 0.0 0 1 下限 上限 0.1 0.0 1 0.0 0 1 下限 上限0 0 0 1 1 0 0 4 2 0 注 1：本表采用 3 个稀释度 0.1 g(m L)、0.0 1 g(m L)和 0.0 0 1 g(m L)、每个稀释度接种 3 管。注 2：表 内 所 列 检 样 量 如 改 用 l g（m L）、0.1 g(m L)和 0.0 1 g(m L)时，表 内 数 字 应 相 应 降 低 1 0 倍；如 改 用 0.0 1 g(m L)、0.0 0 1 g(m L)、0.0 0 0 1 g(m L)时，则表内数字应相应增高 1 0 倍，其余类推。
