1、 北 京唯 尚立德 生物 科技有 限公 司 www.v- 010-62963369 orderv- 植物Cas9/gRNA 质粒 构建 试剂 盒(Catalog. No. VK005-15) （双子叶植物，草铵膦抗性） 产品 组成 组成 VK005-15S VK005-15L Cas9/gRNA Vector 5T 10T Solution1 20L 20L Solution2 10L 20L Sqprimer(10 M) 50 L 50 L 保存 条件: 请将产品于-20保存，避免反复冻融 产品 说明 此试剂盒能快速方便地将 gRNA 靶点序列插入 到 Cas9/gRNA 质粒中 。构建好的
2、 Cas9/gRNA 质粒能够同 时表达植物密码子优化的 Cas9 蛋白及 gRNA ，应用 CRISPR 技术进行目标基因的敲除和编辑。 特性：1）35S启动子表达植物密码子优化的Cas9蛋白； 2）双子叶的3UTR提高Cas9蛋白表达水平； 3）拟南芥U6启动子表达gRNA，适用于双子叶植物； 4）35S启动子表达草铵膦抗性 5）多个gRNA构建到同一载体中 试 剂盒 使用前 gRNA 靶点引 物的 设 计与 合成 请按照如下格式设计引物 oligo ： Target-Sense：5-TTG-gRNAsense Target-Anti：5-AAC-gRNAanti 例 如 设计的 gRNA
3、 的 靶点位 置为CAGTTCTAAATAATGGCATGG (其 中： 识别 序列大 约 18-20bp； 灰色背景 ：PAM 序列)。按 照 gRNA 的 靶点 序列 设计下 面的 oligo， 并 进行 合成， 注 意：oligo 不能加 上 PAM 序列 。 Target-Sense：5-TTGCAGTTCTAAATAATGGCA-3（正向序列） Target-Anti：5-AACTGCCATTATTTAGAACTG-3（反向互补序列） 使 用方 法： 注意：收到试剂盒后，使用前请离心试管，避免溶液残留管壁上。 步骤 一：oligo 二聚体（oligoduplex ）的 形成 北 京唯
4、 尚立德 生物 科技有 限公 司 www.v- 010-62963369 orderv- 将合成的 oligo 分别稀 释成 10M ，按如下比例混合 Target-Sense 5L Target-Anti 5L H 2 O 15L 最终体系 25L 混匀后，按照如下程序处理： 953min 95到 25缓慢冷却， 例如 -1/20S 或者将样品管放在 95水中， 自然冷 却至室温 165min 步骤 二：oligo 二聚体插 入到 载体中 Cas9/gRNAVector 1L 步骤一的 oligo 二聚体 1L Solution 1L Solution2 1L H 2 O 6L 最终体系 1
5、0L 16反应 2 小时。 步骤 三： 转化 取步骤二的最终产物5-10L 加入到刚解冻的50 LDH5a 感受态细胞中， 轻弹混匀， 冰浴30分钟， 42热激90秒， 冰上静置2分钟， 然后加入500微升无抗LB，置 于 37 恒温摇床中，170转，复苏一小时后涂卡纳抗性（Kana+）的平板。 阳 性克 隆的鉴 定 挑3至5个白色菌落摇菌，进行测序。这个质粒为低拷贝，请注意要收集4ml 菌液 抽提质粒， 浓度太低测序结果就会不理想。 如果第一次测序得不到正确结果， 请 加送5个测序样品，进行测序。 sqprimer:GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG。测序结果例子见文档后。 质
6、 粒图 谱： 北 京唯 尚立德 生物 科技有 限公 司 www.v- 010-62963369 orderv- VK005-15 1 4831 bp KanR dpCas9-2NLS pVS1 STA T-Border(right) T-Border(left) phosphinothricin(Bar) atU6-gRNA 35S PolyA 35S promoter 2X35S pVS1-repVK005-15 质粒示意 图 测 序例 子： 反向测序，请反向互补测序结果后，再进行序列比对。 CTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTC
7、AAGAATTTGATTGAATAAA ACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAG GCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAA AAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTG gRNATargetGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTG AAAAAG
8、TGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGTTTTGATCTTGAAAGATCTTTTATCTTTAGAGTT AAGAACTCTTTCGTATTTTGGTGAGGTTTTATCCTCTTGAGTTTTGGTCATAGACCTATTCATGGCTCT GATACCAATTTTTAAGCGGGGGCTTATGCGGATTATTTCTTAAATTGATAAGGGGTTATTAGGGGGTAT AGGGTATAAATACAAGCATTCCCTTAGCGTATAGTATAAGTATAGTAGCGTACCTCTATCAAATTTCCA TCTTCTTACCTTGCACAGGGCCTGCA
9、ACCTTATCCTTCCTTGTCTTCCTCCTTCCTTCCGTCCACTTCA TCATATTTAAACCAAACCTACGGGGGAGTCAACGT 测序引物 一 对或 多个靶 点构 建到同 一个 表达质 粒方 法： 1. 分别把 gRNA 靶点 g1,g2,g3,g4 构建到 VK005-15 载体中, 分别命名： VK005-15-g1; VK005-15-g2; VK005-15-g3; VK005-15-g4; 2. 构建 VK005-15-g1g2: VK005-15-g1 用 AscI+SpeI 酶切，跑胶回收短带（atU6: 590bp ）, 插入到用 AscI+Avr
10、II 酶切的 VK005-15-g2 中。命名：VK005-15-g1g2 3. 构建 VK005-15-g3g4: VK005-15-g3 用 AscI+SpeI 酶切，跑胶回收短带（atU6: 590bp ）, 插入到用 AscI+AvrII 酶切的 VK005-15-g4 中。命名：VK005-15-g3g4 北 京唯 尚立德 生物 科技有 限公 司 www.v- 010-62963369 orderv- 4. 构建 VK005-15-g1g2g3g4: VK005-15-g1g2 用 AscI+SpeI 酶切，跑胶回收短带 （atU6: 2x590bp ）, 插 入到用 AscI+Av
11、rII 酶切 的 VK005-15-g3g4 中。 命名： VK005-15-g1g2g3g4 以此类推，将多个靶 点 串联在一起构建到同 一 个表达质粒中。用 AscI+SpeI 酶切进行克隆的验证， 检测酶切带的大小与串联的片段大小是否一致。 因为由于 为重复序列，两端测序有可能无法测通。 其他植物相关试剂盒： spCas9 CRSIPR 质粒构建 试剂 盒 系列 ： VK005-01： 适用于单 子叶植物，特别用于水稻，潮霉素抗性 VK005-02 ： 适用于单 子叶植物，特别用于水稻，草铵膦抗性 VK005-05 ： 适用于单 子叶植物，潮霉素抗性 VK005-06： 适用于单 子叶植
12、物，草铵膦抗性 VK005-07： 适用于单 子叶植物，卡那霉素抗性 VK005-09： 适用于单 子叶植物，卡那霉素抗性 VK005-11 ： 适用于单 子叶植物，GFP 筛选标 记 VK005-13： 适用于单 子叶植物，GFP 筛选标 记 VK005-14 ： 适用于双 子叶植物，潮霉素抗性 北 京唯 尚立德 生物 科技有 限公 司 www.v- 010-62963369 orderv- VK005-15： 适用于双 子叶植物，草铵膦抗性 VK005-16： 适用于双 子叶植物，卡那霉素抗性 SaCas9 CRSIPR 质粒构建 试剂 盒 系列 ： saCas9 的 PAM 序列和 识别
13、序列比常用的 spCas9 都长， 剪切 DNA 的特 异性更好， off-target 效应更小，并 且蛋白比 spCas9 小，因此应用潜力大。 VK005-101 ：saCas9 ， 适用于双子叶植物，潮霉素抗性 LB Hyg 35S atU6 gRNA dsaCas9 2X35S RB VK005-102：saCas9 ， 适用于双子叶植物，草铵膦抗性 LB Bar 35S atU6 gRNA dsaCas9 2X35S RB VK005-103：saCas9 ， 适用于单子叶植物，特别用于水稻，潮霉素抗性 LB Hyg 35S rU6 gRNA msaCas9 Ubi RB VK00
14、5-104：saCas9 ， 适用于单子叶植物，特别用于水稻，草铵膦抗性 LB Bar 35S rU6 gRNA msaCas9 Ubi RB VK005-105：saCas9 ， 适用于双子叶植物，GFP 筛选标记 LB GFP 35S atU6 gRNA dsaCas9 2X35S RB Cpf1 CRSIPR 质粒构 建试 剂盒 系 列： 北 京唯 尚立德 生物 科技有 限公 司 www.v- 010-62963369 orderv- Cpf1 是新型的CRISPR Cas9 酶，其识别的PAM 序列在5 端，PAM 序列：TTTN。 剪切DNA 产生粘性末端。Cpf1 的应用将扩大CR
15、SIRPgRNA 靶点的设计范围， 具有 独特的应用。 VK005-201：Cpf1，适用 于单子叶植物，特别用于水稻，潮霉素抗性 LB Hyg 35S rU6 gRNA mpCpf1 Ubi RB VK005-202：Cpf1，适 用于单子叶植物，特别用于水稻，草铵膦抗性 LB Bar 35S rU6 gRNA mpCpf1 Ubi RB VK005-203：Cpf1，适 用于双子叶植物，潮霉素抗性 LB Hyg 35S atU6 gRNA dpCpf1 2X35S RB VK005-204：Cpf1，适 用于双子叶植物，草铵膦抗性 LB Bar 35S atU6 gRNA dpCpf1 2X35S RB VK005-205：Cpf1，适 用于双子叶植物，卡那霉素抗性 LB KanR Nos atU6 gRNA dpCpf1 2X35S RB VK005-206：Cpf1，适 用于双子叶植物，GFP 筛选标记 LB GFP 35S atU6 gRNA dpCpf1 2X35S RB
