1、 nSMOL 前处理技术结合 Skyline 软件 加速抗体药物 LCMS分析方法开发 摘 要：本文利用 nSMOL 前处理试剂包结合 Skyline 软件，加速抗体药物 LCMS 方法开发 过程，仅在一个工作日就可以完成单个抗体药物 LCMS 方法的初步优化。实例中贝伐珠单 抗共筛选出 9 个肽段具有典型色谱峰，其中 4 条肽段与贝伐珠单抗的 Fab 区域相关，并且这 4 条 Fab 区域的肽段响应远高于其他肽段；曲妥珠单抗共有 10 个肽段具有典型色谱峰，其 中 8 条肽段与曲妥珠单抗的 Fab 区域相关。实验证明，利用 nSMOL 技术可以选择性酶解 Fab 区域，从而降低抗体药物定量肽
2、段开发的复杂性。 关键词： nSMOL 三重四极杆质谱 Skyline 贝伐珠单抗 曲妥珠单抗 方法开发 LCMS技术分析蛋白药物或者蛋白标记物，通常需要经过胰酶酶解过程，获得的酶解混 合物经过净化后再分析。复杂生物基质例如血浆、血清中目标抗体药物若采用传统酶解方式 或 Pellet 酶解方式，获得的酶解产物均为多种肽段的混合物。结合 LCMS 分析的特点，在方 法开发的过程中需要针对酶解的备选肽段进行 MRM 通道的筛选和优化， 酶解产物越复杂在 方法开发过程中所消耗的时间越长。随着技术的发展，我们发现通过纳米表面限制性和导向 性酶解抗体药物实现 Fab 区域的选择性酶解技术（nSMOL）处
3、理抗体，可以尽可能降低对 非特异性区域例如保守区域的酶解， 从而极大地减少了酶解肽段的数量， 进一步的 LCMS方 法开发过程大为简化。 与传统的基于经验筛选蛋白特征肽段的过程不同，岛津公司将其超快速液相色谱-质谱 联用平台和强大的 Skyline 定量蛋白质组学软件集成一体。 Skyline 软件为蛋白质定量的研究 工作提供了标准化的工作流程，使得方法开发工作不再过度依赖研究人员的经验，降低了肽 段筛选和 MRM 通道分析条件优化的复杂程度。 本文利用 nSMOL前处理试剂包结合 Skyline软件， 加速抗体药物 LCMS方法开发过程， 仅在一个工作日就可以完成单个抗体药物的 LCMS 方
4、法的初步优化，与传统的 ELISA 方法 需要制备特异性免疫试剂进行检测消耗的时间比，本方法极大地缩短了方法开发的过程，更 灵活快速应对抗体药物和生物类似药的临床前及临床研究等不同阶段生物分析的需求。 11. 实验部分 1.1仪器和试剂 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060联用系统。 具体配置为 LC-30AD2输液泵， DGU-20A 5 在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱，CBM-20A系统控制器，LCMS-8060 三重四极杆质谱仪，LabSolutions V er. 5.82 SP1 色谱工作站，Sky
5、line Ver.3.5.0.9319 软件，nSMOL前处理试剂盒。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱：Waters BEH Peptide C18 2.0 mm I.D. 150 mm L., 1.7 m 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液 B相-0.1%甲酸乙腈 流速：0.4 mL/min 柱温：40 进样量：10 L 洗脱方式： 梯度洗脱，B 相初始浓度为 5%，洗脱程序 0.0-3.0 min，5%；3.0-35.0 min，5%40%； 35.0-37.5 min，40%95%；37.545.0 min，95%；45.5-50.0 min, 5%。 质谱条件 分析仪器：LCMS-80
6、60 干燥气：氮气 5.0 L/min 离子化模式：ESI (+) 碰撞气：氩气 离子源接口电压：1.0 kV 源温度：300 加热气：空气 15.0 L/min DL温度：250 雾化气：氮气 3.0 L/min 加热模块温度：400 扫描模式：多反应监测 (MRM) 1.3 样品前处理过程 肽段筛选 10 g/mL 贝伐珠单抗标准品，按照 nSMOL 试剂盒样品前处理过程进行贝伐珠单抗酶 解，获得的酶解混合物直接上机分析。 10 g/mL 曲妥珠单抗标准品，按照 nSMOL 试剂盒样品前处理过程进行曲妥珠单抗酶 解，获得的酶解混合物直接上机分析。 2结果与讨论 2.1 特征肽段的筛选 将数
7、据库搜索获得的贝伐珠单抗和曲妥珠单抗 fasta 文件导入 Skyline 软件， 构建合理的 肽段和离子对设置的条件，根据设定导出贝伐珠单抗肽段的 MRM 方法，在 LabSolutions 软 件中构建贝伐珠单抗和曲妥珠单抗肽段筛选的 LC-MS/MS 方法，并且贝伐珠单抗和曲妥珠 单抗酶解产物进行上机分析，所得结果导入 Skyline 软件后，逐一查看检测出的色谱峰，对 未检出的肽段信息进行删除。所筛选出的肽段及 MRM 列表内容保存为新的 Skyline 文件。 2 3 2.2 nSMOL 前处理技术加速单抗药物特征肽段分析条件优化过程 本方法因为选择 nSMOL作为前处理方法，该方法
8、利用纳米颗粒表面固定化胰酶技术 实现抗体药物的 Fab 区域的选择性酶解，从而大大缩小了目标肽段的筛选范围。根据抗体 药物的结构特点，绝大多数抗体药物的保守区域氨基酸序列差异较小，可变区域的氨基酸 序列具有较大差异。在 LCMS定量分析目标蛋白方法开发的过程中，主要工作即是挑选出 目标蛋白的特异性肽段。所以 nSMOL 前处理方法极大地降低了酶解产物的复杂性。 表 1 贝伐珠单抗 MRM参数（Skyline 筛选肽段列表） 肽段选择 前体离子 产物离子 CE (V) 肽段归属 STAYLQMNSLR 642.30 M+2H 2+1095.55 y9 + -25.2 CH2/Fab 620.30
9、 y5 + -24.2 861.45 y7 + -23.2 748.40 y6 + -23.2 GPSVFPLAPSSK 593.85 M+2H 2+846.45 y8 + -19.2 CH2/Fab 699.40 y7 + -21.2 418.25 y4 + -29.2 FTFSLDTSK 523.25 M+2H 2+898.45 y8 + -20.4 VH/Fab 797.40 y7 + -18.4 650.35 y6 + -18.4 563.30 y5 + -20.4 VLIYFTSSLHSGVPSR 588.30 M+3H 3+939.50 y9 + -26.9 VL/CDR2 602
10、.35 y8 + -27.9 775.90 y7 + -16.9 719.35 y6 + -16.9 VVSVLTVLHQDWLNGK 603.35 M+3H 3+805.45 y14 + -17.5 CH2/Fc 712.40 y12 + -19.5 ALPAPIEK 419.75 M+2H 2+654.38 y6 + -14.3 CH2/Fc 486.29 y4 + -20.3 327.69 y6 + -12.3 DTLMISR 418.20 M+2H 2+619.35 y5 + -16.2 CH2/Fc 506.30 y4 + -16.2 DSTYSLSSTLTLSK 501.60 M+
11、3H 3+694.35 y13 + -13.7 CH2/Fc 600.35 y11 + -25.7 518.80 y10 + -19.74 FNWYVDGVEVHNAK 839.40 M+2H 2+1416.70 y12 + -37.1 CH2/Fc 1230.60 y11 + -35.1 853.45 y8 + -37.1 在本实验中筛选阶段，贝伐珠单抗共有 9 个肽段具有典型色谱峰，其中 4条肽段与贝伐 珠单抗的 Fab 区域相关，而贝伐珠单抗具有代表性的特异性肽段集中于 Fab 区域；曲妥珠单 抗共有 10 个肽段典型色谱峰，其中 7 条肽段与曲妥珠单抗的 Fab 区域相关。表 1 涉及
12、到贝 伐珠单抗中与 Fab 区域相关的特征肽段包括 STAYLQMNSLR、 GPSVFPLAPSSK、 FTFSLDTSK 、VLIYFTSSLHSGVPSR；与 Fc 区域相关的特征肽段包括 ALPAPIEK、 DTLMISR、DSTYSLSSTLTLSK、FNWYVDGVEVHNAK、VVSVLTVLHQDWLNGK，由图 1 可以看到 4条 Fab 区域的肽段响应远高于其他肽段，进一步提高了筛选的有效性。表 2 中 所涉及到曲妥珠单抗相关肽段与 Fab 区域相关的特征肽段包括 LLIYSASFLYSGVPSR、 DTYIHWVR、 GLEWV AR、 IYPTNGYTR、 YADSVK
13、 、 FTISADTSK 、 NTAYLQMNSLR 、 GPSVFPLAPSSK，与 Fc 区域相关的特征肽段包括 DTLMISR、ALPAPIEK；由图 2 可以看 到 8 条 Fab 区域的肽段绝大多数色谱图响应较好。因此利用 nSMOL前处理技术可以简化酶 解产物的肽段组成，明确方法开发的目标物，简化筛选过程，提高方法开发的速度。 S T A Y LQ MN S LR G P S VF P LAP SS K F TF S LD TS K VLIYFTSSLHSGVPSR VVSVLTVLHQDWLNGK ALPAPIEK 5 DTLMISR DSTYSLSSTLTLSK FNWYVDG
14、VEVHNAK 图 1 贝伐珠单抗肽段筛选过程获得的多肽信息 表 2曲妥珠单抗 MRM参数（Skyline 筛选肽段列表） 肽段选择 前体离子 产物离子 CE (V) 肽段归属 LLIYSASFLYSGVPSR 886.98 M+2H 2+1270.64 y12 + -33.0 VL/CDR2 359.20 y3 + -27.0 591.66 M+3H 3+765.39 y7 + -19.1 VL/CDR2 602.32 y6 + -21.1 359.20 y3 + -15.1 DTYIHWVR 363.85 M+3H 3+597.32 y4 + -18.6 VH/CDR1 460.27 y3
15、 + -14.6 487.76 y7 + -14.6 437.24 y7 + -10.6 GLEWV AR 415.73 M+2H 2+660.35 y5 + -16.1 VH/CDR2 531.30 y4 + -16.1 IYPTNGYTR 542.77 M+2H 2+808.39 y7 + 19.2 VH/CDR2 711.34 y6 + 27.2 610.29 y5 + 25.2 404.70 y7 + 17.2 YA D S V K 341.67 M+3H 2+519.28 y5 + -15.2 VH/Fab 448.24 y4 + -13.2 FTISADTSK 485.25 M+2
16、H 2+721.37 y7 + -14.9 VH/Fab 608.29 y6 + -18.9 521.26 y5 + -18.9 655.83 1024.52 y8 + -23.76 NTAYLQMNSLR M+2H 2+861.46 y7 + -25.7 VH/Fab 748.38 y6 + -23.7 GPSVFPLAPSSK 593.83 M+2H 2+846.47 y8 + -19.2 CH1/Fab 699.40 y7 + -21.2 418.23 y4 + -29.2 DTLMISR 418.22 M+2H 2+619.36 y5 + -16.2 CH2/Fc 506.27 y4
17、+ -16.2 ALPAPIEK 419.75 M+2H 2+654.38 y6 + -14.3 CH2/Fc 486.29 y4 + -20.3 327.69 y6 + -14.3 LLIY S A S F L YS GV P S R D TY IH W V R G LEW V A R IYPTNGYTR YADSVK FTISADTSK N TA Y LQ M N S LR G P S VF P LAP SSK D TLM IS R 7 ALPAPIEK 图 2 曲妥珠单抗肽段筛选过程获得的多肽信息 3. 结论 本文利用 nSMOL前处理试剂包结合 Skyline软件， 加速抗体药物 LC
18、MS方法开发过程， 仅在一个工作日就可以完成单个抗体药物的 LC-MS/MS 方法的初步优化。在本实验中筛选 阶段，贝伐珠单抗共有 9个肽段具有典型色谱峰，其中 4 条肽段与贝伐珠单抗的 Fab区域相 关，而贝伐珠单抗具有代表性的特异性肽段集中于 Fab 区域，4 条 Fab 区域的肽段响应远高 于其他肽段；曲妥珠单抗共有 10 个肽段典型色谱峰，其中 8 条肽段与贝伐珠单抗的 Fab 区 域相关，80%的肽段与抗体 Fab 区域相关。与传统的 ELISA 方法需要制备特异性免疫试剂 进行检测消耗的时间比，本方法极大地缩短了方法开发的过程，更灵活快速应对抗体药物和 生物类似药临床前及临床研究等不同阶段生物分析的需求。
