1、 克必隆系列 CAT#:140383-10 干冰运输， -80 保存 EHA105 农杆菌感受态细胞 HEA105 Agrobacterium Competent Cell 使用手册 V1.1 北京天恩泽基因科技有限公司 北京市海淀区上地信息路 26 号北京市留学人员海淀创业园中关村创业大厦 506 网址： ； 电话： 400-6765278；电邮： 产品及特点 本产品为 EHA105 农杆菌化学感受态细胞， 为 C58 型背景，核基因中含有筛选标签 利福平抗性基因 rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型 Ti 质粒 pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)，
2、此质粒含有 vir 基因 (vir 基因是 T-DNA 插入植物基因组必需的元件， pEHA105 (pTiBo542DT- DNA)质粒自身的 T-DNA 转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体 T-DNA顺利转移 )。 本产品 适用于 水稻 、烟草等植物的转基因操作，经 pCAMBIA2301质粒检测转化效率高达 103cfu/g。 规格及成分 成 分 编号 10 支 包装 EHA105 农杆菌感受态细胞 140383 10 100 L 使用手册 1 份 运输及保存 干冰 运输 ， -80 保存， 有效期 一 年 。 自备试剂 质粒 DNA、液氮 等 使用方法 转化前准备 1. 冰水浴和
3、 37 水浴 。 2. 液氮或干冰 /乙醇混合物 。 3. 将抗性平板在 28 培养箱中平衡至少 15 分钟 。 转化方法 1. 取 -80保存的农杆菌感受态 细胞 于冰 水浴中 融化。 2. 无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒， 每 100L 感受态 细胞 加 1ug（体积不大 于 10 L） 质粒 DNA，轻柔 混匀 。冰水浴中静置 5 分钟。 3. 将离心管置于液氮中速冻 5 分钟（ 注： 也可以用干冰和无水乙醇混合物替代液氮）。 4. 迅速将离心管置于 37水浴 静置 中 5 分钟，不 要 晃动水面。 然后快速转至冰水浴中静置 5 分钟。 5. 加入 800 L
4、 无抗生素的 2 YT 或 LB 液体培养基 ， 28-30振荡培养 23小时。 使菌体复苏，表达抗性。 6. 5000rpm 离 心 1 分钟收菌， 保留 100 L 左右上清，轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布到含 有 相应抗生素的 LB 固体培养基平板上， 待 平板中的液体完全吸收后，倒置平板， 28-30培养 48-72 小时。 注： 当平板只含 有 50 g/mL kan 时 ， 28 培 养 48 h 即可；平板中同时加 入 50 g/mL kan、 20 g/mL rif 时， 需 28 培 养 60 h；如果使用的平板含 有 50 g/mL rif 则需 要 28 培 养 72-90
5、h。 注意事项 1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。 2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。 4. 利福平浓度不应高于 25 g/mL，过高的利 福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 g/mL kan，若所用平板含有 20 g/mL rif 则转化效率降低到 1/2。 5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入 Ti 质粒筛选抗生素可防止 Ti 质粒丢失，但 Ti 质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素， Ti 质粒丢失的概率极低 (可以忽略 )。 关联产品 pCAMBIA2301 质粒 DNA（ CAT#:60908-1310） 20170329xhh
