1、基于表面增强拉曼技术快速检测 5 种食源性致病菌 高玮村 李博 王习文 李乾学 李楠 李志萍 夏志平 吉林农业大学动物科学技术学院 军事医学科学院军事兽医研究所 摘 要： 为快速检测布鲁氏菌 S2 株、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7 和福氏志贺氏菌, 利用表面增强拉曼 (SERS) 光谱技术, 以原位包覆纳米银为基底, 获得 5 种细菌的 SERS 谱。结果表明:在 4002 000 cm-1光谱内, 布鲁氏菌 S2 株有 10 处明显的拉曼谱峰, 鼠伤寒沙门氏菌有 9 处明显的拉曼谱峰, 金黄色葡萄球菌有 5 处明显的拉曼谱峰, 大肠杆菌 O157:H7 有 9 处明
2、显的拉曼谱峰, 福氏志贺氏菌有 7 处明显的拉曼谱峰。5 种食源性致病菌的拉曼谱峰位置以及强度区别明显。利用 SERS 技术可以实现在 10 min 内识别 5 种食源性致病菌, 达到增强细菌拉曼信号、快速检测食源性致病菌的目的。关键词： 表面增强拉曼; 食源性致病菌; 布鲁氏菌 S2 株; 鼠伤寒沙门氏菌; 金黄色葡萄球菌; 大肠杆菌 O157:H7; 福氏志贺氏菌; 作者简介：高玮村, 女, 在读硕士, 研究方向:基础兽医学。收稿日期：2016-10-26基金：国家重点研发计划项目 (2016YFD501001) Quick Detection of Five Foodborne Path
3、ogenic Bacteria Based on Surface Enhanced Raman SpectroscopyGAO Weicun LI Bo WANG Xiwen LI Qianxue LI Nan LI Zhiping XIA Zhi ping College of Animal Sciences and Technology, Jilin Agricultural University; Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control, Institute of Military Vete
4、rinary, AMMS; Abstract： Surface enhanced Raman spectroscopy ( SERS) was applied to quickly detect Brucellasuis vaccine strain 2 ( B. suis S2) , Salmonella typhimurium ( S. typhimurium) , Staphylococcus aureus ( S.aureus) , Escherichia coli O157: H7 ( E. coli O157: H7) and Shigellaflexneri ( S. flexn
5、eri) , respectively. According to the enhancement effect of SERS, the method of in Situ Coating with Ag Nanoparticles was used to enhance the bacteria Raman signal.Within the range of 400-2000 cm-1, B.suis S2 had 10 distinct Raman peaks, S. typhimurium had 9 distinct Raman peaks, S. aureus had 5 dis
6、tinct Raman peaks, E. coli O157: H7 had 9 distinct Raman peaks, and S. flexneri had 7 distinct Raman peaks. And the position and intensity of Raman spectra of the five foodborne bacteria were different. We can rapidly detect five foodborne pathogens within 10 minutes using SERS technique, which prov
7、ides a basis for clinical diagnosis, and the purpose of detecting bacteria by SERS was achieved quickly.Keyword： SERS; foodborne pathogen; B.suis S2; S. typhimurium; S. aureus; E. coli O157: H7; S. flexneri; Received： 2016-10-26布鲁氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 O157:H7 和福氏志贺氏菌是重要的食源性致病菌, 可引起人和动物多种疾病。截至目前, 常
8、规检测方法是采用细菌培养和代谢测试作为细菌鉴定的标准。但是, 其检测过程耗时长, 在紧急危重情况, 如败血症造成的多器官衰竭病人或者动物无法等待长时间检测。基于这个原因, 灵敏的核酸放大技术被应用于细菌检测中, 如聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 法1, 连接酶链式反应 (Ligase Chain Reaction, LCR) 法2和链置换扩增 (Strand Displacement Amplification, SDA) 法3以及其他一些方法。这些技术虽然能够在数小时内检测出结果, 但需要较长的前期准备以及熟练的实验室操作能力, 临床检测结果
9、假阳性率偏高。此外, 基于抗原与相应抗体特异性结合的原理来进行细菌鉴定的免疫学方法已经非常成熟, 并已使用了多年, 如酶联免疫分析 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 法4, 该方法特异性强、灵敏度高、易于观察, 但是抗体制备过程复杂, 价格昂贵, 不稳定。分子光谱, 如红外光谱5和拉曼光谱6, 可以快速获取微生物的生化指纹。但是, 由于红外光谱对水敏感, 从而限制了它在微生物领域的应用, 而拉曼光谱提供的是与红外光谱互补的微生物指纹信息, 并且不受水的影响, 可以检测含水的生物样品。然而微生物的拉曼检测信号很弱, 拉曼光谱自发现以来很长一段时
10、期, 仅用于矿物、毒品等的检测, 在微生物领域应用很少, 直到 1974 年, Fleischmann 发现了表面增强拉曼 (Surface-enhanced Raman Scattering, SERS) 7, 一种比普通拉曼信号可增强达 10 的信号增强技术, 这使得使用拉曼光谱检测微生物成为可能, 近些年 SERS 在微生物快速检测上的应用日益成熟8-9。Efrima 等10首次报道细菌的 SERS 光谱以来, SERS 技术应用于细菌检测的报道越来越多。Sengupta 等11利用纳米银胶检测了鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。吕璞等12通过纳米银胶与细菌均匀混合滴于硅基底检测了
11、大肠杆菌和志贺菌。Wang 等13利用 Ag MNPs 基片和核酸适配体特异性捕获细菌, 检测了金黄色葡萄球菌, 但仍存在免标记检测时光谱区分度低的问题。关于利用表面增强拉曼 (SERS) 光谱技术快速检测多种食源性致病菌的研究则鲜有报道。为此, 本试验以原位包覆纳米银为基底14, 利用 SERS 技术检测 5 种食源性致病菌, 以期为临床感染诊断提供基础依据。1 材料与方法1.1 材料硝酸银 (99.999%, Silver nitrate, Ag NO 3) 购自 Sigma-Aldrich 公司 (Taufkirchen, 德国) , 使用前无需再纯化。盐酸羟胺 (Hydroxylami
12、ne hydrochloride, NH4OHHCl) , 65%浓硝酸 (Nitric acid, HNO 3) , 37%浓盐酸 (Hydrochloric acid, HCl) , 0.1 mol/L 氢氧化钠 (Sodium hydroxide, Na OH) , 试验中所用的去离子水 (18.2 M/cm) 由 Milli-Q 纯水系统提供。凹面载玻片尺寸为 26 mm76 mm1 mm。1.2 仪器设备拉曼光谱仪 (LabRAM HR Evolution;HORIBA Scientific, 日本) , 透射电子显微镜 (JEM-1200EX;JEOL, 日本) , 恒温水平摇床
13、(ZWYR-240, 上海智城分析仪器制造有限公司, 中国) , 水平离心机 (LDZ5-2, 北京雷勃尔离心机有限公司, 中国) , 电子天平 (AB204-S, 瑞士梅特勒-托利多公司, 中国) 。1.3 菌株大肠杆菌 O157:H7 (CICC:21530) 、鼠伤寒沙门氏菌 (CICC:22956) 、福氏志贺氏菌 (CICC:21534) 和金黄色葡萄球菌 (CICC:21600) 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心 (China Center of Industrial Culture Collection, CICC) , 布鲁氏菌 S2 株由吉林省人畜共患病预防和控制重点实验室
14、保存。1.4 方法1.4.1 细菌培养在 BHI 培养基中分别培养振荡冷冻的大肠杆菌 O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌以及布鲁氏菌 S2 株, 200 r/min, 37培养 10 h。取 10 m L 细菌用去离子水洗涤 2 次, 5 000 r/min 洗涤 2 min。然后将 5 种细菌贮存在 4冰箱中, 备用。1.4.2 溶液配制将 17 mg Ag NO3 (0.1 mmol/L) 溶解于 10 m L 去离子水中。将 11.6 mg (0.17 mmol) NH2OHHCl 溶解于 100 m L 去离子水中, 并加入 3.3 m L Na OH (0.
15、1 mol/L) 溶液。1.4.3 原位包覆纳米银颗粒的制备分别取 1 m L 洗涤过的细菌, 离心, 弃掉上清, 向沉淀中分别加入 100L Ag NO3溶液, 振荡混匀, 孵育 5 min, 然后加入 900L NH 2OHHCl 溶液, 振荡混匀, 离心去掉上清, 1 m L 去离子水重悬, 贮存在 4冰箱中, 备用。1.4.4 玻璃载玻片的清洗进行拉曼扫描之前, 将凹槽载玻片用王水V (浓盐酸) V (浓硝酸) =31) 浸泡清洗, 去除表面杂质, 用去离子水洗涤数遍, 氮气吹干备用。1.4.5 透射电子显微镜样品准备用碳支持膜沾取制备好的纳米银包覆的金黄色葡萄球菌样品, 滤纸吸去多余
16、液体, 干燥固定后贮存在 4冰箱中, 备用。1.4.6 拉曼光谱检测检测前将拉曼光谱仪使用硅片 (Si) 在 520.7 cm 峰作为基准峰进行仪器校正。表面增强拉曼光谱采集使用 632.8 nm 的氦氖 (He-Ne) 激光作为激发光源, 其激光强度设置为最大强度 (14 m W) , 20 倍目镜, 积分时间为 2 s, 积分 2 次, 狭缝宽为 100m。检测的光谱为 4002 000 cm, 分辨率为 1 cm。SERS 样品准备:分别取 5L 待测样品滴于凹槽载玻片中央, 使用 Lab Spec 6.0软件进行光谱采集, 每个样品分别采集 5 次。数据处理使用 Origin 8.0。
17、2 结果与分析2.1 透射电子显微镜表征原位包覆纳米银的金黄色葡萄球菌透射电镜照片见图 1。由图 1 可见, 无论是单独存在或聚集成堆存在的金黄色葡萄球菌外围都紧密聚集了大量纳米银粒子, 为拉曼信号的增强以及稳定奠定了基础。图 1 原位包覆纳米银的金黄色葡萄球菌电镜照片 Fig.1.TEM of S.aureusAg Nps 下载原图A.分散的金黄色葡萄球菌;B, C.团聚的金黄色葡萄球菌2.2 5 种食源性致病菌 SERS 光谱的采集及归属分析利用 SERS 技术检测了大肠杆菌 O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌以及布鲁氏菌 S2 株, 结果见图 2。由图 2 可见
18、, 大肠杆菌O157:H7 在 682, 735, 819, 863, 1 128, 1 331, 1 372, 1 457, 1 578 cm 处有明显的拉曼振动峰;鼠伤寒沙门氏菌在 682, 735, 819, 939, 1 128, 1 331, 1 372, 1 457, 1 578 cm 处有明显的拉曼振动峰;福氏志贺氏菌在 682, 775, 890, 959, 1 223, 1 331, 1 578 cm 处有明显的拉曼谱峰;布鲁氏菌 S2 株在563, 593, 682, 735, 799, 1 056, 1 331, 1 372, 1 457, 1 578 cm 处有明显的拉
19、曼谱峰;金黄色葡萄球菌在 682, 735, 1 331, 1 457, 1 578 cm 处有明显的拉曼谱峰。对检测得到的拉曼峰进行归属分析, 其中 1 128, 1 578 cm 归属于蛋白质中酰胺和酰胺, 682 cm (鸟嘌呤) 、735 cm (胞嘧啶、尿嘧啶) 、1 331 cm (鸟嘌呤) 来自嘌呤和嘧啶的代谢产物, 563, 628, 1 331 cm 来自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸, 以及 1 457 cm 归属于脂质中 CH2的形变 (表 1) 15-18。由此可见, 这 5 种致病菌的拉曼振动峰的位置和强度有明显的区别, 实现了利用 SERS 技术对大肠杆菌 O157:H7
20、、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、布鲁氏菌S2 株以及金黄色葡萄球菌的快速鉴别。图 2 SERS 检测 5 种致病菌 Fig.2.SERS detection of five pathogenic bacteria 下载原图a.大肠杆菌 O157:H7;b.布鲁氏菌 S2 株;c.鼠伤寒沙门氏菌;d.金黄色葡萄球菌;e.福氏志贺氏菌2.3 5 种食源性致病菌 SERS 光谱重复性检测将制备好的纳米银包覆的致病菌样品滴在玻片上, 采用拉曼光谱随机扫描 5 次, 由图 3 可见, 获得了稳定的大肠杆菌 O157:H7 (图 3-A) 、金黄色葡萄球菌 (图 3-B) 、布鲁氏菌 S2 株 (图 3-
21、C) 、鼠伤寒沙门氏菌 (图 3-D) 以及福氏志贺氏菌 (图 3-E) 的 SERS 光谱图。结果表明, 在相对稳定的环境中, 大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌以及布鲁氏菌 S2株通过以原位包覆纳米银为基底的 SERS 增强方法稳定性高, 且重复性较好。2.4 纳米银包覆的致病菌样品稳定性检测结果将纳米银包覆的大肠杆菌 O157:H7 放置 0, 24, 48 h 及 14 d 后, 利用拉曼光谱仪扫描得到其拉曼光谱。由图 4 可见, 样品在放置不同时间后拉曼谱峰比较稳定, 该结果可为以后样品检测的时效性问题提供数据支持。表 1 5 种致病菌拉曼光谱峰位归
22、属 Table 1.Peak location of Raman spectra of the five pathogenic bacteria 下载原表 图 3 5 种致病菌 SERS 光谱重复性检测 Fig.3.Repeatability test of the five pathogenic bacteria by SERS spectrum 下载原图A.大肠杆菌 O157:H7;B.金黄色葡萄球菌;C.布鲁氏菌 S2 株;D.鼠伤寒沙门氏菌;E.福氏志贺氏菌图 4 纳米银包覆的致病菌样品稳定性检测 Fig.4.Stability test of nano silver encapsul
23、ated pathogenic bacteria 下载原图3 讨论本研究以原位包覆纳米银为基底, 利用 SERS 技术在 10 min 内检测到了大肠杆菌 O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌以及布鲁氏菌S2 株 5 种食源性致病菌。试验证明, 该方法稳定性强, 耗时短 (仅需 10 min) , 为其他致病菌检测提供了依据。同时, 本研究在国内首次得到了福氏志贺氏菌和布鲁氏菌 S2 株的 SERS 光谱。通过结果分析, 发现金黄色葡萄球菌、布鲁氏菌 S2 株以及福氏志贺氏菌的 SERS 光谱差别明显, 可以直观判别。而大肠杆菌O157:H7 和鼠伤寒沙门氏菌谱峰位置虽
24、然非常接近, 但是鼠伤寒沙门氏菌在 819, 1 128 cm 处峰强度明显高于大肠杆菌 O157:H7, 这可以作为判别二者的依据。由此可以做到在短时间内通过 SERS 光谱直接快速检测致病菌。本研究在试验过程发现革兰氏阴性菌 (大肠杆菌 O157:H7、布鲁氏菌 S2 株、鼠伤寒沙门氏菌以及福氏志贺氏菌) 的 682/735 的比值明显高于革兰氏阳性菌 (金黄色葡萄球菌) , 推测是否可以以此来作为革兰氏阴性菌和阳性菌的判别标准, 这将在以后的研究中继续探讨。参考文献1Cheng J C, Huang C L, Lin C C, et al.Rapid detection and iden
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