1、病原生物学专业毕业论文 精品论文 弓形虫三磷酸核苷水解酶重组蛋白和单抗的制备与应用关键词：弓形虫 三磷酸核苷水解酶 真核表达质粒 免疫诊断 单克隆抗体 免疫保护摘要：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全球分布的机会致病性原虫，可在人和动物的所有有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病，孕妇及免疫缺陷人群感染后可引起严重的后果。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原，N
2、TPase 蛋白有 NTPase-和NTPase-两种亚型，其中 NTPase-仅存在于有毒株，而 NTPase-存在于所有弓形虫株体内12，因此 NTPase-可用于检测候选抗原和候选的保护性抗原。本研究将对弓形虫 NTPase-基因进行原核表达，探讨 NTPase-原核表达蛋白在弓形虫病早期诊断的应用，并制备其单克隆抗体，研究单抗对弓形虫的抑制作用。此外，并构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的研制奠定基础。 目的： 1.诱导表达弓形虫融合蛋白 NTPase-，建立检测小鼠血清中刚地弓形虫 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体的间接 ELISA法，探讨用于弓形
3、虫感染早期检测的应用价值。 2.制备、鉴定抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体，通过体外、体内实验探讨单克隆抗体对弓形虫的抑制作用。 3.构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定基础。 方法： 1.NTPase-基因的原核表达 用含重组表达质粒 NTPase-pBAD-HisB 的 E.coli BL21(DE3)在一定条件下在诱导剂 L-阿拉伯糖的作用下进行诱导表达。 2.重组 NTPase-融合蛋白的纯化及鉴定 使用 Ni 离子亲和层析柱纯化重组质粒 pBAD-HisB-NTPase 表达产生的含组氨酸的重组融合蛋白，SDS-PAGE 鉴定其纯度。对纯化
4、蛋白进行透析复性后，紫外分光光度计测定其浓度。 3.间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠 NTPase-抗体 以刚地弓形虫 NTPase-融合蛋白为包被抗原建立间接 ELISA 法，动态检测刚地弓形虫实验感染鼠血清 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体变化，试验设脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清对照。 4.单克隆抗体的制备及应用 用融合蛋白 NTPase-作为抗原，免疫 BALB/c 小鼠，共免疫 3 次，每次间隔 2 周，末次免疫后 3d 取小鼠脾细胞及 Sp2/0 骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合，有限稀释法筛选出高滴度分泌 McAb 的杂交瘤细胞株，蛋白质
5、印迹(Western blotting)及 ELISA 分析其特异性，试剂盒测定其免疫球蛋白亚类，初步探讨其在弓形虫诊断及治疗中的应用。 5.NTPase-基因真核表达载体的构建 采用 PCR 方法扩增刚地弓形虫 RH 株的 NTPase-基因，克隆入 pGEM-T easy 载体，阳性克隆经酶切与测序鉴定后亚克隆至真核表达质粒 PVAX1。 结果： 1.SDS-PAGE 结果表明 NTPase-基因在 E.coli BL21(DE3)中获得高效表达，表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70000，与理论值相近。经 Nj2+-NTA 树脂纯化后纯度约为 84。 2.小鼠血
6、清中的抗 NTPase-抗体 IgM 于弓形虫感染后第 3d 开始出现阳性反应，IgG 抗体于感染后第 7d 开始出现阳性反应，脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清特异性 IgG 阳性率分别为 0、1.92和 0。 3.经筛选获得能稳定分泌抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体 2 株和杂交瘤细胞 2 株，分别命名为为 MNT1和 MNT2； Western blotting 显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫重组融合蛋白NTPase-发生特异性结合，ELISA 结果显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫速殖子全虫蛋白及弓形虫重组融合蛋白 NTPase-发生特异性结合；2 株单克隆抗体经免疫球
7、蛋白类和亚类鉴定均为 IgG2a；免疫保护实验表明 2 株单克隆抗体无法阻止弓形虫入侵宿主细胞，但却可抑制弓形虫在宿主细胞内增殖；动物保护实验证实 2 株单抗都有一定的保护作用；免疫荧光定位结果显示 2 株单克隆抗体与弓形虫的结合部位主要是在弓形虫膜表面。 4.PCR 扩增得到特异的刚地弓形虫 NTPase-基因序列，成功构建了真核表达载体 PVAX1-NTPase，经测序鉴定亚克隆的 NTPase-基因序列与 Genebank 公布的序列同源性为 100。 结论： 1.本实验成功表达了弓形虫 NTPase-融合蛋白，间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠血清抗体的敏感性和特异性较高，有望应用于弓
8、形虫感染的早期检测。 2.制备的抗弓形虫融合蛋白 NTPase-杂交瘤细胞株能分泌识别融合蛋白 NTPase-的高特异性单克隆抗体，对单克隆抗体的初步应用显示其对弓形虫在宿主细胞内的繁殖具有一定的抑制作用，采用该单抗进行被动免疫具有一定保护效果。 3.成功构建了真核表达质粒 PVAX1-NTPase-，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定正文内容刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全球分布的机会致病性原虫，可在人和动物的所有有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病，孕妇及免疫缺陷人群感染后可引起严重的后果。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydro
9、lase，NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原，NTPase 蛋白有 NTPase-和NTPase-两种亚型，其中 NTPase-仅存在于有毒株，而 NTPase-存在于所有弓形虫株体内12，因此 NTPase-可用于检测候选抗原和候选的保护性抗原。本研究将对弓形虫 NTPase-基因进行原核表达，探讨 NTPase-原核表达蛋白在弓形虫病早期诊断的应用，并制备其单克隆抗体，研究单抗对弓形虫的抑制作用。此外，并构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的研
10、制奠定基础。 目的： 1.诱导表达弓形虫融合蛋白 NTPase-，建立检测小鼠血清中刚地弓形虫 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体的间接 ELISA法，探讨用于弓形虫感染早期检测的应用价值。 2.制备、鉴定抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体，通过体外、体内实验探讨单克隆抗体对弓形虫的抑制作用。 3.构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定基础。 方法： 1.NTPase-基因的原核表达 用含重组表达质粒 NTPase-pBAD-HisB 的 E.coli BL21(DE3)在一定条件下在诱导剂 L-阿拉伯糖的作用下进行诱导表达。 2.重组 NTPa
11、se-融合蛋白的纯化及鉴定 使用 Ni 离子亲和层析柱纯化重组质粒 pBAD-HisB-NTPase 表达产生的含组氨酸的重组融合蛋白，SDS-PAGE 鉴定其纯度。对纯化蛋白进行透析复性后，紫外分光光度计测定其浓度。 3.间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠 NTPase-抗体 以刚地弓形虫 NTPase-融合蛋白为包被抗原建立间接 ELISA 法，动态检测刚地弓形虫实验感染鼠血清 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体变化，试验设脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清对照。 4.单克隆抗体的制备及应用 用融合蛋白 NTPase-作为抗原，免疫 BALB/c 小鼠，共免疫 3 次，每次间隔
12、2 周，末次免疫后 3d 取小鼠脾细胞及 Sp2/0 骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合，有限稀释法筛选出高滴度分泌 McAb 的杂交瘤细胞株，蛋白质印迹(Western blotting)及 ELISA 分析其特异性，试剂盒测定其免疫球蛋白亚类，初步探讨其在弓形虫诊断及治疗中的应用。 5.NTPase-基因真核表达载体的构建 采用 PCR 方法扩增刚地弓形虫 RH 株的 NTPase-基因，克隆入 pGEM-T easy 载体，阳性克隆经酶切与测序鉴定后亚克隆至真核表达质粒 PVAX1。 结果： 1.SDS-PAGE 结果表明 NTPase-基因在 E.coli BL2
13、1(DE3)中获得高效表达，表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70000，与理论值相近。经 Nj2+-NTA 树脂纯化后纯度约为 84。 2.小鼠血清中的抗 NTPase-抗体 IgM 于弓形虫感染后第 3d 开始出现阳性反应，IgG 抗体于感染后第 7d 开始出现阳性反应，脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清特异性 IgG 阳性率分别为 0、1.92和 0。 3.经筛选获得能稳定分泌抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体 2 株和杂交瘤细胞 2 株，分别命名为为 MNT1和 MNT2； Western blotting 显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫重组融合蛋
14、白NTPase-发生特异性结合，ELISA 结果显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫速殖子全虫蛋白及弓形虫重组融合蛋白 NTPase-发生特异性结合；2 株单克隆抗体经免疫球蛋白类和亚类鉴定均为 IgG2a；免疫保护实验表明 2 株单克隆抗体无法阻止弓形虫入侵宿主细胞，但却可抑制弓形虫在宿主细胞内增殖；动物保护实验证实 2 株单抗都有一定的保护作用；免疫荧光定位结果显示 2 株单克隆抗体与弓形虫的结合部位主要是在弓形虫膜表面。 4.PCR 扩增得到特异的刚地弓形虫 NTPase-基因序列，成功构建了真核表达载体 PVAX1-NTPase，经测序鉴定亚克隆的 NTPase-基因序列与 Geneba
15、nk 公布的序列同源性为 100。 结论： 1.本实验成功表达了弓形虫 NTPase-融合蛋白，间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠血清抗体的敏感性和特异性较高，有望应用于弓形虫感染的早期检测。 2.制备的抗弓形虫融合蛋白 NTPase-杂交瘤细胞株能分泌识别融合蛋白 NTPase-的高特异性单克隆抗体，对单克隆抗体的初步应用显示其对弓形虫在宿主细胞内的繁殖具有一定的抑制作用，采用该单抗进行被动免疫具有一定保护效果。 3.成功构建了真核表达质粒 PVAX1-NTPase-，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全球分布的机会致病性原虫，可在人和动物的所有
16、有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病，孕妇及免疫缺陷人群感染后可引起严重的后果。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原，NTPase 蛋白有 NTPase-和NTPase-两种亚型，其中 NTPase-仅存在于有毒株，而 NTPase-存在于所有弓形虫株体内12，因此 NTPase-可用于检测候选抗原和候选的保护性抗原。本研究将对弓形虫 NTPase-基因进行原核表达，探讨 NTPa
17、se-原核表达蛋白在弓形虫病早期诊断的应用，并制备其单克隆抗体，研究单抗对弓形虫的抑制作用。此外，并构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的研制奠定基础。 目的： 1.诱导表达弓形虫融合蛋白 NTPase-，建立检测小鼠血清中刚地弓形虫 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体的间接 ELISA法，探讨用于弓形虫感染早期检测的应用价值。 2.制备、鉴定抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体，通过体外、体内实验探讨单克隆抗体对弓形虫的抑制作用。 3.构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定基础。 方法： 1.NTPase-基因的原核表达
18、用含重组表达质粒 NTPase-pBAD-HisB 的 E.coli BL21(DE3)在一定条件下在诱导剂 L-阿拉伯糖的作用下进行诱导表达。 2.重组 NTPase-融合蛋白的纯化及鉴定 使用 Ni 离子亲和层析柱纯化重组质粒 pBAD-HisB-NTPase 表达产生的含组氨酸的重组融合蛋白，SDS-PAGE 鉴定其纯度。对纯化蛋白进行透析复性后，紫外分光光度计测定其浓度。 3.间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠 NTPase-抗体 以刚地弓形虫 NTPase-融合蛋白为包被抗原建立间接 ELISA 法，动态检测刚地弓形虫实验感染鼠血清 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体变化，试
19、验设脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清对照。 4.单克隆抗体的制备及应用 用融合蛋白 NTPase-作为抗原，免疫 BALB/c 小鼠，共免疫 3 次，每次间隔 2 周，末次免疫后 3d 取小鼠脾细胞及 Sp2/0 骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合，有限稀释法筛选出高滴度分泌 McAb 的杂交瘤细胞株，蛋白质印迹(Western blotting)及 ELISA 分析其特异性，试剂盒测定其免疫球蛋白亚类，初步探讨其在弓形虫诊断及治疗中的应用。 5.NTPase-基因真核表达载体的构建 采用 PCR 方法扩增刚地弓形虫 RH 株的 NTPase-基因，克隆入 pGEM-
20、T easy 载体，阳性克隆经酶切与测序鉴定后亚克隆至真核表达质粒 PVAX1。 结果： 1.SDS-PAGE 结果表明 NTPase-基因在 E.coli BL21(DE3)中获得高效表达，表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70000，与理论值相近。经 Nj2+-NTA 树脂纯化后纯度约为 84。 2.小鼠血清中的抗 NTPase-抗体 IgM 于弓形虫感染后第 3d 开始出现阳性反应，IgG 抗体于感染后第 7d 开始出现阳性反应，脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清特异性 IgG 阳性率分别为 0、1.92和 0。 3.经筛选获得能稳定分泌抗弓形虫融合蛋白 NTP
21、ase-单克隆抗体 2 株和杂交瘤细胞 2 株，分别命名为为 MNT1和 MNT2； Western blotting 显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫重组融合蛋白NTPase-发生特异性结合，ELISA 结果显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫速殖子全虫蛋白及弓形虫重组融合蛋白 NTPase-发生特异性结合；2 株单克隆抗体经免疫球蛋白类和亚类鉴定均为 IgG2a；免疫保护实验表明 2 株单克隆抗体无法阻止弓形虫入侵宿主细胞，但却可抑制弓形虫在宿主细胞内增殖；动物保护实验证实 2 株单抗都有一定的保护作用；免疫荧光定位结果显示 2 株单克隆抗体与弓形虫的结合部位主要是在弓形虫膜表面。 4.P
22、CR 扩增得到特异的刚地弓形虫 NTPase-基因序列，成功构建了真核表达载体 PVAX1-NTPase，经测序鉴定亚克隆的 NTPase-基因序列与 Genebank 公布的序列同源性为 100。 结论： 1.本实验成功表达了弓形虫 NTPase-融合蛋白，间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠血清抗体的敏感性和特异性较高，有望应用于弓形虫感染的早期检测。 2.制备的抗弓形虫融合蛋白 NTPase-杂交瘤细胞株能分泌识别融合蛋白 NTPase-的高特异性单克隆抗体，对单克隆抗体的初步应用显示其对弓形虫在宿主细胞内的繁殖具有一定的抑制作用，采用该单抗进行被动免疫具有一定保护效果。 3.成功构建了真
23、核表达质粒 PVAX1-NTPase-，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全球分布的机会致病性原虫，可在人和动物的所有有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病，孕妇及免疫缺陷人群感染后可引起严重的后果。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原，NTPase 蛋白有 NTPase-和NTPase-两种亚型，其中 NTPase-仅存在于有毒株，而
24、NTPase-存在于所有弓形虫株体内12，因此 NTPase-可用于检测候选抗原和候选的保护性抗原。本研究将对弓形虫 NTPase-基因进行原核表达，探讨 NTPase-原核表达蛋白在弓形虫病早期诊断的应用，并制备其单克隆抗体，研究单抗对弓形虫的抑制作用。此外，并构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的研制奠定基础。 目的： 1.诱导表达弓形虫融合蛋白 NTPase-，建立检测小鼠血清中刚地弓形虫 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体的间接 ELISA法，探讨用于弓形虫感染早期检测的应用价值。 2.制备、鉴定抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体，通过体外、体内
25、实验探讨单克隆抗体对弓形虫的抑制作用。 3.构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定基础。 方法： 1.NTPase-基因的原核表达 用含重组表达质粒 NTPase-pBAD-HisB 的 E.coli BL21(DE3)在一定条件下在诱导剂 L-阿拉伯糖的作用下进行诱导表达。 2.重组 NTPase-融合蛋白的纯化及鉴定 使用 Ni 离子亲和层析柱纯化重组质粒 pBAD-HisB-NTPase 表达产生的含组氨酸的重组融合蛋白，SDS-PAGE 鉴定其纯度。对纯化蛋白进行透析复性后，紫外分光光度计测定其浓度。 3.间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠 NTPase
26、-抗体 以刚地弓形虫 NTPase-融合蛋白为包被抗原建立间接 ELISA 法，动态检测刚地弓形虫实验感染鼠血清 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体变化，试验设脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清对照。 4.单克隆抗体的制备及应用 用融合蛋白 NTPase-作为抗原，免疫 BALB/c 小鼠，共免疫 3 次，每次间隔 2 周，末次免疫后 3d 取小鼠脾细胞及 Sp2/0 骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合，有限稀释法筛选出高滴度分泌 McAb 的杂交瘤细胞株，蛋白质印迹(Western blotting)及 ELISA 分析其特异性，试剂盒测定其免疫球蛋白亚类，初
27、步探讨其在弓形虫诊断及治疗中的应用。 5.NTPase-基因真核表达载体的构建 采用 PCR 方法扩增刚地弓形虫 RH 株的 NTPase-基因，克隆入 pGEM-T easy 载体，阳性克隆经酶切与测序鉴定后亚克隆至真核表达质粒 PVAX1。 结果： 1.SDS-PAGE 结果表明 NTPase-基因在 E.coli BL21(DE3)中获得高效表达，表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70000，与理论值相近。经 Nj2+-NTA 树脂纯化后纯度约为 84。 2.小鼠血清中的抗 NTPase-抗体 IgM 于弓形虫感染后第 3d 开始出现阳性反应，IgG 抗体于感染后
28、第 7d 开始出现阳性反应，脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清特异性 IgG 阳性率分别为 0、1.92和 0。 3.经筛选获得能稳定分泌抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体 2 株和杂交瘤细胞 2 株，分别命名为为 MNT1和 MNT2； Western blotting 显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫重组融合蛋白NTPase-发生特异性结合，ELISA 结果显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫速殖子全虫蛋白及弓形虫重组融合蛋白 NTPase-发生特异性结合；2 株单克隆抗体经免疫球蛋白类和亚类鉴定均为 IgG2a；免疫保护实验表明 2 株单克隆抗体无法阻止弓形虫入侵宿主细胞，但却
29、可抑制弓形虫在宿主细胞内增殖；动物保护实验证实 2 株单抗都有一定的保护作用；免疫荧光定位结果显示 2 株单克隆抗体与弓形虫的结合部位主要是在弓形虫膜表面。 4.PCR 扩增得到特异的刚地弓形虫 NTPase-基因序列，成功构建了真核表达载体 PVAX1-NTPase，经测序鉴定亚克隆的 NTPase-基因序列与 Genebank 公布的序列同源性为 100。 结论： 1.本实验成功表达了弓形虫 NTPase-融合蛋白，间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠血清抗体的敏感性和特异性较高，有望应用于弓形虫感染的早期检测。 2.制备的抗弓形虫融合蛋白 NTPase-杂交瘤细胞株能分泌识别融合蛋白 NT
30、Pase-的高特异性单克隆抗体，对单克隆抗体的初步应用显示其对弓形虫在宿主细胞内的繁殖具有一定的抑制作用，采用该单抗进行被动免疫具有一定保护效果。 3.成功构建了真核表达质粒 PVAX1-NTPase-，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全球分布的机会致病性原虫，可在人和动物的所有有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病，孕妇及免疫缺陷人群感染后可引起严重的后果。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重
31、要的作用，是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原，NTPase 蛋白有 NTPase-和NTPase-两种亚型，其中 NTPase-仅存在于有毒株，而 NTPase-存在于所有弓形虫株体内12，因此 NTPase-可用于检测候选抗原和候选的保护性抗原。本研究将对弓形虫 NTPase-基因进行原核表达，探讨 NTPase-原核表达蛋白在弓形虫病早期诊断的应用，并制备其单克隆抗体，研究单抗对弓形虫的抑制作用。此外，并构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的研制奠定基础。 目的： 1.诱导表达弓形虫融合蛋白 NTPase-，建立检测小鼠血清中刚地弓形虫 NTPase
32、-特异性 IgG、IgM 抗体的间接 ELISA法，探讨用于弓形虫感染早期检测的应用价值。 2.制备、鉴定抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体，通过体外、体内实验探讨单克隆抗体对弓形虫的抑制作用。 3.构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定基础。 方法： 1.NTPase-基因的原核表达 用含重组表达质粒 NTPase-pBAD-HisB 的 E.coli BL21(DE3)在一定条件下在诱导剂 L-阿拉伯糖的作用下进行诱导表达。 2.重组 NTPase-融合蛋白的纯化及鉴定 使用 Ni 离子亲和层析柱纯化重组质粒 pBAD-HisB-NTPase 表达产
33、生的含组氨酸的重组融合蛋白，SDS-PAGE 鉴定其纯度。对纯化蛋白进行透析复性后，紫外分光光度计测定其浓度。 3.间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠 NTPase-抗体 以刚地弓形虫 NTPase-融合蛋白为包被抗原建立间接 ELISA 法，动态检测刚地弓形虫实验感染鼠血清 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体变化，试验设脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清对照。 4.单克隆抗体的制备及应用 用融合蛋白 NTPase-作为抗原，免疫 BALB/c 小鼠，共免疫 3 次，每次间隔 2 周，末次免疫后 3d 取小鼠脾细胞及 Sp2/0 骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融
34、合，有限稀释法筛选出高滴度分泌 McAb 的杂交瘤细胞株，蛋白质印迹(Western blotting)及 ELISA 分析其特异性，试剂盒测定其免疫球蛋白亚类，初步探讨其在弓形虫诊断及治疗中的应用。 5.NTPase-基因真核表达载体的构建 采用 PCR 方法扩增刚地弓形虫 RH 株的 NTPase-基因，克隆入 pGEM-T easy 载体，阳性克隆经酶切与测序鉴定后亚克隆至真核表达质粒 PVAX1。 结果： 1.SDS-PAGE 结果表明 NTPase-基因在 E.coli BL21(DE3)中获得高效表达，表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70000，与理论值相
35、近。经 Nj2+-NTA 树脂纯化后纯度约为 84。 2.小鼠血清中的抗 NTPase-抗体 IgM 于弓形虫感染后第 3d 开始出现阳性反应，IgG 抗体于感染后第 7d 开始出现阳性反应，脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清特异性 IgG 阳性率分别为 0、1.92和 0。 3.经筛选获得能稳定分泌抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体 2 株和杂交瘤细胞 2 株，分别命名为为 MNT1和 MNT2； Western blotting 显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫重组融合蛋白NTPase-发生特异性结合，ELISA 结果显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫速殖子全虫蛋白及弓形虫重组
36、融合蛋白 NTPase-发生特异性结合；2 株单克隆抗体经免疫球蛋白类和亚类鉴定均为 IgG2a；免疫保护实验表明 2 株单克隆抗体无法阻止弓形虫入侵宿主细胞，但却可抑制弓形虫在宿主细胞内增殖；动物保护实验证实 2 株单抗都有一定的保护作用；免疫荧光定位结果显示 2 株单克隆抗体与弓形虫的结合部位主要是在弓形虫膜表面。 4.PCR 扩增得到特异的刚地弓形虫 NTPase-基因序列，成功构建了真核表达载体 PVAX1-NTPase，经测序鉴定亚克隆的 NTPase-基因序列与 Genebank 公布的序列同源性为 100。 结论： 1.本实验成功表达了弓形虫 NTPase-融合蛋白，间接 ELI
37、SA 检测弓形虫感染鼠血清抗体的敏感性和特异性较高，有望应用于弓形虫感染的早期检测。 2.制备的抗弓形虫融合蛋白 NTPase-杂交瘤细胞株能分泌识别融合蛋白 NTPase-的高特异性单克隆抗体，对单克隆抗体的初步应用显示其对弓形虫在宿主细胞内的繁殖具有一定的抑制作用，采用该单抗进行被动免疫具有一定保护效果。 3.成功构建了真核表达质粒 PVAX1-NTPase-，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全球分布的机会致病性原虫，可在人和动物的所有有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病，孕妇及免疫缺陷人群感染后可引起严重的后果。三磷酸核苷水解酶(n
38、ucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原，NTPase 蛋白有 NTPase-和NTPase-两种亚型，其中 NTPase-仅存在于有毒株，而 NTPase-存在于所有弓形虫株体内12，因此 NTPase-可用于检测候选抗原和候选的保护性抗原。本研究将对弓形虫 NTPase-基因进行原核表达，探讨 NTPase-原核表达蛋白在弓形虫病早期诊断的应用，并制备其单克隆抗体，研究单抗对弓形虫的抑制作用。此外，并构建弓形
39、虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的研制奠定基础。 目的： 1.诱导表达弓形虫融合蛋白 NTPase-，建立检测小鼠血清中刚地弓形虫 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体的间接 ELISA法，探讨用于弓形虫感染早期检测的应用价值。 2.制备、鉴定抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体，通过体外、体内实验探讨单克隆抗体对弓形虫的抑制作用。 3.构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定基础。 方法： 1.NTPase-基因的原核表达 用含重组表达质粒 NTPase-pBAD-HisB 的 E.coli BL21(DE3)在一定条件下在诱导剂
40、 L-阿拉伯糖的作用下进行诱导表达。 2.重组 NTPase-融合蛋白的纯化及鉴定 使用 Ni 离子亲和层析柱纯化重组质粒 pBAD-HisB-NTPase 表达产生的含组氨酸的重组融合蛋白，SDS-PAGE 鉴定其纯度。对纯化蛋白进行透析复性后，紫外分光光度计测定其浓度。 3.间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠 NTPase-抗体 以刚地弓形虫 NTPase-融合蛋白为包被抗原建立间接 ELISA 法，动态检测刚地弓形虫实验感染鼠血清 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体变化，试验设脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清对照。 4.单克隆抗体的制备及应用 用融合蛋白 NTPase-作为抗
41、原，免疫 BALB/c 小鼠，共免疫 3 次，每次间隔 2 周，末次免疫后 3d 取小鼠脾细胞及 Sp2/0 骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合，有限稀释法筛选出高滴度分泌 McAb 的杂交瘤细胞株，蛋白质印迹(Western blotting)及 ELISA 分析其特异性，试剂盒测定其免疫球蛋白亚类，初步探讨其在弓形虫诊断及治疗中的应用。 5.NTPase-基因真核表达载体的构建 采用 PCR 方法扩增刚地弓形虫 RH 株的 NTPase-基因，克隆入 pGEM-T easy 载体，阳性克隆经酶切与测序鉴定后亚克隆至真核表达质粒 PVAX1。 结果： 1.SDS-PAG
42、E 结果表明 NTPase-基因在 E.coli BL21(DE3)中获得高效表达，表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70000，与理论值相近。经 Nj2+-NTA 树脂纯化后纯度约为 84。 2.小鼠血清中的抗 NTPase-抗体 IgM 于弓形虫感染后第 3d 开始出现阳性反应，IgG 抗体于感染后第 7d 开始出现阳性反应，脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清特异性 IgG 阳性率分别为 0、1.92和 0。 3.经筛选获得能稳定分泌抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体 2 株和杂交瘤细胞 2 株，分别命名为为 MNT1和 MNT2； Western blo
43、tting 显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫重组融合蛋白NTPase-发生特异性结合，ELISA 结果显示 2 株单克隆抗体均能与弓形虫速殖子全虫蛋白及弓形虫重组融合蛋白 NTPase-发生特异性结合；2 株单克隆抗体经免疫球蛋白类和亚类鉴定均为 IgG2a；免疫保护实验表明 2 株单克隆抗体无法阻止弓形虫入侵宿主细胞，但却可抑制弓形虫在宿主细胞内增殖；动物保护实验证实 2 株单抗都有一定的保护作用；免疫荧光定位结果显示 2 株单克隆抗体与弓形虫的结合部位主要是在弓形虫膜表面。 4.PCR 扩增得到特异的刚地弓形虫 NTPase-基因序列，成功构建了真核表达载体 PVAX1-NTPase，经
44、测序鉴定亚克隆的 NTPase-基因序列与 Genebank 公布的序列同源性为 100。 结论： 1.本实验成功表达了弓形虫 NTPase-融合蛋白，间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠血清抗体的敏感性和特异性较高，有望应用于弓形虫感染的早期检测。 2.制备的抗弓形虫融合蛋白 NTPase-杂交瘤细胞株能分泌识别融合蛋白 NTPase-的高特异性单克隆抗体，对单克隆抗体的初步应用显示其对弓形虫在宿主细胞内的繁殖具有一定的抑制作用，采用该单抗进行被动免疫具有一定保护效果。 3.成功构建了真核表达质粒 PVAX1-NTPase-，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定刚地弓形虫(Toxoplasma gond
45、ii)是一种全球分布的机会致病性原虫，可在人和动物的所有有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病，孕妇及免疫缺陷人群感染后可引起严重的后果。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原，NTPase 蛋白有 NTPase-和NTPase-两种亚型，其中 NTPase-仅存在于有毒株，而 NTPase-存在于所有弓形虫株体内12，因此 NTPase-可用于检测候选抗原和候选的保护性抗原。本研究将
46、对弓形虫 NTPase-基因进行原核表达，探讨 NTPase-原核表达蛋白在弓形虫病早期诊断的应用，并制备其单克隆抗体，研究单抗对弓形虫的抑制作用。此外，并构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的研制奠定基础。 目的： 1.诱导表达弓形虫融合蛋白 NTPase-，建立检测小鼠血清中刚地弓形虫 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体的间接 ELISA法，探讨用于弓形虫感染早期检测的应用价值。 2.制备、鉴定抗弓形虫融合蛋白 NTPase-单克隆抗体，通过体外、体内实验探讨单克隆抗体对弓形虫的抑制作用。 3.构建弓形虫 NTPase-基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的制
47、备奠定基础。 方法： 1.NTPase-基因的原核表达 用含重组表达质粒 NTPase-pBAD-HisB 的 E.coli BL21(DE3)在一定条件下在诱导剂 L-阿拉伯糖的作用下进行诱导表达。 2.重组 NTPase-融合蛋白的纯化及鉴定 使用 Ni 离子亲和层析柱纯化重组质粒 pBAD-HisB-NTPase 表达产生的含组氨酸的重组融合蛋白，SDS-PAGE 鉴定其纯度。对纯化蛋白进行透析复性后，紫外分光光度计测定其浓度。 3.间接 ELISA 检测弓形虫感染鼠 NTPase-抗体 以刚地弓形虫 NTPase-融合蛋白为包被抗原建立间接 ELISA 法，动态检测刚地弓形虫实验感染鼠
48、血清 NTPase-特异性 IgG、IgM 抗体变化，试验设脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清对照。 4.单克隆抗体的制备及应用 用融合蛋白 NTPase-作为抗原，免疫 BALB/c 小鼠，共免疫 3 次，每次间隔 2 周，末次免疫后 3d 取小鼠脾细胞及 Sp2/0 骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合，有限稀释法筛选出高滴度分泌 McAb 的杂交瘤细胞株，蛋白质印迹(Western blotting)及 ELISA 分析其特异性，试剂盒测定其免疫球蛋白亚类，初步探讨其在弓形虫诊断及治疗中的应用。 5.NTPase-基因真核表达载体的构建 采用 PCR 方法扩增刚地弓形虫 RH 株的 NTPase-基因，克隆入 pGEM-T easy 载体，阳性克隆经酶切与测序鉴定后亚克隆至真核表达质粒 PVAX1。 结果： 1.SDS-PAGE 结果表明 NTPase-基因在 E.coli BL21(DE3)中获得高效表达，表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70000，与理论值相近。经 Nj2+-NTA 树脂纯化后纯
