1、康复医学与理疗学(激光医学)专业毕业论文 精品论文 血卟啉单甲醚光动力学疗法抑制增生性瘢痕的实验研究关键词：光动力学疗法 血卟啉单甲醚 增生性瘢痕 细胞凋亡 信号转导摘要：目的： 增生性瘢痕(HS)是成纤维细胞异常增殖和细胞外基质过度沉积的纤维化疾病，是医学界亟待解决的难题。本文研究以血卟啉单甲醚(HMME)为光敏剂的光动力学疗法(PDT)对瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖与功能的影响并初步探讨其作用机制，在动物瘢痕模型上观察 HMME-PDT 的生物学效应，为临床应用HMME-PDT 防治增生性瘢痕提供实验依据。 方法： 1HSF 对 HMME 的吸收特性及 HMME-PDT 对其增殖效应的研究
2、：取原代培养的第 46 代 HSF，经流式细胞仪(FCM)检测孵育浓度(040g/ml)和孵育时间(0120min)对 HSF 细胞吸收 HMME 的影响；MTT 法检测 HMME-PDT 对 HSF 细胞存活率的影响；银染法检测HSF 中核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs)的表达情况；FCM 分析细胞周期的变化。2HMME-PDT 对 HSF 中 TGF-1/Smad 信号通路的影响：用酶联免疫吸附法(ELISA)检测 HMME-PDT 后 HSF 分泌至上清液的 TGF-1 蛋白表达量；用 Smad3-FITC 标记后在荧光显微镜上观察细胞内 Smad3 的荧光强度；将细胞分为对照组、光
3、敏剂组、照光组和 HMME-PDT 组，经 Western-blot 方法检测各组细胞浆内TGF-1、磷酸化和非磷酸化 Smad3、Smad7 蛋白的表达量。 3HMME-PDT 诱导 HSF 凋亡效应的研究：Hoechst33258 染色后在荧光显微镜上观察 HMME-PDT后 HSF 细胞形态学变化；Annexin V-FITC-PI 双染后经 FCM 检测 HMME-PDT 后HSF 细胞凋亡率和坏死率；将 HSF 爬片后分为对照组、HMME-PDT 组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组，Caspase3-FITC-PI 染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内Caspase3 的荧光强度；收
4、集各组细胞在 active-Caspase3-FITC 单染后经 FCM检测 active-Caspase3 阳性细胞百分率；收集各组细胞在 PI 单染后经 FCM 检测细胞凋亡率。 4HMME-PDT 对兔耳瘢痕的效应研究：建立兔耳瘢痕模型后，将瘢痕块分为不同组别，照光功率密度为 20mW/cm2，光敏剂剂量为 10mg/kg，分别在给药后即刻、0.5、1、3h 给予 2.5、5、10、20J/cm2 的能量密度照光，治疗后第 10 天用游标卡尺测量并计算瘢痕增生指数(HI)；HE 染色后观察瘢痕厚度、细胞及胶原分布等形态学变化；观察 HMME-PDT 后瘢痕中微血管数量、形态变化，采用 W
5、eidner 计数方法，计算平均微血管密度(MVD)；运用透射电镜观察兔耳瘢痕增生块中成纤维细胞超微结构的变化。 结果： 1在一定孵育浓度范围内(040g/ml)，HSF 细胞对 HMME 的吸收量随孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增大。实验范围内的 HMME-PDT 对 HSF 细胞的杀伤效应与孵育浓度和激光能量密度正相关；HMME-PDT 能够减少 HSF 细胞中 AgNORs 的含量，使IS值降低；HMME-PDT 降低 HSF 增殖指数，改变各期细胞的分布比例，抑制S 期 DNA 合成，使细胞滞留在 G0/G1 期。 2HSF 分泌至细胞上清液的 TGF-1 蛋白含量较高，而 HMME
6、-PDT 后降低；HSF 合成的 TGF-1 蛋白水平高，HMME-PDT 后 HSF 中的 TGF-1 和磷酸化 Smad3 蛋白含量减少，Smad7 蛋白含量增加，光敏剂组和照光组中上述蛋白的表达无显著改变；PDT 不能改变 HSF 内Smad3 蛋白表达量，但其在细胞内的分布发生变化，进入细胞核的 Smad3 蛋白减少。 3HMME-PDT 治疗后细胞核染色质高度凝聚，呈团块颗粒状，或呈波纹状、折缝样改变；Annexin V-FITC-PI 双染结果表明 PDT 后凋亡率显著升高，并伴有细胞坏死的发生，但组内坏死率低于凋亡率；对照组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组 HSF 的细胞浆中
7、Caspase3-FITC 荧光微弱，PDT 组荧光显著增强；对照组active-Caspase-3 阳性细胞百分率低，HMME-PDT 组上升，Z-DEVD-FMK 组降低；PI 染色分析表明对照组凋亡率低，PDT 组的凋亡率显著升高，Z-DEVD-FMK 组的凋亡率低于 PDT 组，但仍然显著高于对照组。 4在本研究的兔耳增生性瘢痕块中，静脉注射 HMME10mg/kg 后 30min，给予功率密度为 20mW/cm2，能量密度为 5J/cm2 的 630nm 红光照射能对瘢痕块产生较理想的抑制效应；对照组兔耳瘢痕块真皮层显著增厚，血管分布丰富，HMME-PDT 组瘢痕块厚度下降，MVD
8、显著减少；在透射电镜下观察到对照组中有大量 HSF，胞浆内粗面内质网丰富，高尔基体发达，线粒体增加，PDT 组胞浆内粗面内质网萎缩且数量减少，核蛋白体有不同程度的脱颗粒和解聚，胞质中见较多游离核糖体，线粒体肿胀，嵴溶解。 结论： 1HSF 对 HMME 的吸收随孵育浓度和孵育时间的增加而增加，HMME-PDT 处理 HSF 时，光敏剂孵育浓度和激光能量密度是影响细胞存活率的重要因素，PDT 改变各期细胞的分布比例，抑制细胞增殖。 2HMME-PDT能够阻止 TGF-1 的信号经由 Smad 蛋白传向细胞核，改变 TGF-1、磷酸化Smad3 和 Smad7 在 HSF 细胞水平的表达，使细胞增
9、殖及胶原合成有关的靶基因得不到激活，从而抑制 HSF 增殖和胶原合成。 3HMME-PDT 诱导 HSF 发生的凋亡效应与 Caspase-3 的激活密切相关，但该凋亡效应并不依赖于 Caspase-3，可能与 AIF 等因子的释放或其它信号途径的激活有关。 4HMME-PDT 对兔耳增生性瘢痕的生物学效应是一个光动力综合作用的结果，与光敏剂的剂量和激光照光时间、给药后至照光的时间间隔及能量密度密切相关。在瘢痕形成早期，HMME-PDT 能够抑制兔耳 HSF 的增殖，破坏蛋白合成场所，并能诱导部分细胞进入凋亡途径，HMME-PDT 有可能成为瘢痕防治的有效方法。正文内容目的： 增生性瘢痕(HS
10、)是成纤维细胞异常增殖和细胞外基质过度沉积的纤维化疾病，是医学界亟待解决的难题。本文研究以血卟啉单甲醚(HMME)为光敏剂的光动力学疗法(PDT)对瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖与功能的影响并初步探讨其作用机制，在动物瘢痕模型上观察 HMME-PDT 的生物学效应，为临床应用HMME-PDT 防治增生性瘢痕提供实验依据。 方法： 1HSF 对 HMME 的吸收特性及 HMME-PDT 对其增殖效应的研究：取原代培养的第 46 代 HSF，经流式细胞仪(FCM)检测孵育浓度(040g/ml)和孵育时间(0120min)对 HSF 细胞吸收 HMME 的影响；MTT 法检测 HMME-PDT 对 H
11、SF 细胞存活率的影响；银染法检测HSF 中核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs)的表达情况；FCM 分析细胞周期的变化。2HMME-PDT 对 HSF 中 TGF-1/Smad 信号通路的影响：用酶联免疫吸附法(ELISA)检测 HMME-PDT 后 HSF 分泌至上清液的 TGF-1 蛋白表达量；用 Smad3-FITC 标记后在荧光显微镜上观察细胞内 Smad3 的荧光强度；将细胞分为对照组、光敏剂组、照光组和 HMME-PDT 组，经 Western-blot 方法检测各组细胞浆内TGF-1、磷酸化和非磷酸化 Smad3、Smad7 蛋白的表达量。 3HMME-PDT 诱导 HSF 凋
12、亡效应的研究：Hoechst33258 染色后在荧光显微镜上观察 HMME-PDT后 HSF 细胞形态学变化；Annexin V-FITC-PI 双染后经 FCM 检测 HMME-PDT 后HSF 细胞凋亡率和坏死率；将 HSF 爬片后分为对照组、HMME-PDT 组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组，Caspase3-FITC-PI 染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内Caspase3 的荧光强度；收集各组细胞在 active-Caspase3-FITC 单染后经 FCM检测 active-Caspase3 阳性细胞百分率；收集各组细胞在 PI 单染后经 FCM 检测细胞凋亡率。 4HMME-
13、PDT 对兔耳瘢痕的效应研究：建立兔耳瘢痕模型后，将瘢痕块分为不同组别，照光功率密度为 20mW/cm2，光敏剂剂量为 10mg/kg，分别在给药后即刻、0.5、1、3h 给予 2.5、5、10、20J/cm2 的能量密度照光，治疗后第 10 天用游标卡尺测量并计算瘢痕增生指数(HI)；HE 染色后观察瘢痕厚度、细胞及胶原分布等形态学变化；观察 HMME-PDT 后瘢痕中微血管数量、形态变化，采用 Weidner 计数方法，计算平均微血管密度(MVD)；运用透射电镜观察兔耳瘢痕增生块中成纤维细胞超微结构的变化。 结果： 1在一定孵育浓度范围内(040g/ml)，HSF 细胞对 HMME 的吸收
14、量随孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增大。实验范围内的 HMME-PDT 对 HSF 细胞的杀伤效应与孵育浓度和激光能量密度正相关；HMME-PDT 能够减少 HSF 细胞中 AgNORs 的含量，使IS值降低；HMME-PDT 降低 HSF 增殖指数，改变各期细胞的分布比例，抑制S 期 DNA 合成，使细胞滞留在 G0/G1 期。 2HSF 分泌至细胞上清液的 TGF-1 蛋白含量较高，而 HMME-PDT 后降低；HSF 合成的 TGF-1 蛋白水平高，HMME-PDT 后 HSF 中的 TGF-1 和磷酸化 Smad3 蛋白含量减少，Smad7 蛋白含量增加，光敏剂组和照光组中上述蛋白的
15、表达无显著改变；PDT 不能改变 HSF 内Smad3 蛋白表达量，但其在细胞内的分布发生变化，进入细胞核的 Smad3 蛋白减少。 3HMME-PDT 治疗后细胞核染色质高度凝聚，呈团块颗粒状，或呈波纹状、折缝样改变；Annexin V-FITC-PI 双染结果表明 PDT 后凋亡率显著升高，并伴有细胞坏死的发生，但组内坏死率低于凋亡率；对照组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组 HSF 的细胞浆中 Caspase3-FITC 荧光微弱，PDT 组荧光显著增强；对照组active-Caspase-3 阳性细胞百分率低，HMME-PDT 组上升，Z-DEVD-FMK 组降低；PI 染色分析表明对
16、照组凋亡率低，PDT 组的凋亡率显著升高，Z-DEVD-FMK 组的凋亡率低于 PDT 组，但仍然显著高于对照组。 4在本研究的兔耳增生性瘢痕块中，静脉注射 HMME10mg/kg 后 30min，给予功率密度为 20mW/cm2，能量密度为 5J/cm2 的 630nm 红光照射能对瘢痕块产生较理想的抑制效应；对照组兔耳瘢痕块真皮层显著增厚，血管分布丰富，HMME-PDT 组瘢痕块厚度下降，MVD 显著减少；在透射电镜下观察到对照组中有大量 HSF，胞浆内粗面内质网丰富，高尔基体发达，线粒体增加，PDT 组胞浆内粗面内质网萎缩且数量减少，核蛋白体有不同程度的脱颗粒和解聚，胞质中见较多游离核糖
17、体，线粒体肿胀，嵴溶解。 结论： 1HSF 对 HMME 的吸收随孵育浓度和孵育时间的增加而增加，HMME-PDT 处理 HSF 时，光敏剂孵育浓度和激光能量密度是影响细胞存活率的重要因素，PDT 改变各期细胞的分布比例，抑制细胞增殖。 2HMME-PDT能够阻止 TGF-1 的信号经由 Smad 蛋白传向细胞核，改变 TGF-1、磷酸化Smad3 和 Smad7 在 HSF 细胞水平的表达，使细胞增殖及胶原合成有关的靶基因得不到激活，从而抑制 HSF 增殖和胶原合成。 3HMME-PDT 诱导 HSF 发生的凋亡效应与 Caspase-3 的激活密切相关，但该凋亡效应并不依赖于 Caspas
18、e-3，可能与 AIF 等因子的释放或其它信号途径的激活有关。 4HMME-PDT 对兔耳增生性瘢痕的生物学效应是一个光动力综合作用的结果，与光敏剂的剂量和激光照光时间、给药后至照光的时间间隔及能量密度密切相关。在瘢痕形成早期，HMME-PDT 能够抑制兔耳 HSF 的增殖，破坏蛋白合成场所，并能诱导部分细胞进入凋亡途径，HMME-PDT 有可能成为瘢痕防治的有效方法。目的： 增生性瘢痕(HS)是成纤维细胞异常增殖和细胞外基质过度沉积的纤维化疾病，是医学界亟待解决的难题。本文研究以血卟啉单甲醚(HMME)为光敏剂的光动力学疗法(PDT)对瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖与功能的影响并初步探讨其作用
19、机制，在动物瘢痕模型上观察 HMME-PDT 的生物学效应，为临床应用 HMME-PDT 防治增生性瘢痕提供实验依据。 方法： 1HSF 对 HMME 的吸收特性及HMME-PDT 对其增殖效应的研究：取原代培养的第 46 代 HSF，经流式细胞仪(FCM)检测孵育浓度(040g/ml)和孵育时间(0120min)对 HSF 细胞吸收HMME 的影响；MTT 法检测 HMME-PDT 对 HSF 细胞存活率的影响；银染法检测 HSF中核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs)的表达情况；FCM 分析细胞周期的变化。 2HMME-PDT 对 HSF 中 TGF-1/Smad 信号通路的影响：用酶联免
20、疫吸附法(ELISA)检测 HMME-PDT 后 HSF 分泌至上清液的 TGF-1 蛋白表达量；用 Smad3-FITC 标记后在荧光显微镜上观察细胞内 Smad3 的荧光强度；将细胞分为对照组、光敏剂组、照光组和 HMME-PDT 组，经 Western-blot 方法检测各组细胞浆内TGF-1、磷酸化和非磷酸化 Smad3、Smad7 蛋白的表达量。 3HMME-PDT 诱导 HSF 凋亡效应的研究：Hoechst33258 染色后在荧光显微镜上观察 HMME-PDT后 HSF 细胞形态学变化；Annexin V-FITC-PI 双染后经 FCM 检测 HMME-PDT 后HSF 细胞凋
21、亡率和坏死率；将 HSF 爬片后分为对照组、HMME-PDT 组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组，Caspase3-FITC-PI 染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内Caspase3 的荧光强度；收集各组细胞在 active-Caspase3-FITC 单染后经 FCM检测 active-Caspase3 阳性细胞百分率；收集各组细胞在 PI 单染后经 FCM 检测细胞凋亡率。 4HMME-PDT 对兔耳瘢痕的效应研究：建立兔耳瘢痕模型后，将瘢痕块分为不同组别，照光功率密度为 20mW/cm2，光敏剂剂量为 10mg/kg，分别在给药后即刻、0.5、1、3h 给予 2.5、5、10、20J/
22、cm2 的能量密度照光，治疗后第 10 天用游标卡尺测量并计算瘢痕增生指数(HI)；HE 染色后观察瘢痕厚度、细胞及胶原分布等形态学变化；观察 HMME-PDT 后瘢痕中微血管数量、形态变化，采用 Weidner 计数方法，计算平均微血管密度(MVD)；运用透射电镜观察兔耳瘢痕增生块中成纤维细胞超微结构的变化。 结果： 1在一定孵育浓度范围内(040g/ml)，HSF 细胞对 HMME 的吸收量随孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增大。实验范围内的 HMME-PDT 对 HSF 细胞的杀伤效应与孵育浓度和激光能量密度正相关；HMME-PDT 能够减少 HSF 细胞中 AgNORs 的含量，使IS
23、值降低；HMME-PDT 降低 HSF 增殖指数，改变各期细胞的分布比例，抑制S 期 DNA 合成，使细胞滞留在 G0/G1 期。 2HSF 分泌至细胞上清液的 TGF-1 蛋白含量较高，而 HMME-PDT 后降低；HSF 合成的 TGF-1 蛋白水平高，HMME-PDT 后 HSF 中的 TGF-1 和磷酸化 Smad3 蛋白含量减少，Smad7 蛋白含量增加，光敏剂组和照光组中上述蛋白的表达无显著改变；PDT 不能改变 HSF 内Smad3 蛋白表达量，但其在细胞内的分布发生变化，进入细胞核的 Smad3 蛋白减少。 3HMME-PDT 治疗后细胞核染色质高度凝聚，呈团块颗粒状，或呈波纹
24、状、折缝样改变；Annexin V-FITC-PI 双染结果表明 PDT 后凋亡率显著升高，并伴有细胞坏死的发生，但组内坏死率低于凋亡率；对照组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组 HSF 的细胞浆中 Caspase3-FITC 荧光微弱，PDT 组荧光显著增强；对照组active-Caspase-3 阳性细胞百分率低，HMME-PDT 组上升，Z-DEVD-FMK 组降低；PI 染色分析表明对照组凋亡率低，PDT 组的凋亡率显著升高，Z-DEVD-FMK 组的凋亡率低于 PDT 组，但仍然显著高于对照组。 4在本研究的兔耳增生性瘢痕块中，静脉注射 HMME10mg/kg 后 30min，给予功
25、率密度为 20mW/cm2，能量密度为 5J/cm2 的 630nm 红光照射能对瘢痕块产生较理想的抑制效应；对照组兔耳瘢痕块真皮层显著增厚，血管分布丰富，HMME-PDT 组瘢痕块厚度下降，MVD 显著减少；在透射电镜下观察到对照组中有大量 HSF，胞浆内粗面内质网丰富，高尔基体发达，线粒体增加，PDT 组胞浆内粗面内质网萎缩且数量减少，核蛋白体有不同程度的脱颗粒和解聚，胞质中见较多游离核糖体，线粒体肿胀，嵴溶解。 结论： 1HSF 对 HMME 的吸收随孵育浓度和孵育时间的增加而增加，HMME-PDT 处理 HSF 时，光敏剂孵育浓度和激光能量密度是影响细胞存活率的重要因素，PDT 改变各
26、期细胞的分布比例，抑制细胞增殖。 2HMME-PDT能够阻止 TGF-1 的信号经由 Smad 蛋白传向细胞核，改变 TGF-1、磷酸化Smad3 和 Smad7 在 HSF 细胞水平的表达，使细胞增殖及胶原合成有关的靶基因得不到激活，从而抑制 HSF 增殖和胶原合成。 3HMME-PDT 诱导 HSF 发生的凋亡效应与 Caspase-3 的激活密切相关，但该凋亡效应并不依赖于 Caspase-3，可能与 AIF 等因子的释放或其它信号途径的激活有关。 4HMME-PDT 对兔耳增生性瘢痕的生物学效应是一个光动力综合作用的结果，与光敏剂的剂量和激光照光时间、给药后至照光的时间间隔及能量密度密
27、切相关。在瘢痕形成早期，HMME-PDT 能够抑制兔耳 HSF 的增殖，破坏蛋白合成场所，并能诱导部分细胞进入凋亡途径，HMME-PDT 有可能成为瘢痕防治的有效方法。目的： 增生性瘢痕(HS)是成纤维细胞异常增殖和细胞外基质过度沉积的纤维化疾病，是医学界亟待解决的难题。本文研究以血卟啉单甲醚(HMME)为光敏剂的光动力学疗法(PDT)对瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖与功能的影响并初步探讨其作用机制，在动物瘢痕模型上观察 HMME-PDT 的生物学效应，为临床应用 HMME-PDT 防治增生性瘢痕提供实验依据。 方法： 1HSF 对 HMME 的吸收特性及HMME-PDT 对其增殖效应的研究：取
28、原代培养的第 46 代 HSF，经流式细胞仪(FCM)检测孵育浓度(040g/ml)和孵育时间(0120min)对 HSF 细胞吸收HMME 的影响；MTT 法检测 HMME-PDT 对 HSF 细胞存活率的影响；银染法检测 HSF中核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs)的表达情况；FCM 分析细胞周期的变化。 2HMME-PDT 对 HSF 中 TGF-1/Smad 信号通路的影响：用酶联免疫吸附法(ELISA)检测 HMME-PDT 后 HSF 分泌至上清液的 TGF-1 蛋白表达量；用 Smad3-FITC 标记后在荧光显微镜上观察细胞内 Smad3 的荧光强度；将细胞分为对照组、光敏剂
29、组、照光组和 HMME-PDT 组，经 Western-blot 方法检测各组细胞浆内TGF-1、磷酸化和非磷酸化 Smad3、Smad7 蛋白的表达量。 3HMME-PDT 诱导 HSF 凋亡效应的研究：Hoechst33258 染色后在荧光显微镜上观察 HMME-PDT后 HSF 细胞形态学变化；Annexin V-FITC-PI 双染后经 FCM 检测 HMME-PDT 后HSF 细胞凋亡率和坏死率；将 HSF 爬片后分为对照组、HMME-PDT 组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组，Caspase3-FITC-PI 染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内Caspase3 的荧光强度；收集各
30、组细胞在 active-Caspase3-FITC 单染后经 FCM检测 active-Caspase3 阳性细胞百分率；收集各组细胞在 PI 单染后经 FCM 检测细胞凋亡率。 4HMME-PDT 对兔耳瘢痕的效应研究：建立兔耳瘢痕模型后，将瘢痕块分为不同组别，照光功率密度为 20mW/cm2，光敏剂剂量为 10mg/kg，分别在给药后即刻、0.5、1、3h 给予 2.5、5、10、20J/cm2 的能量密度照光，治疗后第 10 天用游标卡尺测量并计算瘢痕增生指数(HI)；HE 染色后观察瘢痕厚度、细胞及胶原分布等形态学变化；观察 HMME-PDT 后瘢痕中微血管数量、形态变化，采用 Wei
31、dner 计数方法，计算平均微血管密度(MVD)；运用透射电镜观察兔耳瘢痕增生块中成纤维细胞超微结构的变化。 结果： 1在一定孵育浓度范围内(040g/ml)，HSF 细胞对 HMME 的吸收量随孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增大。实验范围内的 HMME-PDT 对 HSF 细胞的杀伤效应与孵育浓度和激光能量密度正相关；HMME-PDT 能够减少 HSF 细胞中 AgNORs 的含量，使IS值降低；HMME-PDT 降低 HSF 增殖指数，改变各期细胞的分布比例，抑制S 期 DNA 合成，使细胞滞留在 G0/G1 期。 2HSF 分泌至细胞上清液的 TGF-1 蛋白含量较高，而 HMME-P
32、DT 后降低；HSF 合成的 TGF-1 蛋白水平高，HMME-PDT 后 HSF 中的 TGF-1 和磷酸化 Smad3 蛋白含量减少，Smad7 蛋白含量增加，光敏剂组和照光组中上述蛋白的表达无显著改变；PDT 不能改变 HSF 内Smad3 蛋白表达量，但其在细胞内的分布发生变化，进入细胞核的 Smad3 蛋白减少。 3HMME-PDT 治疗后细胞核染色质高度凝聚，呈团块颗粒状，或呈波纹状、折缝样改变；Annexin V-FITC-PI 双染结果表明 PDT 后凋亡率显著升高，并伴有细胞坏死的发生，但组内坏死率低于凋亡率；对照组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组 HSF 的细胞浆中 Ca
33、spase3-FITC 荧光微弱，PDT 组荧光显著增强；对照组active-Caspase-3 阳性细胞百分率低，HMME-PDT 组上升，Z-DEVD-FMK 组降低；PI 染色分析表明对照组凋亡率低，PDT 组的凋亡率显著升高，Z-DEVD-FMK 组的凋亡率低于 PDT 组，但仍然显著高于对照组。 4在本研究的兔耳增生性瘢痕块中，静脉注射 HMME10mg/kg 后 30min，给予功率密度为 20mW/cm2，能量密度为 5J/cm2 的 630nm 红光照射能对瘢痕块产生较理想的抑制效应；对照组兔耳瘢痕块真皮层显著增厚，血管分布丰富，HMME-PDT 组瘢痕块厚度下降，MVD 显著
34、减少；在透射电镜下观察到对照组中有大量 HSF，胞浆内粗面内质网丰富，高尔基体发达，线粒体增加，PDT 组胞浆内粗面内质网萎缩且数量减少，核蛋白体有不同程度的脱颗粒和解聚，胞质中见较多游离核糖体，线粒体肿胀，嵴溶解。 结论： 1HSF 对 HMME 的吸收随孵育浓度和孵育时间的增加而增加，HMME-PDT 处理 HSF 时，光敏剂孵育浓度和激光能量密度是影响细胞存活率的重要因素，PDT 改变各期细胞的分布比例，抑制细胞增殖。 2HMME-PDT能够阻止 TGF-1 的信号经由 Smad 蛋白传向细胞核，改变 TGF-1、磷酸化Smad3 和 Smad7 在 HSF 细胞水平的表达，使细胞增殖及
35、胶原合成有关的靶基因得不到激活，从而抑制 HSF 增殖和胶原合成。 3HMME-PDT 诱导 HSF 发生的凋亡效应与 Caspase-3 的激活密切相关，但该凋亡效应并不依赖于 Caspase-3，可能与 AIF 等因子的释放或其它信号途径的激活有关。 4HMME-PDT 对兔耳增生性瘢痕的生物学效应是一个光动力综合作用的结果，与光敏剂的剂量和激光照光时间、给药后至照光的时间间隔及能量密度密切相关。在瘢痕形成早期，HMME-PDT 能够抑制兔耳 HSF 的增殖，破坏蛋白合成场所，并能诱导部分细胞进入凋亡途径，HMME-PDT 有可能成为瘢痕防治的有效方法。目的： 增生性瘢痕(HS)是成纤维细
36、胞异常增殖和细胞外基质过度沉积的纤维化疾病，是医学界亟待解决的难题。本文研究以血卟啉单甲醚(HMME)为光敏剂的光动力学疗法(PDT)对瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖与功能的影响并初步探讨其作用机制，在动物瘢痕模型上观察 HMME-PDT 的生物学效应，为临床应用 HMME-PDT 防治增生性瘢痕提供实验依据。 方法： 1HSF 对 HMME 的吸收特性及HMME-PDT 对其增殖效应的研究：取原代培养的第 46 代 HSF，经流式细胞仪(FCM)检测孵育浓度(040g/ml)和孵育时间(0120min)对 HSF 细胞吸收HMME 的影响；MTT 法检测 HMME-PDT 对 HSF 细胞存活
37、率的影响；银染法检测 HSF中核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs)的表达情况；FCM 分析细胞周期的变化。 2HMME-PDT 对 HSF 中 TGF-1/Smad 信号通路的影响：用酶联免疫吸附法(ELISA)检测 HMME-PDT 后 HSF 分泌至上清液的 TGF-1 蛋白表达量；用 Smad3-FITC 标记后在荧光显微镜上观察细胞内 Smad3 的荧光强度；将细胞分为对照组、光敏剂组、照光组和 HMME-PDT 组，经 Western-blot 方法检测各组细胞浆内TGF-1、磷酸化和非磷酸化 Smad3、Smad7 蛋白的表达量。 3HMME-PDT 诱导 HSF 凋亡效应的研究
38、：Hoechst33258 染色后在荧光显微镜上观察 HMME-PDT后 HSF 细胞形态学变化；Annexin V-FITC-PI 双染后经 FCM 检测 HMME-PDT 后HSF 细胞凋亡率和坏死率；将 HSF 爬片后分为对照组、HMME-PDT 组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组，Caspase3-FITC-PI 染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内Caspase3 的荧光强度；收集各组细胞在 active-Caspase3-FITC 单染后经 FCM检测 active-Caspase3 阳性细胞百分率；收集各组细胞在 PI 单染后经 FCM 检测细胞凋亡率。 4HMME-PDT 对兔
39、耳瘢痕的效应研究：建立兔耳瘢痕模型后，将瘢痕块分为不同组别，照光功率密度为 20mW/cm2，光敏剂剂量为 10mg/kg，分别在给药后即刻、0.5、1、3h 给予 2.5、5、10、20J/cm2 的能量密度照光，治疗后第 10 天用游标卡尺测量并计算瘢痕增生指数(HI)；HE 染色后观察瘢痕厚度、细胞及胶原分布等形态学变化；观察 HMME-PDT 后瘢痕中微血管数量、形态变化，采用 Weidner 计数方法，计算平均微血管密度(MVD)；运用透射电镜观察兔耳瘢痕增生块中成纤维细胞超微结构的变化。 结果： 1在一定孵育浓度范围内(040g/ml)，HSF 细胞对 HMME 的吸收量随孵育浓度
40、的增高和孵育时间的增加而增大。实验范围内的 HMME-PDT 对 HSF 细胞的杀伤效应与孵育浓度和激光能量密度正相关；HMME-PDT 能够减少 HSF 细胞中 AgNORs 的含量，使IS值降低；HMME-PDT 降低 HSF 增殖指数，改变各期细胞的分布比例，抑制S 期 DNA 合成，使细胞滞留在 G0/G1 期。 2HSF 分泌至细胞上清液的 TGF-1 蛋白含量较高，而 HMME-PDT 后降低；HSF 合成的 TGF-1 蛋白水平高，HMME-PDT 后 HSF 中的 TGF-1 和磷酸化 Smad3 蛋白含量减少，Smad7 蛋白含量增加，光敏剂组和照光组中上述蛋白的表达无显著改
41、变；PDT 不能改变 HSF 内Smad3 蛋白表达量，但其在细胞内的分布发生变化，进入细胞核的 Smad3 蛋白减少。 3HMME-PDT 治疗后细胞核染色质高度凝聚，呈团块颗粒状，或呈波纹状、折缝样改变；Annexin V-FITC-PI 双染结果表明 PDT 后凋亡率显著升高，并伴有细胞坏死的发生，但组内坏死率低于凋亡率；对照组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组 HSF 的细胞浆中 Caspase3-FITC 荧光微弱，PDT 组荧光显著增强；对照组active-Caspase-3 阳性细胞百分率低，HMME-PDT 组上升，Z-DEVD-FMK 组降低；PI 染色分析表明对照组凋亡率低
42、，PDT 组的凋亡率显著升高，Z-DEVD-FMK 组的凋亡率低于 PDT 组，但仍然显著高于对照组。 4在本研究的兔耳增生性瘢痕块中，静脉注射 HMME10mg/kg 后 30min，给予功率密度为 20mW/cm2，能量密度为 5J/cm2 的 630nm 红光照射能对瘢痕块产生较理想的抑制效应；对照组兔耳瘢痕块真皮层显著增厚，血管分布丰富，HMME-PDT 组瘢痕块厚度下降，MVD 显著减少；在透射电镜下观察到对照组中有大量 HSF，胞浆内粗面内质网丰富，高尔基体发达，线粒体增加，PDT 组胞浆内粗面内质网萎缩且数量减少，核蛋白体有不同程度的脱颗粒和解聚，胞质中见较多游离核糖体，线粒体肿
43、胀，嵴溶解。 结论： 1HSF 对 HMME 的吸收随孵育浓度和孵育时间的增加而增加，HMME-PDT 处理 HSF 时，光敏剂孵育浓度和激光能量密度是影响细胞存活率的重要因素，PDT 改变各期细胞的分布比例，抑制细胞增殖。 2HMME-PDT能够阻止 TGF-1 的信号经由 Smad 蛋白传向细胞核，改变 TGF-1、磷酸化Smad3 和 Smad7 在 HSF 细胞水平的表达，使细胞增殖及胶原合成有关的靶基因得不到激活，从而抑制 HSF 增殖和胶原合成。 3HMME-PDT 诱导 HSF 发生的凋亡效应与 Caspase-3 的激活密切相关，但该凋亡效应并不依赖于 Caspase-3，可能
44、与 AIF 等因子的释放或其它信号途径的激活有关。 4HMME-PDT 对兔耳增生性瘢痕的生物学效应是一个光动力综合作用的结果，与光敏剂的剂量和激光照光时间、给药后至照光的时间间隔及能量密度密切相关。在瘢痕形成早期，HMME-PDT 能够抑制兔耳 HSF 的增殖，破坏蛋白合成场所，并能诱导部分细胞进入凋亡途径，HMME-PDT 有可能成为瘢痕防治的有效方法。目的： 增生性瘢痕(HS)是成纤维细胞异常增殖和细胞外基质过度沉积的纤维化疾病，是医学界亟待解决的难题。本文研究以血卟啉单甲醚(HMME)为光敏剂的光动力学疗法(PDT)对瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖与功能的影响并初步探讨其作用机制，在动物
45、瘢痕模型上观察 HMME-PDT 的生物学效应，为临床应用 HMME-PDT 防治增生性瘢痕提供实验依据。 方法： 1HSF 对 HMME 的吸收特性及HMME-PDT 对其增殖效应的研究：取原代培养的第 46 代 HSF，经流式细胞仪(FCM)检测孵育浓度(040g/ml)和孵育时间(0120min)对 HSF 细胞吸收HMME 的影响；MTT 法检测 HMME-PDT 对 HSF 细胞存活率的影响；银染法检测 HSF中核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs)的表达情况；FCM 分析细胞周期的变化。 2HMME-PDT 对 HSF 中 TGF-1/Smad 信号通路的影响：用酶联免疫吸附法(E
46、LISA)检测 HMME-PDT 后 HSF 分泌至上清液的 TGF-1 蛋白表达量；用 Smad3-FITC 标记后在荧光显微镜上观察细胞内 Smad3 的荧光强度；将细胞分为对照组、光敏剂组、照光组和 HMME-PDT 组，经 Western-blot 方法检测各组细胞浆内TGF-1、磷酸化和非磷酸化 Smad3、Smad7 蛋白的表达量。 3HMME-PDT 诱导 HSF 凋亡效应的研究：Hoechst33258 染色后在荧光显微镜上观察 HMME-PDT后 HSF 细胞形态学变化；Annexin V-FITC-PI 双染后经 FCM 检测 HMME-PDT 后HSF 细胞凋亡率和坏死率
47、；将 HSF 爬片后分为对照组、HMME-PDT 组和 Z-DEVD-FMK 抑制剂组，Caspase3-FITC-PI 染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内Caspase3 的荧光强度；收集各组细胞在 active-Caspase3-FITC 单染后经 FCM检测 active-Caspase3 阳性细胞百分率；收集各组细胞在 PI 单染后经 FCM 检测细胞凋亡率。 4HMME-PDT 对兔耳瘢痕的效应研究：建立兔耳瘢痕模型后，将瘢痕块分为不同组别，照光功率密度为 20mW/cm2，光敏剂剂量为 10mg/kg，分别在给药后即刻、0.5、1、3h 给予 2.5、5、10、20J/cm2 的能
48、量密度照光，治疗后第 10 天用游标卡尺测量并计算瘢痕增生指数(HI)；HE 染色后观察瘢痕厚度、细胞及胶原分布等形态学变化；观察 HMME-PDT 后瘢痕中微血管数量、形态变化，采用 Weidner 计数方法，计算平均微血管密度(MVD)；运用透射电镜观察兔耳瘢痕增生块中成纤维细胞超微结构的变化。 结果： 1在一定孵育浓度范围内(040g/ml)，HSF 细胞对 HMME 的吸收量随孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增大。实验范围内的 HMME-PDT 对 HSF 细胞的杀伤效应与孵育浓度和激光能量密度正相关；HMME-PDT 能够减少 HSF 细胞中 AgNORs 的含量，使IS值降低；HM
49、ME-PDT 降低 HSF 增殖指数，改变各期细胞的分布比例，抑制S 期 DNA 合成，使细胞滞留在 G0/G1 期。 2HSF 分泌至细胞上清液的 TGF-1 蛋白含量较高，而 HMME-PDT 后降低；HSF 合成的 TGF-1 蛋白水平高，HMME-PDT 后 HSF 中的 TGF-1 和磷酸化 Smad3 蛋白含量减少，Smad7 蛋白含量增加，光敏剂组和照光组中上述蛋白的表达无显著改变；PDT 不能改变 HSF 内Smad3 蛋白表达量，但其在细胞内的分布发生变化，进入细胞核的 Smad3 蛋白减少。 3HMME-PDT 治疗后细胞核染色质高度凝聚，呈团块颗粒状，或呈波纹状、折缝样改变；Annexin V-FITC-PI 双染结果表明 PDT 后凋亡率显著升高，并伴有细胞坏死的发
