1、病理生理学专业优秀论文 大鼠肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达及其功能的初步研究关键词：肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道 蛋白表达 急性肺损伤摘要：ERG(ether-a-go-go-related gene)钾通道属于电压依赖性钾离子通道，在人心肌和脑组织中高表达。越来越多的报道发现该通道与多种病理过程相关，如心律失常、肿瘤等，因此成为近年研究的热点。新近的研究表明，骨髓来源的中枢系统单核-巨噬类细胞小胶质细胞上存在 ERG 钾通道。但是，ERG 钾通道是否存在于肺泡单核-巨噬细胞，若存在表达，其功能如何？与肺泡巨噬细胞的分泌及吞噬功能有何相关，目前均不清楚。探讨肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表
2、达及功能，可为急性肺损伤机制的研究以及治疗提供新的思路。 目的： 1.观察肺泡巨噬细胞上是否有 ERG 钾通道的表达。 2.初步探讨 ERG 钾通道与该细胞的分泌及吞噬功能是否相关。 方法： 1.大鼠肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达 以大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 为研究对象，人肺腺癌细胞系A549 为阴性对照，采用 RT-PCR 方法检测 NR8383 细胞 erg 钾通道 mRNA 的表达，RT-PCR 产物进行 cDNA 测序验证；免疫细胞化学方法和 Western blot 检测NR8383 细胞膜上 ERG 钾通道蛋白的表达。 2.LPS 刺激后大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383
3、细胞 erg mRNA 和蛋白的表达变化 将培养 24h 的 NR8383 细胞系，加入 LPS1ug/ml 刺激(正常对照组细胞不加)，分别于 3h、6h、12h、24h 提取细胞总 RNA 和总蛋白采用 RT-PCR 法和 Western-blot 法检测 ERG 钾通道表达的变化。3.阻断 ERG 钾通道后大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的变化 将细胞分为正常对照组、4-AP 阻断组、TEA 阻断组、E-4031 阻断组。后三组先以相应浓度(分别为 ImM、mM、5M)作用于细胞，阻断钾通道，2h 后和正常对照组一起加入制备好的 5鸡红细胞，使鸡红细胞与大鼠肺泡巨噬细胞的比例大概为100:
4、1，置于培养箱中孵育 th。之后用 4的多聚甲醛固定，再行姬姆萨染色，油镜下观察 100 个 AM，计算吞噬率。吞噬率=已吞噬的巨噬细胞数/巨噬细胞总数100。放射免疫法检测阻断 ERG 钾通道后 LPS 刺激肺泡巨噬细胞分泌炎症因子 IL-6 的变化，将细胞分为 PBS 对照组、LPS 组、4-AP+LPS 组(非特异阻断组)、TEA+LPS 组(非特异阻断组)、E-4031(1M)+LPS 组(特异阻断组)、E-4031(5M)+LPS 组(特异阻断组)；每组设 6 个孔。阻断钾通道 2h 后与 LPS 组一起加 LPS1ug/ml 刺激 24h。24h 后收集上清，采用放射免疫法检测各组
5、上清液中 IL-6 的分泌量。 结果： 1.RT-PCR 及测序结果表明，检测到 480bp 左右的片段(与预期的一致)，表明 NR8383 细胞有 erg mRNA 表达，阴性对照 A549细胞未见 erg mRNA 表达。经 cDNA 测序进一步证实其序列与数据库中序列完全吻合。免疫细胞化学染色显示，大量棕黄色阳性颗粒分布在 NR8383 细胞膜上，表明 NR8383 细胞膜上有 ERG 钾通道蛋白表达，而阴性对照的 A549 细胞膜上未见棕黄色颗粒。Western blot 可以在 NR8383 细胞蛋白提取物中检测到 155kDa和 135kDa 两条特异的 ERG 蛋白条带，而阴性对
6、照 A549 细胞未检测到相应条带。2.LPS 刺激肺泡巨噬细胞后，ERG 钾通道 mRNA 水平和蛋白水平的表达变化 (1)半定量 RT-PCR 检测不同时间点 LPS 刺激后 erg mRNA 表达水平的改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，经 LPS 刺激后 6h 组 erg mRNA 表达明显增强，呈明显时间依赖性增加，至所观察的 24h 组达到最高，为对照组的 2 倍(Plt;0.05)。 (2)通过 Western blot 检测 LPS 刺激后不同时间 ERG 钾通道蛋白表达水平改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，LPS 刺激6h 后显著增强
7、，至所观察的 24h 组达到最高，呈时间依赖性增加，为对照组的2 倍(尸lt;0.05)。 3.ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响 大鼠肺泡巨噬细胞吞噬实验结果显示，与不加 ERG 钾通道阻断剂的对照组相比，加入特异性阻断剂 E4031 及非特异阻断剂 4AP 和 TEA 的吞噬率显著下降(Plt;0.01)，而特异阻断组和非特异阻断组之间的吞噬率无显著差异，提示 ERG 钾通道参与了 AM 细胞的吞噬功能。ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞炎症因子分泌功能的影响，先用特异阻断剂和非特异阻断剂阻断钾通道，再用LPS 刺激 AM 一定时间后收集上清检测 IL-6 的分泌功能，结果
8、显示：与未加阻断剂的对照细胞相比，经特异性阻断剂 E4031 阻断 ERG 钾通道后，AM 细胞分泌IL-6 的量显著下降(Plt;0.01)，但小剂量(1M)并无显著影响；而使用非特异性阻断剂 4-AP 和 TEA 阻断后，同样能够抑制 LPS 刺激的 IL-6 的分泌，而二者之间没有显著差异。以上结果提示：ERG 钾通道参与了 AM 细胞的分泌功能。 结论： 1.大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 存在 erg 钾通道 mRNA，蛋白表达定位于细胞膜；LPS 刺激 NR8383 细胞后，erg 钾通道 mRNA 和蛋白水平呈时间依赖性升高。 2.ERG 钾通道可能与 NR8383 细胞的吞噬
9、与分泌功能有关，特异性及非特异性阻断剂可降低 LPS 引起的 IL-6 分泌和细胞吞噬功能。正文内容ERG(ether-a-go-go-related gene)钾通道属于电压依赖性钾离子通道，在人心肌和脑组织中高表达。越来越多的报道发现该通道与多种病理过程相关，如心律失常、肿瘤等，因此成为近年研究的热点。新近的研究表明，骨髓来源的中枢系统单核-巨噬类细胞小胶质细胞上存在 ERG 钾通道。但是，ERG 钾通道是否存在于肺泡单核-巨噬细胞，若存在表达，其功能如何？与肺泡巨噬细胞的分泌及吞噬功能有何相关，目前均不清楚。探讨肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达及功能，可为急性肺损伤机制的研究以及治疗提
10、供新的思路。 目的： 1.观察肺泡巨噬细胞上是否有 ERG 钾通道的表达。 2.初步探讨 ERG 钾通道与该细胞的分泌及吞噬功能是否相关。 方法： 1.大鼠肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达 以大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 为研究对象，人肺腺癌细胞系A549 为阴性对照，采用 RT-PCR 方法检测 NR8383 细胞 erg 钾通道 mRNA 的表达，RT-PCR 产物进行 cDNA 测序验证；免疫细胞化学方法和 Western blot 检测NR8383 细胞膜上 ERG 钾通道蛋白的表达。 2.LPS 刺激后大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383 细胞 erg mRNA 和蛋白的表达变化 将
11、培养 24h 的 NR8383 细胞系，加入 LPS1ug/ml 刺激(正常对照组细胞不加)，分别于 3h、6h、12h、24h 提取细胞总 RNA 和总蛋白采用 RT-PCR 法和 Western-blot 法检测 ERG 钾通道表达的变化。3.阻断 ERG 钾通道后大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的变化 将细胞分为正常对照组、4-AP 阻断组、TEA 阻断组、E-4031 阻断组。后三组先以相应浓度(分别为 ImM、mM、5M)作用于细胞，阻断钾通道，2h 后和正常对照组一起加入制备好的 5鸡红细胞，使鸡红细胞与大鼠肺泡巨噬细胞的比例大概为100:1，置于培养箱中孵育 th。之后用 4的多聚
12、甲醛固定，再行姬姆萨染色，油镜下观察 100 个 AM，计算吞噬率。吞噬率=已吞噬的巨噬细胞数/巨噬细胞总数100。放射免疫法检测阻断 ERG 钾通道后 LPS 刺激肺泡巨噬细胞分泌炎症因子 IL-6 的变化，将细胞分为 PBS 对照组、LPS 组、4-AP+LPS 组(非特异阻断组)、TEA+LPS 组(非特异阻断组)、E-4031(1M)+LPS 组(特异阻断组)、E-4031(5M)+LPS 组(特异阻断组)；每组设 6 个孔。阻断钾通道 2h 后与 LPS 组一起加 LPS1ug/ml 刺激 24h。24h 后收集上清，采用放射免疫法检测各组上清液中 IL-6 的分泌量。 结果： 1.
13、RT-PCR 及测序结果表明，检测到 480bp 左右的片段(与预期的一致)，表明 NR8383 细胞有 erg mRNA 表达，阴性对照 A549细胞未见 erg mRNA 表达。经 cDNA 测序进一步证实其序列与数据库中序列完全吻合。免疫细胞化学染色显示，大量棕黄色阳性颗粒分布在 NR8383 细胞膜上，表明 NR8383 细胞膜上有 ERG 钾通道蛋白表达，而阴性对照的 A549 细胞膜上未见棕黄色颗粒。Western blot 可以在 NR8383 细胞蛋白提取物中检测到 155kDa和 135kDa 两条特异的 ERG 蛋白条带，而阴性对照 A549 细胞未检测到相应条带。2.LP
14、S 刺激肺泡巨噬细胞后，ERG 钾通道 mRNA 水平和蛋白水平的表达变化 (1)半定量 RT-PCR 检测不同时间点 LPS 刺激后 erg mRNA 表达水平的改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，经 LPS 刺激后 6h 组 erg mRNA 表达明显增强，呈明显时间依赖性增加，至所观察的 24h 组达到最高，为对照组的 2 倍(Plt;0.05)。 (2)通过 Western blot 检测 LPS 刺激后不同时间 ERG 钾通道蛋白表达水平改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，LPS 刺激6h 后显著增强，至所观察的 24h 组达到最高，呈时间依赖
15、性增加，为对照组的2 倍(尸lt;0.05)。 3.ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响 大鼠肺泡巨噬细胞吞噬实验结果显示，与不加 ERG 钾通道阻断剂的对照组相比，加入特异性阻断剂 E4031 及非特异阻断剂 4AP 和 TEA 的吞噬率显著下降(Plt;0.01)，而特异阻断组和非特异阻断组之间的吞噬率无显著差异，提示 ERG 钾通道参与了 AM 细胞的吞噬功能。ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞炎症因子分泌功能的影响，先用特异阻断剂和非特异阻断剂阻断钾通道，再用LPS 刺激 AM 一定时间后收集上清检测 IL-6 的分泌功能，结果显示：与未加阻断剂的对照细胞相比，经特异性阻
16、断剂 E4031 阻断 ERG 钾通道后，AM 细胞分泌IL-6 的量显著下降(Plt;0.01)，但小剂量(1M)并无显著影响；而使用非特异性阻断剂 4-AP 和 TEA 阻断后，同样能够抑制 LPS 刺激的 IL-6 的分泌，而二者之间没有显著差异。以上结果提示：ERG 钾通道参与了 AM 细胞的分泌功能。 结论： 1.大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 存在 erg 钾通道 mRNA，蛋白表达定位于细胞膜；LPS 刺激 NR8383 细胞后，erg 钾通道 mRNA 和蛋白水平呈时间依赖性升高。 2.ERG 钾通道可能与 NR8383 细胞的吞噬与分泌功能有关，特异性及非特异性阻断剂可降低
17、 LPS 引起的 IL-6 分泌和细胞吞噬功能。ERG(ether-a-go-go-related gene)钾通道属于电压依赖性钾离子通道，在人心肌和脑组织中高表达。越来越多的报道发现该通道与多种病理过程相关，如心律失常、肿瘤等，因此成为近年研究的热点。新近的研究表明，骨髓来源的中枢系统单核-巨噬类细胞小胶质细胞上存在 ERG 钾通道。但是，ERG 钾通道是否存在于肺泡单核-巨噬细胞，若存在表达，其功能如何？与肺泡巨噬细胞的分泌及吞噬功能有何相关，目前均不清楚。探讨肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达及功能，可为急性肺损伤机制的研究以及治疗提供新的思路。 目的： 1.观察肺泡巨噬细胞上是否有
18、ERG 钾通道的表达。 2.初步探讨 ERG 钾通道与该细胞的分泌及吞噬功能是否相关。 方法： 1.大鼠肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达 以大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 为研究对象，人肺腺癌细胞系 A549 为阴性对照，采用 RT-PCR 方法检测 NR8383 细胞 erg 钾通道 mRNA 的表达，RT-PCR产物进行 cDNA 测序验证；免疫细胞化学方法和 Western blot 检测 NR8383 细胞膜上 ERG 钾通道蛋白的表达。 2.LPS 刺激后大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 细胞 erg mRNA 和蛋白的表达变化 将培养 24h 的 NR8383 细胞系，加入LP
19、S1ug/ml 刺激(正常对照组细胞不加)，分别于 3h、6h、12h、24h 提取细胞总RNA 和总蛋白采用 RT-PCR 法和 Western-blot 法检测 ERG 钾通道表达的变化。 3.阻断 ERG 钾通道后大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的变化 将细胞分为正常对照组、4-AP 阻断组、TEA 阻断组、E-4031 阻断组。后三组先以相应浓度(分别为 ImM、mM、5M)作用于细胞，阻断钾通道，2h 后和正常对照组一起加入制备好的 5鸡红细胞，使鸡红细胞与大鼠肺泡巨噬细胞的比例大概为100:1，置于培养箱中孵育 th。之后用 4的多聚甲醛固定，再行姬姆萨染色，油镜下观察 100 个
20、AM，计算吞噬率。吞噬率=已吞噬的巨噬细胞数/巨噬细胞总数100。放射免疫法检测阻断 ERG 钾通道后 LPS 刺激肺泡巨噬细胞分泌炎症因子 IL-6 的变化，将细胞分为 PBS 对照组、LPS 组、4-AP+LPS 组(非特异阻断组)、TEA+LPS 组(非特异阻断组)、E-4031(1M)+LPS 组(特异阻断组)、E-4031(5M)+LPS 组(特异阻断组)；每组设 6 个孔。阻断钾通道 2h 后与 LPS 组一起加 LPS1ug/ml 刺激 24h。24h 后收集上清，采用放射免疫法检测各组上清液中 IL-6 的分泌量。 结果： 1.RT-PCR 及测序结果表明，检测到 480bp
21、左右的片段(与预期的一致)，表明 NR8383 细胞有 erg mRNA 表达，阴性对照 A549细胞未见 erg mRNA 表达。经 cDNA 测序进一步证实其序列与数据库中序列完全吻合。免疫细胞化学染色显示，大量棕黄色阳性颗粒分布在 NR8383 细胞膜上，表明 NR8383 细胞膜上有 ERG 钾通道蛋白表达，而阴性对照的 A549 细胞膜上未见棕黄色颗粒。Western blot 可以在 NR8383 细胞蛋白提取物中检测到 155kDa和 135kDa 两条特异的 ERG 蛋白条带，而阴性对照 A549 细胞未检测到相应条带。2.LPS 刺激肺泡巨噬细胞后，ERG 钾通道 mRNA
22、水平和蛋白水平的表达变化 (1)半定量 RT-PCR 检测不同时间点 LPS 刺激后 erg mRNA 表达水平的改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，经 LPS 刺激后 6h 组 erg mRNA 表达明显增强，呈明显时间依赖性增加，至所观察的 24h 组达到最高，为对照组的 2 倍(Plt;0.05)。 (2)通过 Western blot 检测 LPS 刺激后不同时间 ERG 钾通道蛋白表达水平改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，LPS 刺激6h 后显著增强，至所观察的 24h 组达到最高，呈时间依赖性增加，为对照组的2 倍(尸lt;0.05)。 3
23、.ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响 大鼠肺泡巨噬细胞吞噬实验结果显示，与不加 ERG 钾通道阻断剂的对照组相比，加入特异性阻断剂 E4031 及非特异阻断剂 4AP 和 TEA 的吞噬率显著下降(Plt;0.01)，而特异阻断组和非特异阻断组之间的吞噬率无显著差异，提示 ERG 钾通道参与了 AM 细胞的吞噬功能。ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞炎症因子分泌功能的影响，先用特异阻断剂和非特异阻断剂阻断钾通道，再用LPS 刺激 AM 一定时间后收集上清检测 IL-6 的分泌功能，结果显示：与未加阻断剂的对照细胞相比，经特异性阻断剂 E4031 阻断 ERG 钾通道后，AM 细
24、胞分泌IL-6 的量显著下降(Plt;0.01)，但小剂量(1M)并无显著影响；而使用非特异性阻断剂 4-AP 和 TEA 阻断后，同样能够抑制 LPS 刺激的 IL-6 的分泌，而二者之间没有显著差异。以上结果提示：ERG 钾通道参与了 AM 细胞的分泌功能。 结论： 1.大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 存在 erg 钾通道 mRNA，蛋白表达定位于细胞膜；LPS 刺激 NR8383 细胞后，erg 钾通道 mRNA 和蛋白水平呈时间依赖性升高。 2.ERG 钾通道可能与 NR8383 细胞的吞噬与分泌功能有关，特异性及非特异性阻断剂可降低 LPS 引起的 IL-6 分泌和细胞吞噬功能。E
25、RG(ether-a-go-go-related gene)钾通道属于电压依赖性钾离子通道，在人心肌和脑组织中高表达。越来越多的报道发现该通道与多种病理过程相关，如心律失常、肿瘤等，因此成为近年研究的热点。新近的研究表明，骨髓来源的中枢系统单核-巨噬类细胞小胶质细胞上存在 ERG 钾通道。但是，ERG 钾通道是否存在于肺泡单核-巨噬细胞，若存在表达，其功能如何？与肺泡巨噬细胞的分泌及吞噬功能有何相关，目前均不清楚。探讨肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达及功能，可为急性肺损伤机制的研究以及治疗提供新的思路。 目的： 1.观察肺泡巨噬细胞上是否有 ERG 钾通道的表达。 2.初步探讨 ERG 钾通
26、道与该细胞的分泌及吞噬功能是否相关。 方法： 1.大鼠肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达 以大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 为研究对象，人肺腺癌细胞系 A549 为阴性对照，采用 RT-PCR 方法检测 NR8383 细胞 erg 钾通道 mRNA 的表达，RT-PCR产物进行 cDNA 测序验证；免疫细胞化学方法和 Western blot 检测 NR8383 细胞膜上 ERG 钾通道蛋白的表达。 2.LPS 刺激后大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 细胞 erg mRNA 和蛋白的表达变化 将培养 24h 的 NR8383 细胞系，加入LPS1ug/ml 刺激(正常对照组细胞不加)，分别于
27、 3h、6h、12h、24h 提取细胞总RNA 和总蛋白采用 RT-PCR 法和 Western-blot 法检测 ERG 钾通道表达的变化。 3.阻断 ERG 钾通道后大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的变化 将细胞分为正常对照组、4-AP 阻断组、TEA 阻断组、E-4031 阻断组。后三组先以相应浓度(分别为 ImM、mM、5M)作用于细胞，阻断钾通道，2h 后和正常对照组一起加入制备好的 5鸡红细胞，使鸡红细胞与大鼠肺泡巨噬细胞的比例大概为100:1，置于培养箱中孵育 th。之后用 4的多聚甲醛固定，再行姬姆萨染色，油镜下观察 100 个 AM，计算吞噬率。吞噬率=已吞噬的巨噬细胞数/巨噬
28、细胞总数100。放射免疫法检测阻断 ERG 钾通道后 LPS 刺激肺泡巨噬细胞分泌炎症因子 IL-6 的变化，将细胞分为 PBS 对照组、LPS 组、4-AP+LPS 组(非特异阻断组)、TEA+LPS 组(非特异阻断组)、E-4031(1M)+LPS 组(特异阻断组)、E-4031(5M)+LPS 组(特异阻断组)；每组设 6 个孔。阻断钾通道 2h 后与 LPS 组一起加 LPS1ug/ml 刺激 24h。24h 后收集上清，采用放射免疫法检测各组上清液中 IL-6 的分泌量。 结果： 1.RT-PCR 及测序结果表明，检测到 480bp 左右的片段(与预期的一致)，表明 NR8383 细
29、胞有 erg mRNA 表达，阴性对照 A549细胞未见 erg mRNA 表达。经 cDNA 测序进一步证实其序列与数据库中序列完全吻合。免疫细胞化学染色显示，大量棕黄色阳性颗粒分布在 NR8383 细胞膜上，表明 NR8383 细胞膜上有 ERG 钾通道蛋白表达，而阴性对照的 A549 细胞膜上未见棕黄色颗粒。Western blot 可以在 NR8383 细胞蛋白提取物中检测到 155kDa和 135kDa 两条特异的 ERG 蛋白条带，而阴性对照 A549 细胞未检测到相应条带。2.LPS 刺激肺泡巨噬细胞后，ERG 钾通道 mRNA 水平和蛋白水平的表达变化 (1)半定量 RT-PC
30、R 检测不同时间点 LPS 刺激后 erg mRNA 表达水平的改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，经 LPS 刺激后 6h 组 erg mRNA 表达明显增强，呈明显时间依赖性增加，至所观察的 24h 组达到最高，为对照组的 2 倍(Plt;0.05)。 (2)通过 Western blot 检测 LPS 刺激后不同时间 ERG 钾通道蛋白表达水平改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，LPS 刺激6h 后显著增强，至所观察的 24h 组达到最高，呈时间依赖性增加，为对照组的2 倍(尸lt;0.05)。 3.ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的
31、影响 大鼠肺泡巨噬细胞吞噬实验结果显示，与不加 ERG 钾通道阻断剂的对照组相比，加入特异性阻断剂 E4031 及非特异阻断剂 4AP 和 TEA 的吞噬率显著下降(Plt;0.01)，而特异阻断组和非特异阻断组之间的吞噬率无显著差异，提示 ERG 钾通道参与了 AM 细胞的吞噬功能。ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞炎症因子分泌功能的影响，先用特异阻断剂和非特异阻断剂阻断钾通道，再用LPS 刺激 AM 一定时间后收集上清检测 IL-6 的分泌功能，结果显示：与未加阻断剂的对照细胞相比，经特异性阻断剂 E4031 阻断 ERG 钾通道后，AM 细胞分泌IL-6 的量显著下降(Plt;0.01)，
32、但小剂量(1M)并无显著影响；而使用非特异性阻断剂 4-AP 和 TEA 阻断后，同样能够抑制 LPS 刺激的 IL-6 的分泌，而二者之间没有显著差异。以上结果提示：ERG 钾通道参与了 AM 细胞的分泌功能。 结论： 1.大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 存在 erg 钾通道 mRNA，蛋白表达定位于细胞膜；LPS 刺激 NR8383 细胞后，erg 钾通道 mRNA 和蛋白水平呈时间依赖性升高。 2.ERG 钾通道可能与 NR8383 细胞的吞噬与分泌功能有关，特异性及非特异性阻断剂可降低 LPS 引起的 IL-6 分泌和细胞吞噬功能。ERG(ether-a-go-go-related
33、gene)钾通道属于电压依赖性钾离子通道，在人心肌和脑组织中高表达。越来越多的报道发现该通道与多种病理过程相关，如心律失常、肿瘤等，因此成为近年研究的热点。新近的研究表明，骨髓来源的中枢系统单核-巨噬类细胞小胶质细胞上存在 ERG 钾通道。但是，ERG 钾通道是否存在于肺泡单核-巨噬细胞，若存在表达，其功能如何？与肺泡巨噬细胞的分泌及吞噬功能有何相关，目前均不清楚。探讨肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达及功能，可为急性肺损伤机制的研究以及治疗提供新的思路。 目的： 1.观察肺泡巨噬细胞上是否有 ERG 钾通道的表达。 2.初步探讨 ERG 钾通道与该细胞的分泌及吞噬功能是否相关。 方法： 1.
34、大鼠肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达 以大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 为研究对象，人肺腺癌细胞系 A549 为阴性对照，采用 RT-PCR 方法检测 NR8383 细胞 erg 钾通道 mRNA 的表达，RT-PCR产物进行 cDNA 测序验证；免疫细胞化学方法和 Western blot 检测 NR8383 细胞膜上 ERG 钾通道蛋白的表达。 2.LPS 刺激后大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 细胞 erg mRNA 和蛋白的表达变化 将培养 24h 的 NR8383 细胞系，加入LPS1ug/ml 刺激(正常对照组细胞不加)，分别于 3h、6h、12h、24h 提取细胞总RNA 和
35、总蛋白采用 RT-PCR 法和 Western-blot 法检测 ERG 钾通道表达的变化。 3.阻断 ERG 钾通道后大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的变化 将细胞分为正常对照组、4-AP 阻断组、TEA 阻断组、E-4031 阻断组。后三组先以相应浓度(分别为 ImM、mM、5M)作用于细胞，阻断钾通道，2h 后和正常对照组一起加入制备好的 5鸡红细胞，使鸡红细胞与大鼠肺泡巨噬细胞的比例大概为100:1，置于培养箱中孵育 th。之后用 4的多聚甲醛固定，再行姬姆萨染色，油镜下观察 100 个 AM，计算吞噬率。吞噬率=已吞噬的巨噬细胞数/巨噬细胞总数100。放射免疫法检测阻断 ERG 钾通道
36、后 LPS 刺激肺泡巨噬细胞分泌炎症因子 IL-6 的变化，将细胞分为 PBS 对照组、LPS 组、4-AP+LPS 组(非特异阻断组)、TEA+LPS 组(非特异阻断组)、E-4031(1M)+LPS 组(特异阻断组)、E-4031(5M)+LPS 组(特异阻断组)；每组设 6 个孔。阻断钾通道 2h 后与 LPS 组一起加 LPS1ug/ml 刺激 24h。24h 后收集上清，采用放射免疫法检测各组上清液中 IL-6 的分泌量。 结果： 1.RT-PCR 及测序结果表明，检测到 480bp 左右的片段(与预期的一致)，表明 NR8383 细胞有 erg mRNA 表达，阴性对照 A549细
37、胞未见 erg mRNA 表达。经 cDNA 测序进一步证实其序列与数据库中序列完全吻合。免疫细胞化学染色显示，大量棕黄色阳性颗粒分布在 NR8383 细胞膜上，表明 NR8383 细胞膜上有 ERG 钾通道蛋白表达，而阴性对照的 A549 细胞膜上未见棕黄色颗粒。Western blot 可以在 NR8383 细胞蛋白提取物中检测到 155kDa和 135kDa 两条特异的 ERG 蛋白条带，而阴性对照 A549 细胞未检测到相应条带。2.LPS 刺激肺泡巨噬细胞后，ERG 钾通道 mRNA 水平和蛋白水平的表达变化 (1)半定量 RT-PCR 检测不同时间点 LPS 刺激后 erg mRN
38、A 表达水平的改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，经 LPS 刺激后 6h 组 erg mRNA 表达明显增强，呈明显时间依赖性增加，至所观察的 24h 组达到最高，为对照组的 2 倍(Plt;0.05)。 (2)通过 Western blot 检测 LPS 刺激后不同时间 ERG 钾通道蛋白表达水平改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，LPS 刺激6h 后显著增强，至所观察的 24h 组达到最高，呈时间依赖性增加，为对照组的2 倍(尸lt;0.05)。 3.ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响 大鼠肺泡巨噬细胞吞噬实验结果显示，与不加 E
39、RG 钾通道阻断剂的对照组相比，加入特异性阻断剂 E4031 及非特异阻断剂 4AP 和 TEA 的吞噬率显著下降(Plt;0.01)，而特异阻断组和非特异阻断组之间的吞噬率无显著差异，提示 ERG 钾通道参与了 AM 细胞的吞噬功能。ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞炎症因子分泌功能的影响，先用特异阻断剂和非特异阻断剂阻断钾通道，再用LPS 刺激 AM 一定时间后收集上清检测 IL-6 的分泌功能，结果显示：与未加阻断剂的对照细胞相比，经特异性阻断剂 E4031 阻断 ERG 钾通道后，AM 细胞分泌IL-6 的量显著下降(Plt;0.01)，但小剂量(1M)并无显著影响；而使用非特异性阻断剂
40、 4-AP 和 TEA 阻断后，同样能够抑制 LPS 刺激的 IL-6 的分泌，而二者之间没有显著差异。以上结果提示：ERG 钾通道参与了 AM 细胞的分泌功能。 结论： 1.大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 存在 erg 钾通道 mRNA，蛋白表达定位于细胞膜；LPS 刺激 NR8383 细胞后，erg 钾通道 mRNA 和蛋白水平呈时间依赖性升高。 2.ERG 钾通道可能与 NR8383 细胞的吞噬与分泌功能有关，特异性及非特异性阻断剂可降低 LPS 引起的 IL-6 分泌和细胞吞噬功能。ERG(ether-a-go-go-related gene)钾通道属于电压依赖性钾离子通道，在人心肌
41、和脑组织中高表达。越来越多的报道发现该通道与多种病理过程相关，如心律失常、肿瘤等，因此成为近年研究的热点。新近的研究表明，骨髓来源的中枢系统单核-巨噬类细胞小胶质细胞上存在 ERG 钾通道。但是，ERG 钾通道是否存在于肺泡单核-巨噬细胞，若存在表达，其功能如何？与肺泡巨噬细胞的分泌及吞噬功能有何相关，目前均不清楚。探讨肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达及功能，可为急性肺损伤机制的研究以及治疗提供新的思路。 目的： 1.观察肺泡巨噬细胞上是否有 ERG 钾通道的表达。 2.初步探讨 ERG 钾通道与该细胞的分泌及吞噬功能是否相关。 方法： 1.大鼠肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达 以大鼠肺泡
42、巨噬细胞系 NR8383 为研究对象，人肺腺癌细胞系 A549 为阴性对照，采用 RT-PCR 方法检测 NR8383 细胞 erg 钾通道 mRNA 的表达，RT-PCR产物进行 cDNA 测序验证；免疫细胞化学方法和 Western blot 检测 NR8383 细胞膜上 ERG 钾通道蛋白的表达。 2.LPS 刺激后大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 细胞 erg mRNA 和蛋白的表达变化 将培养 24h 的 NR8383 细胞系，加入LPS1ug/ml 刺激(正常对照组细胞不加)，分别于 3h、6h、12h、24h 提取细胞总RNA 和总蛋白采用 RT-PCR 法和 Western-b
43、lot 法检测 ERG 钾通道表达的变化。 3.阻断 ERG 钾通道后大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的变化 将细胞分为正常对照组、4-AP 阻断组、TEA 阻断组、E-4031 阻断组。后三组先以相应浓度(分别为 ImM、mM、5M)作用于细胞，阻断钾通道，2h 后和正常对照组一起加入制备好的 5鸡红细胞，使鸡红细胞与大鼠肺泡巨噬细胞的比例大概为100:1，置于培养箱中孵育 th。之后用 4的多聚甲醛固定，再行姬姆萨染色，油镜下观察 100 个 AM，计算吞噬率。吞噬率=已吞噬的巨噬细胞数/巨噬细胞总数100。放射免疫法检测阻断 ERG 钾通道后 LPS 刺激肺泡巨噬细胞分泌炎症因子 IL-6
44、 的变化，将细胞分为 PBS 对照组、LPS 组、4-AP+LPS 组(非特异阻断组)、TEA+LPS 组(非特异阻断组)、E-4031(1M)+LPS 组(特异阻断组)、E-4031(5M)+LPS 组(特异阻断组)；每组设 6 个孔。阻断钾通道 2h 后与 LPS 组一起加 LPS1ug/ml 刺激 24h。24h 后收集上清，采用放射免疫法检测各组上清液中 IL-6 的分泌量。 结果： 1.RT-PCR 及测序结果表明，检测到 480bp 左右的片段(与预期的一致)，表明 NR8383 细胞有 erg mRNA 表达，阴性对照 A549细胞未见 erg mRNA 表达。经 cDNA 测序
45、进一步证实其序列与数据库中序列完全吻合。免疫细胞化学染色显示，大量棕黄色阳性颗粒分布在 NR8383 细胞膜上，表明 NR8383 细胞膜上有 ERG 钾通道蛋白表达，而阴性对照的 A549 细胞膜上未见棕黄色颗粒。Western blot 可以在 NR8383 细胞蛋白提取物中检测到 155kDa和 135kDa 两条特异的 ERG 蛋白条带，而阴性对照 A549 细胞未检测到相应条带。2.LPS 刺激肺泡巨噬细胞后，ERG 钾通道 mRNA 水平和蛋白水平的表达变化 (1)半定量 RT-PCR 检测不同时间点 LPS 刺激后 erg mRNA 表达水平的改变，结果显示：与未经 LPS 刺激
46、的 AM 细胞相比，经 LPS 刺激后 6h 组 erg mRNA 表达明显增强，呈明显时间依赖性增加，至所观察的 24h 组达到最高，为对照组的 2 倍(Plt;0.05)。 (2)通过 Western blot 检测 LPS 刺激后不同时间 ERG 钾通道蛋白表达水平改变，结果显示：与未经 LPS 刺激的 AM 细胞相比，LPS 刺激6h 后显著增强，至所观察的 24h 组达到最高，呈时间依赖性增加，为对照组的2 倍(尸lt;0.05)。 3.ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响 大鼠肺泡巨噬细胞吞噬实验结果显示，与不加 ERG 钾通道阻断剂的对照组相比，加入特异性阻断剂
47、E4031 及非特异阻断剂 4AP 和 TEA 的吞噬率显著下降(Plt;0.01)，而特异阻断组和非特异阻断组之间的吞噬率无显著差异，提示 ERG 钾通道参与了 AM 细胞的吞噬功能。ERG 钾通道对大鼠肺泡巨噬细胞炎症因子分泌功能的影响，先用特异阻断剂和非特异阻断剂阻断钾通道，再用LPS 刺激 AM 一定时间后收集上清检测 IL-6 的分泌功能，结果显示：与未加阻断剂的对照细胞相比，经特异性阻断剂 E4031 阻断 ERG 钾通道后，AM 细胞分泌IL-6 的量显著下降(Plt;0.01)，但小剂量(1M)并无显著影响；而使用非特异性阻断剂 4-AP 和 TEA 阻断后，同样能够抑制 LP
48、S 刺激的 IL-6 的分泌，而二者之间没有显著差异。以上结果提示：ERG 钾通道参与了 AM 细胞的分泌功能。 结论： 1.大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 存在 erg 钾通道 mRNA，蛋白表达定位于细胞膜；LPS 刺激 NR8383 细胞后，erg 钾通道 mRNA 和蛋白水平呈时间依赖性升高。 2.ERG 钾通道可能与 NR8383 细胞的吞噬与分泌功能有关，特异性及非特异性阻断剂可降低 LPS 引起的 IL-6 分泌和细胞吞噬功能。ERG(ether-a-go-go-related gene)钾通道属于电压依赖性钾离子通道，在人心肌和脑组织中高表达。越来越多的报道发现该通道与多种病
49、理过程相关，如心律失常、肿瘤等，因此成为近年研究的热点。新近的研究表明，骨髓来源的中枢系统单核-巨噬类细胞小胶质细胞上存在 ERG 钾通道。但是，ERG 钾通道是否存在于肺泡单核-巨噬细胞，若存在表达，其功能如何？与肺泡巨噬细胞的分泌及吞噬功能有何相关，目前均不清楚。探讨肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达及功能，可为急性肺损伤机制的研究以及治疗提供新的思路。 目的： 1.观察肺泡巨噬细胞上是否有 ERG 钾通道的表达。 2.初步探讨 ERG 钾通道与该细胞的分泌及吞噬功能是否相关。 方法： 1.大鼠肺泡巨噬细胞 ERG 钾通道的表达 以大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383 为研究对象，人肺腺癌细胞系 A549 为阴性对照，采用 RT-PCR 方法检测 NR8383 细胞 erg 钾通道 mRNA 的表达，RT-PCR产物进行 cDNA 测序验证；免疫细胞化学方法和 Western blot 检测 NR8383 细胞膜上 ERG 钾通
