1、骨外科学专业优秀论文 可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究关键词：骨缺损修复 丝素蛋白/羟基磷灰石 骨替代材料 人工骨材料摘要：本研究分为五部分： 第一部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其在 SD 大鼠体内降解的实验观察 目的：制备丝素蛋白/羟基磷灰石（silk fibroin/hydroxyapatite，SF/HA）复合人工骨材料，并将该材料植入生物体内降解，以了解 SF/HA 在动物体内的降解速率及机体对 SF/HA 的组织学反应，为后续成骨实验提供可靠的参考数据。 方法：以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板，以家蚕丝素短纤维为增强材料，以 NaC
2、l 为致孔剂，采用等静压的方法制备 4 种 SF/HA 复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组，测定 4 种 SF/HA 复合材料及羟基磷灰石在 0.5h、2h、6h、12h 及 24h 不同时间点的吸水率。将 4 种 SF/HA 复合材料及羟基磷灰石植入 SD 大鼠背部皮下，进行体内降解观察。实验组分别于术后 2、6、12、16、20 及 24 周取材，对照组分别于术后 2、12 及 24 周取材，进行大体观察及组织学检查。 结果：丝素蛋白、HA、添加剂及致孔剂配比不同，制备的 4 种 SF/HA 人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下：SF/HA3、SF/HA4gt;SF/
3、HA2、SF/HA1gt;HA。HA、SF/HA1 及 SF/HA2降解十分缓慢或基本不能降解；SF/HA32024 周降解完毕；SF/HA41216 周降解完毕；各种材料周围组织未见明显变性坏死等。 结论：SF/HA1 平均孔径为 6.5m，最大孔径也只有 15m，不适合骨组织工程支架材料的要求。SF/HA4 虽然孔径、孔隙率满足要求，但力学强度较低，压缩强度只有1.59MPa，在水中很快散开，也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中，我们剔除这两种材料，将对 SF/HA3 及 SF/HA2 两种材料进行体外细胞相容性研究。 第二部分、免骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究 目
4、的：体外分离培养兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs） ，并向成骨方向诱导培养，为 SF/HA 相容性提供检测细胞及为 SF/HA 组织工程化骨提供适宜的种子细胞。 方法：抽取新西兰白兔的骨髓 5ml，通过密度梯度离心法获取 BMSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第 2 代细胞用含 1108g/l地塞米松、10mmol/l甘油磷酸钠及 50g/lL抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化；采用 MTT法测定细胞增殖情况；使用碱性磷酸酶染色及 Von
5、 Kossa 钙结节染色等方法，鉴定其成骨性能。 结果：BMSCs 在培养皿中贴壁生长、增殖，条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性，细胞增殖良好，体外矿化结节 Von Kossa 染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性，证实其有成骨潜能。 结论：可以通过体外分离纯化兔 BMSCs，在一定条件下能够向成骨方向诱导分化，并能使细胞保持较高的成骨活性，适于作为材料相容性的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。 第三部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究 目的：以成骨诱导的 BMSCs 作为检测细胞，与两种丝素蛋白/羟基磷灰石（SF/HA）进行体外复合培养，检测 SF/HA 的细胞
6、相容性。 方法：将兔 BMSCs 体外成骨诱导至第 3 代，接种到预湿的 SF/HA2 及 SF/HA3 材料上复合培养，以单纯 BMSCs 相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及 HE 染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以 MTT 法检测材料对细胞增殖活性的影响，以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力，以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否有细胞毒性。 结果：扫描电镜及组织学观察发现，细胞材料复合后，BMSCs 在 SF/HA2 及 SF/HA3 上能够良好地粘附和增殖。ALP 活性测定及 MTT 法测定 OD 值均证实，BMSCs 细胞活性及成骨性能不受材料影响，与对照组相比，
7、差异无统计学意义（Pgt;0.05） 。材料浸提液细胞毒性试验显示，细胞毒性分级均为 0级，两种 SF/HA 浸提液对细胞生长基本无毒性作用。 结论：SF/HA2 与 SF/HA3 对 BMSCs 的生长和成骨功能无影响，具有良好的细胞相容性，具有构建组织工程化骨的可行性。 第四部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石异位成骨及其组织相容性的实验研究 目的：探讨 SF/HA2 及 SF/HA3 体内异位成骨的能力，并通过肌肉植入实验进一步观察两种材料的组织相容性，为 SF/HA 修复节段性骨缺损提供实验依据。 方法：将体外诱导培养的兔骨髓基质细胞，以 5107/ml 的密度接种到 SF/HA2，
8、作为实验组 1；接种到 SF/HA3，作为实验组 2，并于 35d 后植入兔背部肌肉中。植入单纯 SF/HA2 与 SF/HA3，作为对照组。对照组亦作为材料的肌肉植入实验模型，观察组织相容性。于术后第 4、8、12 周，每次随机选取 5 只兔处死后取材，大体观察及 HE 染色组织学观察，并进行骨组织形态计量学分析，定量比较各组新骨形成情况。 结果：实验组术后 4、8、12 周均有新骨形成，随着时间延长，新骨生成量增多；骨组织形态计量学分析显示，实验组 1 优于实验组 2（Plt;0.05） ；对照组则均无新骨形成。肌肉植入实验未见肌肉变性坏死等。 结论：肌肉植入实验、第一部分的皮下植入实验及
9、第三部分的细胞相容性研究均显示，两种 SF/HA 具有良好的组织相容性。SF/HA3 与 SF/HA2复合细胞后构建的组织工程化骨，具有良好的异位成骨能力，可望应用于临床修复骨缺损。但从生物降解性及异位成骨的效果看，SF/HA3 更适合于作为人工骨材料，将进一步研究该材料修复节段性骨缺损的能力。 第五部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复节段性骨缺损的实验研究 目的：探索 SF/HA3 组织工程化骨的成骨作用及作为骨替代材料的可行性，期望为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料。 方法：在本实验中将 SF/HA3 更名为 SF/HA，与诱导的兔 BMSCs 复合，构建组织工程化骨。麻
10、醉生效后，充分显露兔左侧桡骨中上段，造成 15mm 节段骨缺损。实验组植入 SF/HA+BMSCs 复合物，实验对照组植入 SF/HA 材料，空白对照组骨缺损区不植入任何材料。 于术后第 4、8、12 及 16 周行 X 线摄片及 16 周时行螺旋 CT 扫描重建，观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照 LaneSandhu X 线评分标准对各组桡骨缺损的骨修复程度评分。标本行 HE 染色及 Masson 染色组织学观察，按照 LaneSandhu 组织学评分法比较 12 周及 16 周时各组动物的骨修复情况。 结果：实验组、实验对照组及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示，新骨生成有统计学差异（
11、Plt;0.05） ，实验组优于实验对照组优于空白对照组；大体观察及放射学检查证实：实验组兔桡骨缺损完全愈合；实验组对照组缺损处少部分骨愈合；空白对照组缺损基本无骨修复作用，由纤维组织充填。 结论：SF/HA 与 BMSCs 复合，降解速率适宜，能较快被骨组织取代，具有相当于自体骨的骨缺损修复能力，基本达到现代骨组织工程学的要求。但材料本身缺乏骨诱导作用，单独用于节段性骨缺损修复作用有限。正文内容本研究分为五部分： 第一部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其在 SD 大鼠体内降解的实验观察 目的：制备丝素蛋白/羟基磷灰石（silk fibroin/hydroxyapatite，SF/
12、HA）复合人工骨材料，并将该材料植入生物体内降解，以了解 SF/HA 在动物体内的降解速率及机体对 SF/HA 的组织学反应，为后续成骨实验提供可靠的参考数据。 方法：以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板，以家蚕丝素短纤维为增强材料，以 NaCl 为致孔剂，采用等静压的方法制备 4 种 SF/HA 复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组，测定4 种 SF/HA 复合材料及羟基磷灰石在 0.5h、2h、6h、12h 及 24h 不同时间点的吸水率。将 4 种 SF/HA 复合材料及羟基磷灰石植入 SD 大鼠背部皮下，进行体内降解观察。实验组分别于术后 2、6、12、16、20 及 24 周取材，对
13、照组分别于术后 2、12 及 24 周取材，进行大体观察及组织学检查。 结果：丝素蛋白、HA、添加剂及致孔剂配比不同，制备的 4 种 SF/HA 人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下：SF/HA3、SF/HA4gt;SF/HA2、SF/HA1gt;HA。HA、SF/HA1 及 SF/HA2降解十分缓慢或基本不能降解；SF/HA32024 周降解完毕；SF/HA41216 周降解完毕；各种材料周围组织未见明显变性坏死等。 结论：SF/HA1 平均孔径为 6.5m，最大孔径也只有 15m，不适合骨组织工程支架材料的要求。SF/HA4 虽然孔径、孔隙率满足要求，但力学强度较低，
14、压缩强度只有1.59MPa，在水中很快散开，也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中，我们剔除这两种材料，将对 SF/HA3 及 SF/HA2 两种材料进行体外细胞相容性研究。 第二部分、免骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究 目的：体外分离培养兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs） ，并向成骨方向诱导培养，为 SF/HA 相容性提供检测细胞及为 SF/HA 组织工程化骨提供适宜的种子细胞。 方法：抽取新西兰白兔的骨髓 5ml，通过密度梯度离心法获取 BMSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，
15、描绘生长曲线。第 2 代细胞用含 1108g/l地塞米松、10mmol/l甘油磷酸钠及 50g/lL抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化；采用 MTT法测定细胞增殖情况；使用碱性磷酸酶染色及 Von Kossa 钙结节染色等方法，鉴定其成骨性能。 结果：BMSCs 在培养皿中贴壁生长、增殖，条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性，细胞增殖良好，体外矿化结节 Von Kossa 染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性，证实其有成骨潜能。 结论：可以通过体外分离纯化兔 BMSCs，在一定条件下能够向成骨方向诱导分化，并能使细胞保持较高的成骨活性，适于作为材料相容性
16、的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。 第三部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究 目的：以成骨诱导的 BMSCs 作为检测细胞，与两种丝素蛋白/羟基磷灰石（SF/HA）进行体外复合培养，检测 SF/HA 的细胞相容性。 方法：将兔 BMSCs 体外成骨诱导至第 3 代，接种到预湿的 SF/HA2 及 SF/HA3 材料上复合培养，以单纯 BMSCs 相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及 HE 染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以 MTT 法检测材料对细胞增殖活性的影响，以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力，以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否
17、有细胞毒性。 结果：扫描电镜及组织学观察发现，细胞材料复合后，BMSCs 在 SF/HA2 及 SF/HA3 上能够良好地粘附和增殖。ALP 活性测定及 MTT 法测定 OD 值均证实，BMSCs 细胞活性及成骨性能不受材料影响，与对照组相比，差异无统计学意义（Pgt;0.05） 。材料浸提液细胞毒性试验显示，细胞毒性分级均为 0级，两种 SF/HA 浸提液对细胞生长基本无毒性作用。 结论：SF/HA2 与 SF/HA3 对 BMSCs 的生长和成骨功能无影响，具有良好的细胞相容性，具有构建组织工程化骨的可行性。 第四部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石异位成骨及其组织相容性的实验研究 目的
18、：探讨 SF/HA2 及 SF/HA3 体内异位成骨的能力，并通过肌肉植入实验进一步观察两种材料的组织相容性，为 SF/HA 修复节段性骨缺损提供实验依据。 方法：将体外诱导培养的兔骨髓基质细胞，以 5107/ml 的密度接种到 SF/HA2，作为实验组 1；接种到 SF/HA3，作为实验组 2，并于 35d 后植入兔背部肌肉中。植入单纯 SF/HA2 与 SF/HA3，作为对照组。对照组亦作为材料的肌肉植入实验模型，观察组织相容性。于术后第 4、8、12 周，每次随机选取 5 只兔处死后取材，大体观察及 HE 染色组织学观察，并进行骨组织形态计量学分析，定量比较各组新骨形成情况。 结果：实验
19、组术后 4、8、12 周均有新骨形成，随着时间延长，新骨生成量增多；骨组织形态计量学分析显示，实验组 1 优于实验组 2（Plt;0.05） ；对照组则均无新骨形成。肌肉植入实验未见肌肉变性坏死等。 结论：肌肉植入实验、第一部分的皮下植入实验及第三部分的细胞相容性研究均显示，两种 SF/HA 具有良好的组织相容性。SF/HA3 与 SF/HA2复合细胞后构建的组织工程化骨，具有良好的异位成骨能力，可望应用于临床修复骨缺损。但从生物降解性及异位成骨的效果看，SF/HA3 更适合于作为人工骨材料，将进一步研究该材料修复节段性骨缺损的能力。 第五部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复
20、节段性骨缺损的实验研究 目的：探索 SF/HA3 组织工程化骨的成骨作用及作为骨替代材料的可行性，期望为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料。 方法：在本实验中将 SF/HA3 更名为 SF/HA，与诱导的兔 BMSCs 复合，构建组织工程化骨。麻醉生效后，充分显露兔左侧桡骨中上段，造成 15mm 节段骨缺损。实验组植入 SF/HA+BMSCs 复合物，实验对照组植入 SF/HA 材料，空白对照组骨缺损区不植入任何材料。 于术后第 4、8、12 及 16 周行 X 线摄片及 16 周时行螺旋 CT 扫描重建，观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照 LaneSandhu X 线评分标准对各组桡骨缺损的骨修
21、复程度评分。标本行 HE 染色及 Masson 染色组织学观察，按照 LaneSandhu 组织学评分法比较 12 周及 16 周时各组动物的骨修复情况。 结果：实验组、实验对照组及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示，新骨生成有统计学差异（Plt;0.05） ，实验组优于实验对照组优于空白对照组；大体观察及放射学检查证实：实验组兔桡骨缺损完全愈合；实验组对照组缺损处少部分骨愈合；空白对照组缺损基本无骨修复作用，由纤维组织充填。 结论：SF/HA 与 BMSCs 复合，降解速率适宜，能较快被骨组织取代，具有相当于自体骨的骨缺损修复能力，基本达到现代骨组织工程学的要求。但材料本身缺乏骨诱导作用
22、，单独用于节段性骨缺损修复作用有限。本研究分为五部分： 第一部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其在 SD 大鼠体内降解的实验观察 目的：制备丝素蛋白/羟基磷灰石（silk fibroin/hydroxyapatite，SF/HA）复合人工骨材料，并将该材料植入生物体内降解，以了解 SF/HA 在动物体内的降解速率及机体对 SF/HA 的组织学反应，为后续成骨实验提供可靠的参考数据。 方法：以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板，以家蚕丝素短纤维为增强材料，以 NaCl 为致孔剂，采用等静压的方法制备 4 种 SF/HA 复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组，测定4 种 SF/HA 复
23、合材料及羟基磷灰石在 0.5h、2h、6h、12h 及 24h 不同时间点的吸水率。将 4 种 SF/HA 复合材料及羟基磷灰石植入 SD 大鼠背部皮下，进行体内降解观察。实验组分别于术后 2、6、12、16、20 及 24 周取材，对照组分别于术后 2、12 及 24 周取材，进行大体观察及组织学检查。 结果：丝素蛋白、HA、添加剂及致孔剂配比不同，制备的 4 种 SF/HA 人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下：SF/HA3、SF/HA4gt;SF/HA2、SF/HA1gt;HA。HA、SF/HA1 及 SF/HA2降解十分缓慢或基本不能降解；SF/HA32024 周
24、降解完毕；SF/HA41216 周降解完毕；各种材料周围组织未见明显变性坏死等。 结论：SF/HA1 平均孔径为 6.5m，最大孔径也只有 15m，不适合骨组织工程支架材料的要求。SF/HA4 虽然孔径、孔隙率满足要求，但力学强度较低，压缩强度只有1.59MPa，在水中很快散开，也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中，我们剔除这两种材料，将对 SF/HA3 及 SF/HA2 两种材料进行体外细胞相容性研究。 第二部分、免骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究 目的：体外分离培养兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs） ，并向成骨方向诱导培养
25、，为 SF/HA 相容性提供检测细胞及为 SF/HA 组织工程化骨提供适宜的种子细胞。 方法：抽取新西兰白兔的骨髓 5ml，通过密度梯度离心法获取 BMSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第 2 代细胞用含 1108g/l地塞米松、10mmol/l甘油磷酸钠及 50g/lL抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化；采用 MTT法测定细胞增殖情况；使用碱性磷酸酶染色及 Von Kossa 钙结节染色等方法，鉴定其成骨性能。 结果：BMSCs 在培养皿中贴壁生长、增殖，条件培养液诱导后表现出明显
26、的成骨活性，细胞增殖良好，体外矿化结节 Von Kossa 染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性，证实其有成骨潜能。 结论：可以通过体外分离纯化兔 BMSCs，在一定条件下能够向成骨方向诱导分化，并能使细胞保持较高的成骨活性，适于作为材料相容性的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。 第三部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究 目的：以成骨诱导的 BMSCs 作为检测细胞，与两种丝素蛋白/羟基磷灰石（SF/HA）进行体外复合培养，检测 SF/HA 的细胞相容性。 方法：将兔 BMSCs 体外成骨诱导至第 3 代，接种到预湿的 SF/HA2 及 SF/HA3 材料上复合培养
27、，以单纯 BMSCs 相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及 HE 染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以 MTT 法检测材料对细胞增殖活性的影响，以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力，以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否有细胞毒性。 结果：扫描电镜及组织学观察发现，细胞材料复合后，BMSCs 在 SF/HA2 及 SF/HA3 上能够良好地粘附和增殖。ALP 活性测定及 MTT 法测定 OD 值均证实，BMSCs 细胞活性及成骨性能不受材料影响，与对照组相比，差异无统计学意义（Pgt;0.05） 。材料浸提液细胞毒性试验显示，细胞毒性分级均为 0级，两种 SF/HA 浸提液对细
28、胞生长基本无毒性作用。 结论：SF/HA2 与 SF/HA3 对 BMSCs 的生长和成骨功能无影响，具有良好的细胞相容性，具有构建组织工程化骨的可行性。 第四部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石异位成骨及其组织相容性的实验研究 目的：探讨 SF/HA2 及 SF/HA3 体内异位成骨的能力，并通过肌肉植入实验进一步观察两种材料的组织相容性，为 SF/HA 修复节段性骨缺损提供实验依据。 方法：将体外诱导培养的兔骨髓基质细胞，以 5107/ml 的密度接种到 SF/HA2，作为实验组 1；接种到 SF/HA3，作为实验组 2，并于 35d 后植入兔背部肌肉中。植入单纯 SF/HA2 与 SF
29、/HA3，作为对照组。对照组亦作为材料的肌肉植入实验模型，观察组织相容性。于术后第 4、8、12 周，每次随机选取 5 只兔处死后取材，大体观察及 HE 染色组织学观察，并进行骨组织形态计量学分析，定量比较各组新骨形成情况。 结果：实验组术后 4、8、12 周均有新骨形成，随着时间延长，新骨生成量增多；骨组织形态计量学分析显示，实验组 1 优于实验组 2（Plt;0.05） ；对照组则均无新骨形成。肌肉植入实验未见肌肉变性坏死等。 结论：肌肉植入实验、第一部分的皮下植入实验及第三部分的细胞相容性研究均显示，两种 SF/HA 具有良好的组织相容性。SF/HA3 与 SF/HA2复合细胞后构建的组
30、织工程化骨，具有良好的异位成骨能力，可望应用于临床修复骨缺损。但从生物降解性及异位成骨的效果看，SF/HA3 更适合于作为人工骨材料，将进一步研究该材料修复节段性骨缺损的能力。 第五部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复节段性骨缺损的实验研究 目的：探索 SF/HA3 组织工程化骨的成骨作用及作为骨替代材料的可行性，期望为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料。 方法：在本实验中将 SF/HA3 更名为 SF/HA，与诱导的兔 BMSCs 复合，构建组织工程化骨。麻醉生效后，充分显露兔左侧桡骨中上段，造成 15mm 节段骨缺损。实验组植入 SF/HA+BMSCs 复合物，实验对照组植
31、入 SF/HA 材料，空白对照组骨缺损区不植入任何材料。 于术后第 4、8、12 及 16 周行 X 线摄片及 16 周时行螺旋 CT 扫描重建，观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照 LaneSandhu X 线评分标准对各组桡骨缺损的骨修复程度评分。标本行 HE 染色及 Masson 染色组织学观察，按照 LaneSandhu 组织学评分法比较 12 周及 16 周时各组动物的骨修复情况。 结果：实验组、实验对照组及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示，新骨生成有统计学差异（Plt;0.05） ，实验组优于实验对照组优于空白对照组；大体观察及放射学检查证实：实验组兔桡骨缺损完全愈合；实验组对照
32、组缺损处少部分骨愈合；空白对照组缺损基本无骨修复作用，由纤维组织充填。 结论：SF/HA 与 BMSCs 复合，降解速率适宜，能较快被骨组织取代，具有相当于自体骨的骨缺损修复能力，基本达到现代骨组织工程学的要求。但材料本身缺乏骨诱导作用，单独用于节段性骨缺损修复作用有限。本研究分为五部分： 第一部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其在 SD 大鼠体内降解的实验观察 目的：制备丝素蛋白/羟基磷灰石（silk fibroin/hydroxyapatite，SF/HA）复合人工骨材料，并将该材料植入生物体内降解，以了解 SF/HA 在动物体内的降解速率及机体对 SF/HA 的组织学反应，为
33、后续成骨实验提供可靠的参考数据。 方法：以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板，以家蚕丝素短纤维为增强材料，以 NaCl 为致孔剂，采用等静压的方法制备 4 种 SF/HA 复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组，测定4 种 SF/HA 复合材料及羟基磷灰石在 0.5h、2h、6h、12h 及 24h 不同时间点的吸水率。将 4 种 SF/HA 复合材料及羟基磷灰石植入 SD 大鼠背部皮下，进行体内降解观察。实验组分别于术后 2、6、12、16、20 及 24 周取材，对照组分别于术后 2、12 及 24 周取材，进行大体观察及组织学检查。 结果：丝素蛋白、HA、添加剂及致孔剂配比不同，制备的 4
34、 种 SF/HA 人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下：SF/HA3、SF/HA4gt;SF/HA2、SF/HA1gt;HA。HA、SF/HA1 及 SF/HA2降解十分缓慢或基本不能降解；SF/HA32024 周降解完毕；SF/HA41216 周降解完毕；各种材料周围组织未见明显变性坏死等。 结论：SF/HA1 平均孔径为 6.5m，最大孔径也只有 15m，不适合骨组织工程支架材料的要求。SF/HA4 虽然孔径、孔隙率满足要求，但力学强度较低，压缩强度只有1.59MPa，在水中很快散开，也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中，我们剔除这两种材料，将对 SF/HA3
35、及 SF/HA2 两种材料进行体外细胞相容性研究。 第二部分、免骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究 目的：体外分离培养兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs） ，并向成骨方向诱导培养，为 SF/HA 相容性提供检测细胞及为 SF/HA 组织工程化骨提供适宜的种子细胞。 方法：抽取新西兰白兔的骨髓 5ml，通过密度梯度离心法获取 BMSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第 2 代细胞用含 1108g/l地塞米松、10mmol/l甘油磷酸钠及 50g/lL抗坏血酸的条件培养液将其定向
36、成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化；采用 MTT法测定细胞增殖情况；使用碱性磷酸酶染色及 Von Kossa 钙结节染色等方法，鉴定其成骨性能。 结果：BMSCs 在培养皿中贴壁生长、增殖，条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性，细胞增殖良好，体外矿化结节 Von Kossa 染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性，证实其有成骨潜能。 结论：可以通过体外分离纯化兔 BMSCs，在一定条件下能够向成骨方向诱导分化，并能使细胞保持较高的成骨活性，适于作为材料相容性的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。 第三部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究 目的：以成骨
37、诱导的 BMSCs 作为检测细胞，与两种丝素蛋白/羟基磷灰石（SF/HA）进行体外复合培养，检测 SF/HA 的细胞相容性。 方法：将兔 BMSCs 体外成骨诱导至第 3 代，接种到预湿的 SF/HA2 及 SF/HA3 材料上复合培养，以单纯 BMSCs 相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及 HE 染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以 MTT 法检测材料对细胞增殖活性的影响，以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力，以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否有细胞毒性。 结果：扫描电镜及组织学观察发现，细胞材料复合后，BMSCs 在 SF/HA2 及 SF/HA3 上能够良好地粘附和
38、增殖。ALP 活性测定及 MTT 法测定 OD 值均证实，BMSCs 细胞活性及成骨性能不受材料影响，与对照组相比，差异无统计学意义（Pgt;0.05） 。材料浸提液细胞毒性试验显示，细胞毒性分级均为 0级，两种 SF/HA 浸提液对细胞生长基本无毒性作用。 结论：SF/HA2 与 SF/HA3 对 BMSCs 的生长和成骨功能无影响，具有良好的细胞相容性，具有构建组织工程化骨的可行性。 第四部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石异位成骨及其组织相容性的实验研究 目的：探讨 SF/HA2 及 SF/HA3 体内异位成骨的能力，并通过肌肉植入实验进一步观察两种材料的组织相容性，为 SF/HA 修
39、复节段性骨缺损提供实验依据。 方法：将体外诱导培养的兔骨髓基质细胞，以 5107/ml 的密度接种到 SF/HA2，作为实验组 1；接种到 SF/HA3，作为实验组 2，并于 35d 后植入兔背部肌肉中。植入单纯 SF/HA2 与 SF/HA3，作为对照组。对照组亦作为材料的肌肉植入实验模型，观察组织相容性。于术后第 4、8、12 周，每次随机选取 5 只兔处死后取材，大体观察及 HE 染色组织学观察，并进行骨组织形态计量学分析，定量比较各组新骨形成情况。 结果：实验组术后 4、8、12 周均有新骨形成，随着时间延长，新骨生成量增多；骨组织形态计量学分析显示，实验组 1 优于实验组 2（Plt
40、;0.05） ；对照组则均无新骨形成。肌肉植入实验未见肌肉变性坏死等。 结论：肌肉植入实验、第一部分的皮下植入实验及第三部分的细胞相容性研究均显示，两种 SF/HA 具有良好的组织相容性。SF/HA3 与 SF/HA2复合细胞后构建的组织工程化骨，具有良好的异位成骨能力，可望应用于临床修复骨缺损。但从生物降解性及异位成骨的效果看，SF/HA3 更适合于作为人工骨材料，将进一步研究该材料修复节段性骨缺损的能力。 第五部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复节段性骨缺损的实验研究 目的：探索 SF/HA3 组织工程化骨的成骨作用及作为骨替代材料的可行性，期望为临床治疗骨缺损提供新的人
41、工骨材料。 方法：在本实验中将 SF/HA3 更名为 SF/HA，与诱导的兔 BMSCs 复合，构建组织工程化骨。麻醉生效后，充分显露兔左侧桡骨中上段，造成 15mm 节段骨缺损。实验组植入 SF/HA+BMSCs 复合物，实验对照组植入 SF/HA 材料，空白对照组骨缺损区不植入任何材料。 于术后第 4、8、12 及 16 周行 X 线摄片及 16 周时行螺旋 CT 扫描重建，观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照 LaneSandhu X 线评分标准对各组桡骨缺损的骨修复程度评分。标本行 HE 染色及 Masson 染色组织学观察，按照 LaneSandhu 组织学评分法比较 12 周及 16
42、周时各组动物的骨修复情况。 结果：实验组、实验对照组及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示，新骨生成有统计学差异（Plt;0.05） ，实验组优于实验对照组优于空白对照组；大体观察及放射学检查证实：实验组兔桡骨缺损完全愈合；实验组对照组缺损处少部分骨愈合；空白对照组缺损基本无骨修复作用，由纤维组织充填。 结论：SF/HA 与 BMSCs 复合，降解速率适宜，能较快被骨组织取代，具有相当于自体骨的骨缺损修复能力，基本达到现代骨组织工程学的要求。但材料本身缺乏骨诱导作用，单独用于节段性骨缺损修复作用有限。本研究分为五部分： 第一部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其在 SD 大鼠体内降
43、解的实验观察 目的：制备丝素蛋白/羟基磷灰石（silk fibroin/hydroxyapatite，SF/HA）复合人工骨材料，并将该材料植入生物体内降解，以了解 SF/HA 在动物体内的降解速率及机体对 SF/HA 的组织学反应，为后续成骨实验提供可靠的参考数据。 方法：以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板，以家蚕丝素短纤维为增强材料，以 NaCl 为致孔剂，采用等静压的方法制备 4 种 SF/HA 复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组，测定4 种 SF/HA 复合材料及羟基磷灰石在 0.5h、2h、6h、12h 及 24h 不同时间点的吸水率。将 4 种 SF/HA 复合材料及羟基磷灰石
44、植入 SD 大鼠背部皮下，进行体内降解观察。实验组分别于术后 2、6、12、16、20 及 24 周取材，对照组分别于术后 2、12 及 24 周取材，进行大体观察及组织学检查。 结果：丝素蛋白、HA、添加剂及致孔剂配比不同，制备的 4 种 SF/HA 人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下：SF/HA3、SF/HA4gt;SF/HA2、SF/HA1gt;HA。HA、SF/HA1 及 SF/HA2降解十分缓慢或基本不能降解；SF/HA32024 周降解完毕；SF/HA41216 周降解完毕；各种材料周围组织未见明显变性坏死等。 结论：SF/HA1 平均孔径为 6.5m，最大
45、孔径也只有 15m，不适合骨组织工程支架材料的要求。SF/HA4 虽然孔径、孔隙率满足要求，但力学强度较低，压缩强度只有1.59MPa，在水中很快散开，也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中，我们剔除这两种材料，将对 SF/HA3 及 SF/HA2 两种材料进行体外细胞相容性研究。 第二部分、免骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究 目的：体外分离培养兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs） ，并向成骨方向诱导培养，为 SF/HA 相容性提供检测细胞及为 SF/HA 组织工程化骨提供适宜的种子细胞。 方法：抽取新西兰白兔的骨髓 5ml，通过
46、密度梯度离心法获取 BMSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第 2 代细胞用含 1108g/l地塞米松、10mmol/l甘油磷酸钠及 50g/lL抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化；采用 MTT法测定细胞增殖情况；使用碱性磷酸酶染色及 Von Kossa 钙结节染色等方法，鉴定其成骨性能。 结果：BMSCs 在培养皿中贴壁生长、增殖，条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性，细胞增殖良好，体外矿化结节 Von Kossa 染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性，证实其有成骨潜能。 结论：可以通过体外
47、分离纯化兔 BMSCs，在一定条件下能够向成骨方向诱导分化，并能使细胞保持较高的成骨活性，适于作为材料相容性的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。 第三部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究 目的：以成骨诱导的 BMSCs 作为检测细胞，与两种丝素蛋白/羟基磷灰石（SF/HA）进行体外复合培养，检测 SF/HA 的细胞相容性。 方法：将兔 BMSCs 体外成骨诱导至第 3 代，接种到预湿的 SF/HA2 及 SF/HA3 材料上复合培养，以单纯 BMSCs 相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及 HE 染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以 MTT
48、 法检测材料对细胞增殖活性的影响，以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力，以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否有细胞毒性。 结果：扫描电镜及组织学观察发现，细胞材料复合后，BMSCs 在 SF/HA2 及 SF/HA3 上能够良好地粘附和增殖。ALP 活性测定及 MTT 法测定 OD 值均证实，BMSCs 细胞活性及成骨性能不受材料影响，与对照组相比，差异无统计学意义（Pgt;0.05） 。材料浸提液细胞毒性试验显示，细胞毒性分级均为 0级，两种 SF/HA 浸提液对细胞生长基本无毒性作用。 结论：SF/HA2 与 SF/HA3 对 BMSCs 的生长和成骨功能无影响，具有良好的细胞相容性，具有构建组织工程化骨的可行性。 第四部分、可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石异位成骨及其组织相容性的实验研究 目的：探讨 SF/HA2 及 SF/HA3 体内异位成骨的能力，并通过肌肉植入实验进一步观察两种材料的组织相容性，为 SF/HA 修复节段性骨缺损提供实验依据。 方法：将体外诱导培养的兔骨髓基质细胞，以 5107/ml 的密度接种到 SF/HA2，作为实验组 1；接种到 SF/HA3，作为实验组 2，并于 35d 后植
