1、委内瑞拉马脑炎病毒 E2 蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 焦翠翠 金宏丽 蒋天琪 曹增国 李岭 吴芳芳 王琪 邱泊宁 迟航 黄培 侯朋飞 赵永坤 冯娜 王铁成 高玉伟 王化磊 杨松涛 夏咸柱 解放军军事医学科学院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 吉林大学动物医学学院 东北农业大学动物医学学院 摘 要： 原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒 (Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV) E2 蛋白胞外区, 并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR 扩增 VEEV E2 蛋白胞
2、外区基因并将其插入到原核表达载体 pET-30a (+) , 构建重组质粒 pET-30a (+) -VEEV-E2, 转化至大肠杆菌 BL21 (DE3) , IPTG 诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化, 用纯化后的蛋白免疫 BALB/c 小鼠制备多克隆抗体, 通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过 PCR 扩增出约为 1 023bp 的 VEEV E2 基因胞外区, 成功构建重组表达质粒pET-30a (+) -VEEV-E2, 在 37, 0.6mmol/L IPTG 诱导 3h 条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫 BALB/
3、C 小鼠成功制备了抗 VEEV E2 蛋白胞外区鼠源多克隆抗体, 经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的 VEEV E2 蛋白。VEEV E2 基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达, 且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性, 为 VEEV 快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。关键词： 委内瑞拉马脑炎病毒; 原核表达; 纯化; 多克隆抗体; 作者简介：焦翠翠 (1990-) , 女, 硕士。作者简介：夏咸柱 E-mail:Xia-;作者简介：杨松涛 E-mail:;作者简介：王化磊 E-mail:收稿日期：2017-01-17基金：解放军总后勤部卫生部重点项目 (13CXZ024)
4、Prokaryotic expression, purification and identification of the E2 gene from Venezuelan equine encephalitis virusJIAO Cui-cui JIN Hong-li JIANG Tian-qi CAO Zeng-guo LI Ling WU Fang-fang WANG Qi QIU Bo-ning CHI Hang HUANG Pei HOU Peng-Fei ZHAO Yong-kun FENG Na WANG Tie-cheng GAO Yu-wei WANG Hua-lei YA
5、NG Song-tao XIA Xian-zhu Institute of Military Veterinary Medicine, Academy of Military Medical Sciences; Abstract： To express and purify the E2 extracellular domain of Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) , produce the polyclonal antibody of mouse anti-VEEV E2 protein and identify the polycl
6、onal antibody.Truncated E2 gene was amplified by PCR and inserted into prokaryotic expression vector pET-30 a (+) .The constructed plasmid pET-30 a (+) -VEEV-E2 was transformed into BL21 (DE3) to express under induction of IPTG.The induction conditions were optimized to express a maximum of target p
7、rotein.BABL/c mice were immunized with the purification target protein to produce polyclonal antibody.Antibody combining ability is detected by indirect immunofluorescence method.The E2 extracellular domain gene of VEEV was successfully amplified by PCR to yield a product 1 023 bp.PCR analysis and s
8、equencing proved that the recombinant plasmid pET-30 a (+) -VEEV-E2 was successfully constructed.The target protein was expressed in the form of inclusion body.The optimal conditions of protein expression were 37, with the final concentration of 0.6 mmol/L IPTG for 3 h.BABL/c mice were immunized thr
9、ee times with the purified recombinant protein to obtain polyclonal antibody.The result of indirect immunofluorescence showed that the sera could specifically recognize the prokaryotically expressed E2 protein.The E2 extracellular domain gene of VEEV was stably expressed in E.coli.The recombinant pr
10、otein E2 has expected immunogenicity, which may lay a foundation of establishment of a method for rapid diagnosis of VEEV and study on novel vaccines.Keyword： Venezuelan equine encephalitis virus; Prokaryotic expression; Purification; Polyclonal antibody; Received： 2017-01-17委内瑞拉马脑炎 (Venezuelan equi
11、ne encephalitis, VEE) 是由委内瑞拉马脑炎病毒 (Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV) 复合物引起的重要人畜共患传染病1, 可导致人和动物的致死性脑炎, 在儿童中有较高的死亡率2-3。Kubes 和 Rios 于 1938 年在委内瑞拉的 1 匹病驴中分离到病毒, 并确定为委内瑞拉马脑炎病毒。马匹大规模发病时, 常伴有人类病例出现, 感染的马可作为扩增宿主4, 同时也是本病的重要传染源。VEEV 主要通过蚊虫叮咬传播, 但有研究证明其也可通过气溶胶传播, 是极其危险的生物武器5。VEEV 复合物并非一种单一的病毒, 它是由一
12、群具有明显毒力差异, 特别是抗原差异的病毒组成的复合群, 称其为 VEEV 复合群, VEEV 复合群包括 6 种抗原相关的亚型 (、) , 亚型为 VEEV、亚型为Everglades、亚型为 Mucombo、亚型为 Pixuna、亚型为 Cabassou、亚型为 AG806632。其中, 亚型包括 5 种类型 (AB、C、D、E、F) 、亚型包括 3 种类型 (A、B、C) 1,5, 而AB、C 是主要的致病因素6。VEEV 是单股正链 RNA 病毒, 属于披膜病毒科 (Togaviridaefamily) , 甲病毒属 (Alphavirusgenus) , 基因组全长约 11 400b
13、p, 编码 4 种非结构蛋白 (nsP1、nsP2、nsP3、nsP4) 和 5 种结构蛋白 (C、E3、E2、6K、E1) 5。其中, E2 糖蛋白含病毒的主要抗原表位, 能够与细胞受体结合并刺激机体产生中和抗体6-7。VEE 尚没有有效的治疗方法, 疫苗免疫是防控本病的有效手段, 目前国内外尚无获批的 VEE 疫苗, 一些疫苗的研发仍处于临床前研究阶段, 其中进展最快的pWRG/VEE DNA 疫苗进入临床 I 期8-11。我国尚未有 VEE 病例的报道, 但是随着国际贸易的日益频繁及生物恐怖袭击的不断蔓延, 该病传入我国的风险将大大增加, 我国出入境口岸必须加强对 VEEV 的检测, 防
14、止该病传入我国引起暴发流行。本试验选用 TRD 强毒株 E2 基因序列, 通过原核表达系统成功表达并纯化E2 蛋白胞外区, 将其免疫 BALB/c 小鼠获得鼠源 VEEV E2 蛋白多克隆抗体, 为VEEV 快速诊断方法的建立及亚单位疫苗的研发奠定了基础。1 材料与方法1.1 菌种及质粒E.coli BL21 (DE3) 、HSTO8 感受态、原核表达载体 pET30a (+) 、含有 VEEV所有结构基因的重组质粒 pcDNA3.1-VEEV-S、含有 VEEV E2 基因的重组杆状病毒 rBaculovirus-E2 和昆虫 Sf9 细胞均由军事医学科学院军事兽医研究所动物病毒学与特种动物
15、疫病学实验室保存。1.2 主要试剂质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自美国 Axygen 公司;高保真 DNA 聚合酶由美国 Thermo 公司提供;限制性核酸内切酶 BamH、Xho、T 4DNA 连接酶、DL2000、DL5000 和 DL15000DNA Marker、蛋白质 Marker 和 HRP 标记的羊抗鼠IgG 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;鼠源 His 单克隆抗体购自碧云天公司;异丙基 2-2-D 硫代半乳糖苷 (IPTG) 为美国 Sigma 公司产品;His 标签镍离子蛋白纯化柱 (ProteinIso NiNTA Resin) 购于全式金公司;FITC 标记羊抗鼠
16、IgG、BSA (牛血清白蛋白) 购于北京索莱宝科技有限公司。1.3 引物设计及合成参考 GenBank 中 VEEVTRD 株 E2 基因序列 (登录号为:L01442.2) , 利用 Primer Premier 5.0 软件设计引物, 引物序列如下:上游引物 P1:5-ATAGGATCCTCCACCGAG-GAGCTGTTTAAGG-3 (下划线部分为 BamH酶切位点) , 下游引物 P2:5-ATACTCGAGCTGT-GCCCAAAACCTTTTCG-3 (下划线部分为 Xho酶切位点) , 扩增片段大小为 1 023bp。引物由长春库美生物科技有限公司合成。1.4 E2 基因的扩
17、增以质粒 pcDNA3.1-VEEV-S 为模板, PCR 扩增 VEEV E2 基因片段。反应体系为:ddH2O 32L, 5PCR 缓冲液 10L, DNA 模板 1L, P1、P2 各 1L (20 mmol/L) , Pfu DNA 高保真聚合酶 1L, dNTP (2.5 mmol/L) 1L, 共50L。反应条件为:95预变性 2min;9520s, 5530s, 721 min, 共 35个循环;72延伸 7min。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳, 回收目的基因条带。1.5 重组表达质粒的构建将胶回收的 PCR 产物与原核表达载体 pET30a (+) 分别经 BamH和 X
18、ho双酶切, 回收 E2 基因片段和 pET30a (+) 载体片段。经 T4DNA 连接酶 22连接 2h, 连接产物转化至感受态 HST08, 构建重组表达质粒, 双酶切鉴定正确后, 送至长春库美生物科技有限公司进行测序。将鉴定正确的重组质粒命名为 pET-30a (+) -VEEV-E2, 并将该质粒转化至感受态 E.coli BL21 (DE3) , 37培养 12h, 挑取单菌落 37培养 12h, 取菌液提取质粒并进行 PCR 鉴定, 保存菌种。1.6目的蛋白的诱导表达将鉴定正确的菌液接种于含 100mg/L K 的 LB 培养基中, 37、200r/min 振荡培养 3h 左右至
19、菌液 D600为 0.40.6 时, 加入 IPTG 进行诱导表达, 收集菌液, 进行 SDS-PAGE 鉴定。1.7 目的蛋白诱导表达条件的优化1.7.1 诱导时间的优化每管加入等量的培养基和菌液, 37、200r/min 振荡培养 3h 左右至菌液 D 为0.40.6 时, 加入 0.4 mmol/L IPTG, 分别于 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9h 取等量的菌液制备 SDS-PAGE 样品, 进行 SDS-PAGE 试验, 分析最优诱导时间。1.7.2 诱导浓度的优化每管加入等量的培养基和菌液, 振荡培养至菌液 D 为 0.40.6 时, 加入 IPTG 的浓度分
20、别为 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.5, 2.0 mmol/L, 37诱导3h, 利用 SDS-PAGE 方法分析最优诱导浓度。1.7.3 诱导温度的优化菌液 D 值达到 0.40.6 时, 加入 0.6 mmol/L IPTG, 设置诱导温度分别为 30和 37, 诱导 3h, 进行 SDS-PAGE 分析最优诱导温度。1.8 目的蛋白表达形式的分析按照 1.7 目的蛋白的最优诱导条件诱导 2 mL 菌液, 4、12 000r/min 离心2min, 使用 200L 的溶菌酶重悬菌体, 室温静置 30min, 12 000r/min 离心2min, 将
21、上清液转移至新的 EP 管中, 并且使用 200L 的 PBS 重悬沉淀, 加入上样液, 沸水浴 10min 后, 取上清样品与重悬沉淀样品进行 SDS-PAGE 分析。1.9 目的蛋白的纯化与鉴定按照 1.7 目的蛋白最优诱导条件诱导培养 500 mL 菌液, 4、12 000r/min 离心 15min, 菌体用 30mL 平衡液重悬, 4超声破碎直至溶液澄清, 4、12 000r/min 离心 15min, 收集上清。采用全式金公司的 Ni -NTA 金属螯合蛋白质纯化柱纯化重组目的蛋白。按照其说明书进行纯化, 收集洗脱液, 各取 20L收集液进行 SDS-PAGE 和 Western
22、blot 分析。将纯化的目的蛋白转移至透析袋进行透析, 使用 PEG8000 浓缩后用 BCA 法测定蛋白浓度。1.1 0 多克隆抗体的制备将纯化的目的蛋白与弗氏完全佐剂按 11 比例乳化后肌肉注射小鼠, 注射剂量为 50g/只。分别在第 2 周以及第 4 周加强免疫, 第 2, 3 次免疫时将重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化, 免疫剂量与 1 免相同。3 免后 14d 眼眶采血, 分离血清。1.1 1 间接免疫荧光检测抗体结合能力将含有 VEEV E2 基因的重组杆状病毒 rBacmid-E2 以 MOI=0.5 接种 Sf9 细胞, 48h 后用 80%冷丙酮室温固定 30 min;用
23、PBST 洗涤 3 次, 每次 4 min;使用 5%脱脂乳室温封闭 2h;洗涤后, 加入小鼠血清 (1100 倍稀释) , 37孵育1h;PBST 洗涤 3 次, 每次 4min;避光加 FITC 标记羊抗鼠 IgG (1200 倍稀释) , 37孵育 1h;洗涤后, 于荧光显微镜下观察。2 结果2.1 VEEV 的 E2 基因胞外区序列的扩增以重组质粒 pcDNA3.1-VEEV-S 为模板, 进行 PCR 扩增, 经 1%琼脂糖凝胶电泳检出片段大小为 1 023bp 的条带, 与预期大小一致 (图 1) 。2.2 重组表达质粒的构建及鉴定酶切后的目的片段与 pET-30a (+) 片段进
24、行连接, 连接产物转化至 HST08 感受态, 提取重组质粒, 进行 PCR 鉴定, 经 1%琼脂糖凝胶电泳分析, 可见 1 023bp的目的片段。基因测序结果与 GenBank 中收录的基因序列同源性 100%, 表明目的基因已正确插入 (图 2) 。图 1 PCR 扩增 VEEV E2 基因电泳图 M.DL2000DNAMarker;1.VEEV E2 基因的扩增产物图 2 重组表达质粒 pET-30a (+) -VEEV-tE2PCR 鉴定结果 M.DL2000DNA Marker;1.重组质粒的 PCR 产物2.3 目的蛋白的诱导表达重组质粒转化至 E.coli BL21 (DE3)
25、感受态, 使用 IPTG 进行目的蛋白的诱导表达, 表达产物经 SDS-PAGE 电泳, 转膜至 NC 膜, 以鼠源 His 单抗为一抗, HRP标记的羊抗鼠 IgG 为二抗进行 Western blot 分析。结果显示在 46000 处出现目的条带 (图 3) 。2.4 目的蛋白诱导表达条件的优化2.4.1 诱导时间的优化将重组菌使用 IPTG 分别诱导 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9h, 结果显示目的蛋白的表达会随着诱导时间的改变而发生变化, 且诱导 3h 目的蛋白表达最优 (图 4) 。图 3 目的蛋白诱导表达的 Western blot 分析 M.曝光 Marker
26、;1.未诱导的空载体;2.IPTG 诱导 3h 空载体;3.未诱导重组菌;4.IPTG 诱导 3h 重组菌图 4 不同诱导时间重组蛋白表达的 SDS-PAGE M.蛋白质 Marker;19.IPTG 诱导19h 的重组表达菌 DE3-pET-30a (+) -VEEV-E22.4.2 诱导浓度的优化分别使用 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.5, 2.0mmol/L 浓度的 IPTG 进行目的蛋白的诱导表达, SDS-PAGE 分析结果显示 IPTG 诱导蛋白表达的最佳浓度为 0.60.8mmol/L (图 5) 。图 5 不同诱导浓度重组蛋白表达的 SD
27、S-PAGE M.蛋白质 Marker;19.分别是浓度为 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.5, 2.0 mmol/LM IPTG 诱导的重组表达菌 DE3-pET-30a (+) -VEEV-E22.4.3 诱导温度的优化分别选取 30, 37进行目的蛋白的诱导表达, SDS-PAGE 电泳结果显示 37是最佳诱导温度 (图 6) 。图 6 不同诱导温度重组蛋白表达的 SDS-PAGE M.蛋白质 Marker;1.37诱导的重组表达菌 DE3-pET-30a (+) -VEEV-E2;2.30诱导的重组表达菌 DE3-pET-30a (+) -VEEV
28、-E22.4.4 目的蛋白表达形式的分析根据优化的诱导条件进行目的蛋白的表达, 溶菌酶进行裂解, 分别取菌液上清、裂解液上清、裂解液沉淀进行 SDS-PAGE 分析, 结果显示目的蛋白以包涵体的形式表达 (图 7) 。2.4.5 目的蛋白的纯化表达的重组蛋白经 Ni -NTA 金属螯合蛋白质纯化柱进行纯化, 纯化的蛋白经SDS-PAGE 电泳后进行薄层扫描, 纯度达到 90% (图 8, 9) 。图 7 目的蛋白表达形式 SDS-PAGE 结果分析 M.蛋白质 Marker;1.诱导后的重组菌上清;2.诱导后的重组菌裂解上清;3.诱导后的重组菌裂解沉淀图 8 纯化目的蛋白的 SDS-PAGE
29、结果分析 M.蛋白质 Marker;1.纯化后的目的蛋白图 9 纯化目的蛋白的薄层扫描结果分析 下载原图2.4.6 间接免疫荧光检测抗体结合能力间接免疫荧光结果显示:正常的 Sf9 细胞未出现荧光, 重组杆状病毒 rBacmid-E2 感染的 Sf9 细胞出现特异性荧光, 表明小鼠产生的抗 VEEV E2 蛋白多克隆抗体可以特异结合真核表达的 VEEV E2 蛋白 (图 10) 。图 10 间接免疫荧光检测抗体的特异性 A.感染重组杆状病毒的 Sf9 细胞;B.正常Sf9 细胞3 讨论自 1938 年分离到 VEEV 至今已近 80 年, 该病主要流行于南北美洲, 多为热带和亚热带森林、沼泽地
30、区12。在甲病毒属中, VEEV 的死亡率较低, 但是 VEEV可通过气溶胶传播, 这就大大增加了该病的感染率, 且该病一旦暴发, 迅速蔓延, 波及范围广, 持续时间长13。由于人畜感染 VEEV 后表现的临床症状与其他虫媒病有很大的相似之处, 故很容易造成误诊, 在拉丁美洲每年有大约超过10%的类似于登革热的病例是由 VEEV 引起的14-16。因此建立快速、准确的VEEV 检测方法对于委内瑞拉马脑炎的综合防控是必不可少的。E2 蛋白以刺突形式锚定在 VEEV 粒子的表面, 该蛋白参与病毒的出芽过程, 在病毒的形成中起到关键作用17。E2 蛋白含有 6 个重要的抗原表位参与 VEEV中和反应
31、, 定义为 E2, 是 VEEV 的主要保护性抗原18-20。表达 VEEV 糖蛋白E3-E2-6K-E1 的候选 DNA 疫苗可诱导小鼠及食蟹猴产生显著的中和抗体免疫应答, 且该疫苗已进入临床 I 期11,21。王振东等22利用镍柱纯化原核表达的VEEV E2 蛋白作为抗原建立了 VEEV 抗体免疫胶体金检测方法, 该方法具有良好的重复性及稳定性, 但这种方法的灵敏度较 ELISA 低, 且无法进行定量分析。本试验前期尝试利用 pET-30a (+) 、PGEX-4T-1 载体在 E.coli 中表达完整的VEEVE2 糖蛋白, 但在诱导表达时, 全长 E2 基因表达的蛋白量偏低, 并且在纯
32、化的过程中出现了纯度偏低的现象。E2 蛋白的主要抗原表位及糖基化位点位于胞外区, 且胞外区含有鼠及人的抗原表位, 具有良好的免疫原性17, 片段小, 特异性强。将 E2 糖蛋白的胞外区进行表达, 规避了表达完整 E2 蛋白试验中出现的问题, 同时胞外区的抗原表位未发生变化, 可特异性结合抗体, 也为跨膜蛋白的原核表达与纯化提供新的思路与方法。大肠杆菌表达系统具有表达量高、成本低、易于纯化等优点, 因此本实验选用大肠杆菌表达系统进行 VEEV E2 蛋白的表达, 选择含有 His 标签的原核表达载体 pET-30a (+) , 进行 E2 蛋白的重组表达, 以便于目的蛋白的纯化。为了节约成本并提
33、高目的蛋白的表达量, 我们对目的蛋白表达的诱导条件 (诱导表达温度、诱导剂浓度、诱导表达时间) 进行了优化, 确定了最优诱导条件 (37、0.6 mmol/L、3h) 。本试验结果表明:构建的重组表达质粒 pET-30a (+) -VEEV-E2 能够在大肠杆菌中高效表达截短的 E2 蛋白, 并利用纯化的蛋白制备了鼠源多克隆抗体, 说明 E2 蛋白对小鼠具有良好的免疫原性。E2 蛋白的成功表达, 为建立针对 VEEV E2 蛋白的 ELISA 抗体/抗原检测方法和新型疫苗的研制奠定了基础。参考文献1林祥梅, 韩雪清, 王景林, 等.外来动物疫病M.北京:科学出版社, 2014:226-236.
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