1、内科学(血液病)专业毕业论文 精品论文 硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及其耐药机制研究关键词：多发性骨髓瘤 蛋白酶体抑制剂 硼替佐米 耐药机制 基因表达谱分析 双向凝胶电泳摘要：目的和意义： 多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是最为常见的血液系统恶性肿瘤之一，发生率占血液系统恶性肿瘤的 10左右，随着人口的老龄化，该病的发生率在我国呈逐年增高的趋势。目前，所有的治疗手段包括化疗、放疗、造血干细胞移植以及一些新型的分子靶向药物。但迄今为止 MM 仍是一种不可治愈性疾病。研究显示，蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib/PS-341，商品名 VElCADE(R)可诱导包括
2、地塞米松、美法仑以及沙利度胺耐药删细胞在内的 MM 细胞产生凋亡，已在删的治疗中显示出了较好的疗效。其主要作用机制为通过靶向性作用于泛素-蛋白酶体系统，抑制核因子 B(nuclear factor-kappa B，NF-B)的活性以发挥抗肿瘤作用。 硼替佐米为哺乳动物细胞中 26S 蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，化学名为：(1R)-3-甲基-1(2S)-1 氧-3-苯基-2-(吡嗪羧基)氨基丙基氨基丁基硼酸，分子式C19H25BN404，相对分子量 384.24。它是首个获美国 FDA 批准用于 MM 临床治疗的蛋白酶体抑制剂，具有特异性强效、高效的特点。Mateos 等报道，采用硼替佐
3、米联合 MP(VMP 方案)治疗 60 例 65 岁及以上的老年初诊 MM 患者，总反应率为89，CR 率为 32，16 个月的无事件生存率(EFS)为 93；而历史对照的 MP方案总反应率为 42，16 个月的 EFS 为 51。2008 年 NCCN 骨髓瘤诊疗指南中也推荐将 VD(硼替佐米+地塞米松)、PAD(硼替佐米+地塞米松邯可霉素)、MPV(美法仑+强的松+硼替佐米)用于初发及移植候选的 MM 患者。对于难治/复发的 MM 患者 2008 年 NCCN 指南中将硼替佐米单药及硼替佐米联合脂质体阿霉素作为类推荐，硼替佐米+地塞米松方案作为 2A 类推荐。 然而，硼替佐米尚不能根治 M
4、M，且随着其临床应用范围的扩大和时间的推移，国内外临床研究已发现部分删患者对硼替佐米产生了耐药反应或在初期治疗有效的 MM 患者中出现耐药及疾病的复发，从而影响了硼替佐米的疗效。目前，研究发现 MM 患者中硼替佐米耐药主要与 NF- B 途径、热休克蛋白及 BCL 蛋白家族的过表达现象有关。因此，继续寻找有效方案以预防耐药的发生或根除恶性浆细胞克隆，是目前研究的一个热点。 目前，国内外关于硼替佐米的耐药机制研究尚少，其耐药机制尚不明确。有研究国外分析了多药物耐药蛋白(MRP)在删细胞中的表达与硼替佐米诱导 MM 细胞凋亡间的相关性，研究显示 MRP3 和 MRP5 的表达不足以遏制硼替佐米诱导
5、产生的凋亡作用，从而提示硼替佐米可能并非为多药耐药转运蛋白的底物。这就提示，硼替佐米的耐药不同于现有肿瘤治疗中经典的多药耐药。 因此，如果能建立硼替佐米耐药的 MM 细胞株，可以深入研究硼替佐米可能的耐药机制，为临床应用蛋白酶体抑制剂治疗 MM，监测和避免治疗中耐药的发生提供实验依据；同时，为抗耐药药物的筛选提供细胞模型，以期达到逆转耐药提高疗效的目的。为此，本研究拟通过建立硼替佐米耐药的删细胞株，对其进行基因组学及差异蛋白组学的研究以期初步探讨其可能的耐药机制，为临床克服硼替佐米耐药提供细胞模型及实验依据。本研究包括以下两个部分： 第一部分硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及其基因表达谱研究 方
6、法：采用浓度递增的方法自 MM 细胞系 NCI-H929 建立了硼替佐米耐药株 NCI-H929B。MTT 实验测得硼替佐米对亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B24h 的 IC50 值。流式细胞术分析两种细胞的细胞周期分布情况。提取 NCI-H929、NCI-H929B 两种 mRNA 分别变性及逆转录至 cDNA，进行基因表达谱分析。对基因表达谱数据，进行 GO-分析和Pathway-分析，从中发现可能与耐药相关的信号通路，及其相互激活关系。采用实时定量 PCR 技术，对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)进行验证。并选取
7、Caspase8 抑制剂进行干预，检测亲本 NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 变化情况。 结果：采用浓度递增法自 MM 细胞系 NCI-H929 建立了硼替佐米耐药株 NCI-H929B。MTT 实验测得硼替佐米对亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B24h 的 IC50 分别为 20.7nmol/L 和 487.4nmol/L，耐药倍数为 23.5。流式细胞术分析显示亲本NCI-H929 和 NCI-H929B 的细胞周期分布无显著性差异。 提取亲本 NCI-H929、NCI-H929B 两种 mRNA 分别变性及逆转录至 cDNA，进行基因表达谱分析，结果显示与亲本
8、NCI-H929 相比，在 NCI-H929B 中有 317 个基因表达上调，而356 个基因表达下调。对基因表达谱数据，进行 GO-分析和 Pathway 一分析，从中发现可能与耐药相关的信号通路，及其相互激活关系，结果提示凋亡通路、细胞周期等信号通路可能与硼替佐米耐药的产生相关。采用实时定量 PCR 技术，对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)进行验证。当候选基因在耐药株中表达/亲本细胞中表达1.5 时，则认为该基因为过表达，若是0.5 则判定该基因为低表达，结果显示在 NCI-H929B 细胞株中FADD、Casp8，MAP3K5
9、表达下调，而 Hsp86 表达上调。采用 Caspase8 抑制剂进行干预，检测亲本 NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 变化情况，结果显示加入抑制剂后，NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 增高 4.37 倍。 结论：通过体外浓度递增法可建立蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药的 MM 细胞株。亲本NCI-H929 和 NCI-H929B 的生长曲线和细胞周期分布无显著性差异。基因表达谱及 Pathway 分析显示亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B 细胞系间存在多个差异表达基因，而凋亡、细胞周期通路在耐药的产生中可能起着重要作用。Caspase8 的表达受抑制可能是耐
10、药细胞株产生耐药的重要因素之一。 第二部分硼替佐米敏感与硼替佐米耐药骨髓瘤细胞差异蛋白质组学研究 方法：提取 NCI-H929、NCI-H929B 两种细胞的蛋白，采用双向电泳及质谱鉴定技术，分析差异蛋白的表达情况。并选取其中部分差异蛋白，采用 western-blot 技术进行验证。留取临床患者原代标本，进行 western-blot 检测，进一步验证双向电泳结果，并分析差异蛋白与硼替佐米耐药的相关性。 结果：通过双向电泳及质谱鉴定后共鉴定出 14 个差异蛋白，与亲本 NCI-H929 细胞相比，在 NCI-H929B 中上调的蛋白质点有 11 个，分别为 HSP75、 烯醇化酶、蛋白二硫化
11、物异构酶 A3、磷酸化应激诱导蛋白 1、膜联蛋白 A1、脱氧核糖核酸酶 TATDN1、HSP-1、蛋白 DJ-1、微管蛋白 -6、角蛋白 KRT1、加帽蛋白 Z；下调的蛋白质点有 3 个，分别为腺苷高半胱氨酸水解酶、ATP 合成酶 亚单位和 Rho-GDP 解离抑制因子。通过 western Blot 技术检测了在 NCI-H929B 双向电泳中显示为高表达的蛋白 DJ-1，结果显示 NCI-H929B 中蛋白 DJ-1 表达水平增高。采用 CD138 磁珠分选技术获得 7 名 MM 患者的原代删细胞标本，通过 western Blot 技术检测显示硼替佐米耐药的原代删细胞标本中蛋白 DJ-1
12、 表达水平高于硼替佐米敏感的原代MM 细胞。 结论：通过双向电泳技术显示在亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B 间存在多个差异表达的蛋白，western Blot 技术验证了其中一个在 NCI-H929B 中高表达的蛋白 DJ-1，结果显示 NCI-H929B 和耐药患者的原代 MM 细胞中蛋白 DJ-1表达水平增高，提示蛋白 DJ-1 的高表达可能与硼替佐米的耐药相关。正文内容目的和意义： 多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是最为常见的血液系统恶性肿瘤之一，发生率占血液系统恶性肿瘤的 10左右，随着人口的老龄化，该病的发生率在我国呈逐年增高的趋势。目前，所有的治
13、疗手段包括化疗、放疗、造血干细胞移植以及一些新型的分子靶向药物。但迄今为止 MM 仍是一种不可治愈性疾病。研究显示，蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib/PS-341，商品名 VElCADE(R)可诱导包括地塞米松、美法仑以及沙利度胺耐药删细胞在内的 MM 细胞产生凋亡，已在删的治疗中显示出了较好的疗效。其主要作用机制为通过靶向性作用于泛素-蛋白酶体系统，抑制核因子 B(nuclear factor-kappa B，NF-B)的活性以发挥抗肿瘤作用。 硼替佐米为哺乳动物细胞中26S 蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，化学名为：(1R)-3-甲基-1(2S)-1 氧-3-苯基-2-(吡
14、嗪羧基)氨基丙基氨基丁基硼酸，分子式C19H25BN404，相对分子量 384.24。它是首个获美国 FDA 批准用于 MM 临床治疗的蛋白酶体抑制剂，具有特异性强效、高效的特点。Mateos 等报道，采用硼替佐米联合 MP(VMP 方案)治疗 60 例 65 岁及以上的老年初诊 MM 患者，总反应率为89，CR 率为 32，16 个月的无事件生存率(EFS)为 93；而历史对照的 MP方案总反应率为 42，16 个月的 EFS 为 51。2008 年 NCCN 骨髓瘤诊疗指南中也推荐将 VD(硼替佐米+地塞米松)、PAD(硼替佐米+地塞米松邯可霉素)、MPV(美法仑+强的松+硼替佐米)用于初
15、发及移植候选的 MM 患者。对于难治/复发的 MM 患者 2008 年 NCCN 指南中将硼替佐米单药及硼替佐米联合脂质体阿霉素作为类推荐，硼替佐米+地塞米松方案作为 2A 类推荐。 然而，硼替佐米尚不能根治 MM，且随着其临床应用范围的扩大和时间的推移，国内外临床研究已发现部分删患者对硼替佐米产生了耐药反应或在初期治疗有效的 MM 患者中出现耐药及疾病的复发，从而影响了硼替佐米的疗效。目前，研究发现 MM 患者中硼替佐米耐药主要与 NF- B 途径、热休克蛋白及 BCL 蛋白家族的过表达现象有关。因此，继续寻找有效方案以预防耐药的发生或根除恶性浆细胞克隆，是目前研究的一个热点。 目前，国内外
16、关于硼替佐米的耐药机制研究尚少，其耐药机制尚不明确。有研究国外分析了多药物耐药蛋白(MRP)在删细胞中的表达与硼替佐米诱导 MM 细胞凋亡间的相关性，研究显示 MRP3 和 MRP5 的表达不足以遏制硼替佐米诱导产生的凋亡作用，从而提示硼替佐米可能并非为多药耐药转运蛋白的底物。这就提示，硼替佐米的耐药不同于现有肿瘤治疗中经典的多药耐药。 因此，如果能建立硼替佐米耐药的 MM 细胞株，可以深入研究硼替佐米可能的耐药机制，为临床应用蛋白酶体抑制剂治疗 MM，监测和避免治疗中耐药的发生提供实验依据；同时，为抗耐药药物的筛选提供细胞模型，以期达到逆转耐药提高疗效的目的。为此，本研究拟通过建立硼替佐米耐
17、药的删细胞株，对其进行基因组学及差异蛋白组学的研究以期初步探讨其可能的耐药机制，为临床克服硼替佐米耐药提供细胞模型及实验依据。本研究包括以下两个部分： 第一部分硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及其基因表达谱研究 方法：采用浓度递增的方法自 MM 细胞系 NCI-H929 建立了硼替佐米耐药株 NCI-H929B。MTT 实验测得硼替佐米对亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B24h 的 IC50 值。流式细胞术分析两种细胞的细胞周期分布情况。提取 NCI-H929、NCI-H929B 两种 mRNA 分别变性及逆转录至 cDNA，进行基因表达谱分析。对基因表达谱数据，进行 GO-分析和P
18、athway-分析，从中发现可能与耐药相关的信号通路，及其相互激活关系。采用实时定量 PCR 技术，对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)进行验证。并选取 Caspase8 抑制剂进行干预，检测亲本 NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 变化情况。 结果：采用浓度递增法自 MM 细胞系 NCI-H929 建立了硼替佐米耐药株 NCI-H929B。MTT 实验测得硼替佐米对亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B24h 的 IC50 分别为 20.7nmol/L 和 487.4nmol/L，耐药倍数为 23.5。流式细胞术分
19、析显示亲本NCI-H929 和 NCI-H929B 的细胞周期分布无显著性差异。 提取亲本 NCI-H929、NCI-H929B 两种 mRNA 分别变性及逆转录至 cDNA，进行基因表达谱分析，结果显示与亲本 NCI-H929 相比，在 NCI-H929B 中有 317 个基因表达上调，而356 个基因表达下调。对基因表达谱数据，进行 GO-分析和 Pathway 一分析，从中发现可能与耐药相关的信号通路，及其相互激活关系，结果提示凋亡通路、细胞周期等信号通路可能与硼替佐米耐药的产生相关。采用实时定量 PCR 技术，对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3
20、K5、Hsp86)进行验证。当候选基因在耐药株中表达/亲本细胞中表达1.5 时，则认为该基因为过表达，若是0.5 则判定该基因为低表达，结果显示在 NCI-H929B 细胞株中FADD、Casp8，MAP3K5 表达下调，而 Hsp86 表达上调。采用 Caspase8 抑制剂进行干预，检测亲本 NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 变化情况，结果显示加入抑制剂后，NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 增高 4.37 倍。 结论：通过体外浓度递增法可建立蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药的 MM 细胞株。亲本NCI-H929 和 NCI-H929B 的生长曲线和细胞周期分布无显著性
21、差异。基因表达谱及 Pathway 分析显示亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B 细胞系间存在多个差异表达基因，而凋亡、细胞周期通路在耐药的产生中可能起着重要作用。Caspase8 的表达受抑制可能是耐药细胞株产生耐药的重要因素之一。 第二部分硼替佐米敏感与硼替佐米耐药骨髓瘤细胞差异蛋白质组学研究 方法：提取 NCI-H929、NCI-H929B 两种细胞的蛋白，采用双向电泳及质谱鉴定技术，分析差异蛋白的表达情况。并选取其中部分差异蛋白，采用 western-blot 技术进行验证。留取临床患者原代标本，进行 western-blot 检测，进一步验证双向电泳结果，并分析差异蛋白与硼
22、替佐米耐药的相关性。 结果：通过双向电泳及质谱鉴定后共鉴定出 14 个差异蛋白，与亲本 NCI-H929 细胞相比，在 NCI-H929B 中上调的蛋白质点有 11 个，分别为 HSP75、 烯醇化酶、蛋白二硫化物异构酶 A3、磷酸化应激诱导蛋白 1、膜联蛋白 A1、脱氧核糖核酸酶 TATDN1、HSP-1、蛋白 DJ-1、微管蛋白 -6、角蛋白 KRT1、加帽蛋白 Z；下调的蛋白质点有 3 个，分别为腺苷高半胱氨酸水解酶、ATP 合成酶 亚单位和 Rho-GDP 解离抑制因子。通过 western Blot 技术检测了在 NCI-H929B 双向电泳中显示为高表达的蛋白 DJ-1，结果显示
23、NCI-H929B 中蛋白 DJ-1 表达水平增高。采用 CD138 磁珠分选技术获得 7 名 MM 患者的原代删细胞标本，通过 western Blot 技术检测显示硼替佐米耐药的原代删细胞标本中蛋白 DJ-1 表达水平高于硼替佐米敏感的原代MM 细胞。 结论：通过双向电泳技术显示在亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B 间存在多个差异表达的蛋白，western Blot 技术验证了其中一个在 NCI-H929B 中高表达的蛋白 DJ-1，结果显示 NCI-H929B 和耐药患者的原代 MM 细胞中蛋白 DJ-1表达水平增高，提示蛋白 DJ-1 的高表达可能与硼替佐米的耐药相关。目的
24、和意义： 多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是最为常见的血液系统恶性肿瘤之一，发生率占血液系统恶性肿瘤的 10左右，随着人口的老龄化，该病的发生率在我国呈逐年增高的趋势。目前，所有的治疗手段包括化疗、放疗、造血干细胞移植以及一些新型的分子靶向药物。但迄今为止 MM 仍是一种不可治愈性疾病。研究显示，蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib/PS-341，商品名 VElCADE(R)可诱导包括地塞米松、美法仑以及沙利度胺耐药删细胞在内的 MM 细胞产生凋亡，已在删的治疗中显示出了较好的疗效。其主要作用机制为通过靶向性作用于泛素-蛋白酶体系统，抑制核因子 B(nuclear
25、 factor-kappa B，NF-B)的活性以发挥抗肿瘤作用。 硼替佐米为哺乳动物细胞中26S 蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，化学名为：(1R)-3-甲基-1(2S)-1 氧-3-苯基-2-(吡嗪羧基)氨基丙基氨基丁基硼酸，分子式C19H25BN404，相对分子量 384.24。它是首个获美国 FDA 批准用于 MM 临床治疗的蛋白酶体抑制剂，具有特异性强效、高效的特点。Mateos 等报道，采用硼替佐米联合 MP(VMP 方案)治疗 60 例 65 岁及以上的老年初诊 MM 患者，总反应率为89，CR 率为 32，16 个月的无事件生存率(EFS)为 93；而历史对照的 MP方案总
26、反应率为 42，16 个月的 EFS 为 51。2008 年 NCCN 骨髓瘤诊疗指南中也推荐将 VD(硼替佐米+地塞米松)、PAD(硼替佐米+地塞米松邯可霉素)、MPV(美法仑+强的松+硼替佐米)用于初发及移植候选的 MM 患者。对于难治/复发的 MM 患者 2008 年 NCCN 指南中将硼替佐米单药及硼替佐米联合脂质体阿霉素作为类推荐，硼替佐米+地塞米松方案作为 2A 类推荐。 然而，硼替佐米尚不能根治 MM，且随着其临床应用范围的扩大和时间的推移，国内外临床研究已发现部分删患者对硼替佐米产生了耐药反应或在初期治疗有效的 MM 患者中出现耐药及疾病的复发，从而影响了硼替佐米的疗效。目前，
27、研究发现 MM 患者中硼替佐米耐药主要与 NF- B 途径、热休克蛋白及 BCL 蛋白家族的过表达现象有关。因此，继续寻找有效方案以预防耐药的发生或根除恶性浆细胞克隆，是目前研究的一个热点。 目前，国内外关于硼替佐米的耐药机制研究尚少，其耐药机制尚不明确。有研究国外分析了多药物耐药蛋白(MRP)在删细胞中的表达与硼替佐米诱导 MM 细胞凋亡间的相关性，研究显示 MRP3 和 MRP5 的表达不足以遏制硼替佐米诱导产生的凋亡作用，从而提示硼替佐米可能并非为多药耐药转运蛋白的底物。这就提示，硼替佐米的耐药不同于现有肿瘤治疗中经典的多药耐药。 因此，如果能建立硼替佐米耐药的 MM 细胞株，可以深入研
28、究硼替佐米可能的耐药机制，为临床应用蛋白酶体抑制剂治疗 MM，监测和避免治疗中耐药的发生提供实验依据；同时，为抗耐药药物的筛选提供细胞模型，以期达到逆转耐药提高疗效的目的。为此，本研究拟通过建立硼替佐米耐药的删细胞株，对其进行基因组学及差异蛋白组学的研究以期初步探讨其可能的耐药机制，为临床克服硼替佐米耐药提供细胞模型及实验依据。本研究包括以下两个部分： 第一部分硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及其基因表达谱研究 方法：采用浓度递增的方法自 MM 细胞系 NCI-H929 建立了硼替佐米耐药株 NCI-H929B。MTT 实验测得硼替佐米对亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B24h 的
29、IC50 值。流式细胞术分析两种细胞的细胞周期分布情况。提取 NCI-H929、NCI-H929B 两种 mRNA 分别变性及逆转录至 cDNA，进行基因表达谱分析。对基因表达谱数据，进行 GO-分析和Pathway-分析，从中发现可能与耐药相关的信号通路，及其相互激活关系。采用实时定量 PCR 技术，对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)进行验证。并选取 Caspase8 抑制剂进行干预，检测亲本 NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 变化情况。 结果：采用浓度递增法自 MM 细胞系 NCI-H929 建立了硼替佐米耐药株 N
30、CI-H929B。MTT 实验测得硼替佐米对亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B24h 的 IC50 分别为 20.7nmol/L 和 487.4nmol/L，耐药倍数为 23.5。流式细胞术分析显示亲本NCI-H929 和 NCI-H929B 的细胞周期分布无显著性差异。 提取亲本 NCI-H929、NCI-H929B 两种 mRNA 分别变性及逆转录至 cDNA，进行基因表达谱分析，结果显示与亲本 NCI-H929 相比，在 NCI-H929B 中有 317 个基因表达上调，而356 个基因表达下调。对基因表达谱数据，进行 GO-分析和 Pathway 一分析，从中发现可能与耐药
31、相关的信号通路，及其相互激活关系，结果提示凋亡通路、细胞周期等信号通路可能与硼替佐米耐药的产生相关。采用实时定量 PCR 技术，对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)进行验证。当候选基因在耐药株中表达/亲本细胞中表达1.5 时，则认为该基因为过表达，若是0.5 则判定该基因为低表达，结果显示在 NCI-H929B 细胞株中FADD、Casp8，MAP3K5 表达下调，而 Hsp86 表达上调。采用 Caspase8 抑制剂进行干预，检测亲本 NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 变化情况，结果显示加入抑制剂后，NCI-H929
32、细胞系对硼替佐米的 IC50 增高 4.37 倍。 结论：通过体外浓度递增法可建立蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药的 MM 细胞株。亲本NCI-H929 和 NCI-H929B 的生长曲线和细胞周期分布无显著性差异。基因表达谱及 Pathway 分析显示亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B 细胞系间存在多个差异表达基因，而凋亡、细胞周期通路在耐药的产生中可能起着重要作用。Caspase8 的表达受抑制可能是耐药细胞株产生耐药的重要因素之一。 第二部分硼替佐米敏感与硼替佐米耐药骨髓瘤细胞差异蛋白质组学研究 方法：提取 NCI-H929、NCI-H929B 两种细胞的蛋白，采用双向电泳及质谱鉴
33、定技术，分析差异蛋白的表达情况。并选取其中部分差异蛋白，采用 western-blot 技术进行验证。留取临床患者原代标本，进行 western-blot 检测，进一步验证双向电泳结果，并分析差异蛋白与硼替佐米耐药的相关性。 结果：通过双向电泳及质谱鉴定后共鉴定出 14 个差异蛋白，与亲本 NCI-H929 细胞相比，在 NCI-H929B 中上调的蛋白质点有 11 个，分别为 HSP75、 烯醇化酶、蛋白二硫化物异构酶 A3、磷酸化应激诱导蛋白 1、膜联蛋白 A1、脱氧核糖核酸酶 TATDN1、HSP-1、蛋白 DJ-1、微管蛋白 -6、角蛋白 KRT1、加帽蛋白 Z；下调的蛋白质点有 3
34、个，分别为腺苷高半胱氨酸水解酶、ATP 合成酶 亚单位和 Rho-GDP 解离抑制因子。通过 western Blot 技术检测了在 NCI-H929B 双向电泳中显示为高表达的蛋白 DJ-1，结果显示 NCI-H929B 中蛋白 DJ-1 表达水平增高。采用 CD138 磁珠分选技术获得 7 名 MM 患者的原代删细胞标本，通过 western Blot 技术检测显示硼替佐米耐药的原代删细胞标本中蛋白 DJ-1 表达水平高于硼替佐米敏感的原代MM 细胞。 结论：通过双向电泳技术显示在亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B 间存在多个差异表达的蛋白，western Blot 技术验证了
35、其中一个在 NCI-H929B 中高表达的蛋白 DJ-1，结果显示 NCI-H929B 和耐药患者的原代 MM 细胞中蛋白 DJ-1表达水平增高，提示蛋白 DJ-1 的高表达可能与硼替佐米的耐药相关。目的和意义： 多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是最为常见的血液系统恶性肿瘤之一，发生率占血液系统恶性肿瘤的 10左右，随着人口的老龄化，该病的发生率在我国呈逐年增高的趋势。目前，所有的治疗手段包括化疗、放疗、造血干细胞移植以及一些新型的分子靶向药物。但迄今为止 MM 仍是一种不可治愈性疾病。研究显示，蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib/PS-341，商品名 VElC
36、ADE(R)可诱导包括地塞米松、美法仑以及沙利度胺耐药删细胞在内的 MM 细胞产生凋亡，已在删的治疗中显示出了较好的疗效。其主要作用机制为通过靶向性作用于泛素-蛋白酶体系统，抑制核因子 B(nuclear factor-kappa B，NF-B)的活性以发挥抗肿瘤作用。 硼替佐米为哺乳动物细胞中26S 蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，化学名为：(1R)-3-甲基-1(2S)-1 氧-3-苯基-2-(吡嗪羧基)氨基丙基氨基丁基硼酸，分子式C19H25BN404，相对分子量 384.24。它是首个获美国 FDA 批准用于 MM 临床治疗的蛋白酶体抑制剂，具有特异性强效、高效的特点。Mateos
37、 等报道，采用硼替佐米联合 MP(VMP 方案)治疗 60 例 65 岁及以上的老年初诊 MM 患者，总反应率为89，CR 率为 32，16 个月的无事件生存率(EFS)为 93；而历史对照的 MP方案总反应率为 42，16 个月的 EFS 为 51。2008 年 NCCN 骨髓瘤诊疗指南中也推荐将 VD(硼替佐米+地塞米松)、PAD(硼替佐米+地塞米松邯可霉素)、MPV(美法仑+强的松+硼替佐米)用于初发及移植候选的 MM 患者。对于难治/复发的 MM 患者 2008 年 NCCN 指南中将硼替佐米单药及硼替佐米联合脂质体阿霉素作为类推荐，硼替佐米+地塞米松方案作为 2A 类推荐。 然而，硼
38、替佐米尚不能根治 MM，且随着其临床应用范围的扩大和时间的推移，国内外临床研究已发现部分删患者对硼替佐米产生了耐药反应或在初期治疗有效的 MM 患者中出现耐药及疾病的复发，从而影响了硼替佐米的疗效。目前，研究发现 MM 患者中硼替佐米耐药主要与 NF- B 途径、热休克蛋白及 BCL 蛋白家族的过表达现象有关。因此，继续寻找有效方案以预防耐药的发生或根除恶性浆细胞克隆，是目前研究的一个热点。 目前，国内外关于硼替佐米的耐药机制研究尚少，其耐药机制尚不明确。有研究国外分析了多药物耐药蛋白(MRP)在删细胞中的表达与硼替佐米诱导 MM 细胞凋亡间的相关性，研究显示 MRP3 和 MRP5 的表达不
39、足以遏制硼替佐米诱导产生的凋亡作用，从而提示硼替佐米可能并非为多药耐药转运蛋白的底物。这就提示，硼替佐米的耐药不同于现有肿瘤治疗中经典的多药耐药。 因此，如果能建立硼替佐米耐药的 MM 细胞株，可以深入研究硼替佐米可能的耐药机制，为临床应用蛋白酶体抑制剂治疗 MM，监测和避免治疗中耐药的发生提供实验依据；同时，为抗耐药药物的筛选提供细胞模型，以期达到逆转耐药提高疗效的目的。为此，本研究拟通过建立硼替佐米耐药的删细胞株，对其进行基因组学及差异蛋白组学的研究以期初步探讨其可能的耐药机制，为临床克服硼替佐米耐药提供细胞模型及实验依据。本研究包括以下两个部分： 第一部分硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及
40、其基因表达谱研究 方法：采用浓度递增的方法自 MM 细胞系 NCI-H929 建立了硼替佐米耐药株 NCI-H929B。MTT 实验测得硼替佐米对亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B24h 的 IC50 值。流式细胞术分析两种细胞的细胞周期分布情况。提取 NCI-H929、NCI-H929B 两种 mRNA 分别变性及逆转录至 cDNA，进行基因表达谱分析。对基因表达谱数据，进行 GO-分析和Pathway-分析，从中发现可能与耐药相关的信号通路，及其相互激活关系。采用实时定量 PCR 技术，对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86
41、)进行验证。并选取 Caspase8 抑制剂进行干预，检测亲本 NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 变化情况。 结果：采用浓度递增法自 MM 细胞系 NCI-H929 建立了硼替佐米耐药株 NCI-H929B。MTT 实验测得硼替佐米对亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B24h 的 IC50 分别为 20.7nmol/L 和 487.4nmol/L，耐药倍数为 23.5。流式细胞术分析显示亲本NCI-H929 和 NCI-H929B 的细胞周期分布无显著性差异。 提取亲本 NCI-H929、NCI-H929B 两种 mRNA 分别变性及逆转录至 cDNA，进行基因表达谱分
42、析，结果显示与亲本 NCI-H929 相比，在 NCI-H929B 中有 317 个基因表达上调，而356 个基因表达下调。对基因表达谱数据，进行 GO-分析和 Pathway 一分析，从中发现可能与耐药相关的信号通路，及其相互激活关系，结果提示凋亡通路、细胞周期等信号通路可能与硼替佐米耐药的产生相关。采用实时定量 PCR 技术，对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)进行验证。当候选基因在耐药株中表达/亲本细胞中表达1.5 时，则认为该基因为过表达，若是0.5 则判定该基因为低表达，结果显示在 NCI-H929B 细胞株中FADD、Cas
43、p8，MAP3K5 表达下调，而 Hsp86 表达上调。采用 Caspase8 抑制剂进行干预，检测亲本 NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 变化情况，结果显示加入抑制剂后，NCI-H929 细胞系对硼替佐米的 IC50 增高 4.37 倍。 结论：通过体外浓度递增法可建立蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药的 MM 细胞株。亲本NCI-H929 和 NCI-H929B 的生长曲线和细胞周期分布无显著性差异。基因表达谱及 Pathway 分析显示亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B 细胞系间存在多个差异表达基因，而凋亡、细胞周期通路在耐药的产生中可能起着重要作用。Caspase8
44、的表达受抑制可能是耐药细胞株产生耐药的重要因素之一。 第二部分硼替佐米敏感与硼替佐米耐药骨髓瘤细胞差异蛋白质组学研究 方法：提取 NCI-H929、NCI-H929B 两种细胞的蛋白，采用双向电泳及质谱鉴定技术，分析差异蛋白的表达情况。并选取其中部分差异蛋白，采用 western-blot 技术进行验证。留取临床患者原代标本，进行 western-blot 检测，进一步验证双向电泳结果，并分析差异蛋白与硼替佐米耐药的相关性。 结果：通过双向电泳及质谱鉴定后共鉴定出 14 个差异蛋白，与亲本 NCI-H929 细胞相比，在 NCI-H929B 中上调的蛋白质点有 11 个，分别为 HSP75、
45、烯醇化酶、蛋白二硫化物异构酶 A3、磷酸化应激诱导蛋白 1、膜联蛋白 A1、脱氧核糖核酸酶 TATDN1、HSP-1、蛋白 DJ-1、微管蛋白 -6、角蛋白 KRT1、加帽蛋白 Z；下调的蛋白质点有 3 个，分别为腺苷高半胱氨酸水解酶、ATP 合成酶 亚单位和 Rho-GDP 解离抑制因子。通过 western Blot 技术检测了在 NCI-H929B 双向电泳中显示为高表达的蛋白 DJ-1，结果显示 NCI-H929B 中蛋白 DJ-1 表达水平增高。采用 CD138 磁珠分选技术获得 7 名 MM 患者的原代删细胞标本，通过 western Blot 技术检测显示硼替佐米耐药的原代删细胞
46、标本中蛋白 DJ-1 表达水平高于硼替佐米敏感的原代MM 细胞。 结论：通过双向电泳技术显示在亲本 NCI-H929 和 NCI-H929B 间存在多个差异表达的蛋白，western Blot 技术验证了其中一个在 NCI-H929B 中高表达的蛋白 DJ-1，结果显示 NCI-H929B 和耐药患者的原代 MM 细胞中蛋白 DJ-1表达水平增高，提示蛋白 DJ-1 的高表达可能与硼替佐米的耐药相关。目的和意义： 多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是最为常见的血液系统恶性肿瘤之一，发生率占血液系统恶性肿瘤的 10左右，随着人口的老龄化，该病的发生率在我国呈逐年增高的趋势。目
47、前，所有的治疗手段包括化疗、放疗、造血干细胞移植以及一些新型的分子靶向药物。但迄今为止 MM 仍是一种不可治愈性疾病。研究显示，蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib/PS-341，商品名 VElCADE(R)可诱导包括地塞米松、美法仑以及沙利度胺耐药删细胞在内的 MM 细胞产生凋亡，已在删的治疗中显示出了较好的疗效。其主要作用机制为通过靶向性作用于泛素-蛋白酶体系统，抑制核因子 B(nuclear factor-kappa B，NF-B)的活性以发挥抗肿瘤作用。 硼替佐米为哺乳动物细胞中26S 蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，化学名为：(1R)-3-甲基-1(2S)-1 氧-3-苯
48、基-2-(吡嗪羧基)氨基丙基氨基丁基硼酸，分子式C19H25BN404，相对分子量 384.24。它是首个获美国 FDA 批准用于 MM 临床治疗的蛋白酶体抑制剂，具有特异性强效、高效的特点。Mateos 等报道，采用硼替佐米联合 MP(VMP 方案)治疗 60 例 65 岁及以上的老年初诊 MM 患者，总反应率为89，CR 率为 32，16 个月的无事件生存率(EFS)为 93；而历史对照的 MP方案总反应率为 42，16 个月的 EFS 为 51。2008 年 NCCN 骨髓瘤诊疗指南中也推荐将 VD(硼替佐米+地塞米松)、PAD(硼替佐米+地塞米松邯可霉素)、MPV(美法仑+强的松+硼替
49、佐米)用于初发及移植候选的 MM 患者。对于难治/复发的 MM 患者 2008 年 NCCN 指南中将硼替佐米单药及硼替佐米联合脂质体阿霉素作为类推荐，硼替佐米+地塞米松方案作为 2A 类推荐。 然而，硼替佐米尚不能根治 MM，且随着其临床应用范围的扩大和时间的推移，国内外临床研究已发现部分删患者对硼替佐米产生了耐药反应或在初期治疗有效的 MM 患者中出现耐药及疾病的复发，从而影响了硼替佐米的疗效。目前，研究发现 MM 患者中硼替佐米耐药主要与 NF- B 途径、热休克蛋白及 BCL 蛋白家族的过表达现象有关。因此，继续寻找有效方案以预防耐药的发生或根除恶性浆细胞克隆，是目前研究的一个热点。 目前，国内外关于硼替佐米的耐药机制研究尚少，其耐药机制尚不明确。有研究国外分析了多药物耐药蛋白(MRP)在删细胞中的表达与硼替佐米诱导 MM 细胞凋亡间的相关性，研究显示 MRP3 和 MRP5 的表达不
