1、总论： 概论1885 年巴斯德发明了狂犬病疫苗。1796 年英国医生 Jenner 得出结论：牛痘可能使人预防天花。OIE 通报猪病：非洲猪瘟、古典猪瘟、尼帕病毒性脑炎、猪囊尾蚴病、猪繁殖与呼吸综合征、猪水泡病、猪传染性胃肠炎。OIE-世界动物卫生组织(国际兽医局)。乌干达古卢区“埃博拉”大爆发，污血顺着眼睛、鼻子、耳朵、嘴巴、肛门往外涌，埃博拉出血热。马尔堡病，一种出血热病，最后表现为皮肤、内脏乃至全身的出血。我国一类动物病原微生物：口蹄疫病毒；高致病性禽流感病毒；猪水泡病病毒；非洲猪瘟病毒；非洲马瘟病毒；小反刍兽疫病毒；牛瘟病毒；牛海绵状脑病病原；病病原；牛传染性胸膜肺炎。1898 德国兽
2、医微生物学家 Loeffler 和 Frosch 报道口蹄疫病毒，发现了动物和人类的第一个病毒，是微生物学发展史上的重要里程碑。病毒：形体微小，结构简单，仅含有 1 种核酸 DNA 或 RNA，具有超级寄生性，且必须在电子显微镜下才能观察到的一类非细胞形态的微生物。丝状支原体病毒的研究方法：活体寄主系统，细胞培养方法；血清学/免疫学方法；超结构研究；分子生物学。微生物基因组的特点：染色体结构：多为一条环状闭合双链 DNA基因组大小：从 0.16-13Mb编码序列：占基因组总长度的 90%，平均为 1Kb 左右GC 含量：16.6%-74.9%DNA 链组成的非对称分布：基因方向性偏好、密码子使
3、用偏好。超结构研究：物理学 化学：胶膜，超速离心机，分光光度计，电泳技术；X 晶体衍射技术，核磁共振，荧光标记。电子显微镜：TEM，SEM，免疫电镜技术。最早发现的病毒：烟草花叶病毒。高致病性病毒隔离带（疫区）：以疫情发生点为中心半径 3 公里、受威胁区：半径五公里基因工程：杆状病毒载体：杆状病毒为环状双股 DNA，有棒状包膜病毒颗粒，核内复制。具有高度特异宿主，可引起昆虫流行病，对人和动植物无害等特点动物病毒载体：质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核 DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质
4、粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒 SV40（Simian Virus 40） 、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等噬菌体载体：用感染大肠杆菌的 噬菌体改造成的载体应用最为广泛。利用 噬菌体作载体，主要是将外来目的 DNA 替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。 病毒的结构和复制病毒的大小：测量病毒的单位为纳米(nm)，一般病毒大小在 100nm 左右。病毒的结
5、构：（最具有代表性的是烟草花叶病毒）1、核衣壳（基本结构）芯髓（核酸）基因组：DNA/RNA、双股/单股、分段/不分段；衣壳壳粒（形态亚结构）：多肽（结构亚单位） ；2、囊膜（非基本结构）：有纤突。 （一般分为有囊膜的 20 面体对称无有囊膜的螺旋状对称：流感病毒无，除痘病毒外，所有 DNA病毒均为 20 面体）噬菌体六类形态：蝌蚪状（dsDNA）：收缩性尾非（长、短尾） ；球状（无尾）：大顶衣壳粒（ssDNA）小（ssRNA） ；丝状（无头，ssDNA） 。病毒粒子(virion)：熟的（结构完整） 、具有侵染力的单个病毒，又称病毒颗粒(virus particle)。蛋白质：非结构蛋白：指
6、由病毒基因组编码的，在病毒复制或基因表达调控过程中具有一定功能，但不结合于病毒颗粒中的蛋白质。 （作用：复制酶:与致病相关的酶或蛋白 :流感,副流感病毒的 HN, 疱疹病毒的 TK 酶,轮状病毒的类似肠毒素蛋白等；多聚酶；调控蛋白:乙肝病毒 X 蛋白等）结构蛋白：系指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质。包括壳体蛋白和囊膜蛋白等。（作用：构成蛋白质外壳，保护病毒核酸免受核酸酶及其它理化因子的破坏；决定病毒感染的特异性，与易感细胞表面存在的受体具特异性亲和力，促使病毒粒子的吸附和入侵；决定病毒的抗原性，能刺激机体产生相应的抗体；构成毒粒酶，或参与病毒对宿主细胞的入侵（如 T4 噬菌
7、体的溶菌酶等） ，或参与病毒复制过程中所需要病毒大分子的合成（如逆转录酶等） 。 ）壳体蛋白：构成病毒的壳体，保护病毒的核酸。无囊膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入，决定病毒的宿主嗜性，同时还是病毒的表面抗原。囊膜蛋白：是病毒的主要表面抗原，它们与细胞受体相互作用启动病毒感染发生，有些还介导病毒的进入；还可能具有凝集脊椎动物红血球细胞、细胞融合以及酶等活性；基质蛋白构成膜脂双层与核衣壳之间的亚膜结构，具有支撑囊膜、维持病毒。病毒脂类存在与病毒的吸附和侵入有关(由病毒粒子在细胞内成熟，在细胞膜处以出芽方式释放，直接从寄主细胞膜上得到)。包涵体（本质：大多数是病毒粒子组成的，少数是细胞对病毒的反
8、应）：感染病毒的宿主细胞内，出现在光学显微镜下可见的大小、形态、数量不等的小体（形成部位：位于细胞核内如疱疹病毒； 位于细胞质内 如狂犬病毒等； 胞核内胞质都有麻疹病毒；性质：病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的Negri 氏体。大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体。细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体）合胞体：细胞感染病毒后导致感染细胞和相邻的细胞发生膜融合，成为多核的巨噬细胞。膜融合由病毒的融合蛋白和细胞表面的其他蛋白介导发生。噬菌斑(plaque)：在宿主细菌的菌苔上，噬菌体使菌体裂解而形成的空斑。 （空斑：动物细胞被病毒侵染后的死细胞群落；病斑：动物细胞受肿瘤病毒感染后细胞剧
9、增形成的病灶；枯斑：植物叶片上的植物病毒群体） 。病毒在活细胞内，以其基因为模板，在酶的作用下，分别合成病毒基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称为复制（replication)。从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制和病毒蛋白合成，至释放出子代病毒的全过程，称为一个复制周期吸附 adsorption：静电吸附：病毒体与细胞接触，进行静电结合。非特异性、可逆。真正的吸附：病毒体表面位点（蛋白质结构）与宿主细胞膜上相应的受体结合。是决定病毒感染的真正开始。 穿入 penetration：无囊膜的病毒，一般经过细胞膜吞入，称为病毒胞饮,如腺病毒、小 RNA 病毒等；也有核衣壳和细胞膜融合
10、后，病毒核酸进入细胞质中，如乳头瘤病毒有囊膜的病毒，囊膜与宿主细胞膜融合，病毒的核衣壳直接进入细胞浆内； 病毒胞饮: 细胞膜吞入。脱壳 uncoating：不同病毒脱壳方式不一，多数在宿主细胞溶酶体酶作用下脱壳，释放出基因组核酸。生物合成biosynthesis（吸附,穿入,脱壳,转录 mRNA,翻译早期蛋白,复制病毒 DNA,转录 mRNA,翻译晚期蛋白,病毒粒子组装）病毒基因组一旦从衣壳中释放后，就利用宿主细胞提供的低分子物质合成大量的病毒核酸和结构蛋白。早期，病毒复制合成所必需的复制酶和一些抑制蛋白。生物合成阶段，病毒处于隐蔽期。 （过程dsDNA:与细胞相同，不需要携带酶siDNA:先
11、合成双链 DNA，）(+)RNA:基因组就是mRNA(-)RNA:先合成正链 RNA dsRNA:基因组 RNA 在不完全解体病毒颗粒中合成 mRNA 逆转录病毒(本质为(+)RNA 的二倍体)正链RNA 通过逆转录酶产生()DNA 整合到宿主染色体上，并在逆转录过程中提供引物 tRNA）病毒复制的时序性：早期转录的作用：早期蛋白主要参与病毒核酸复制、调节病毒基因组表达及改变或抑制宿主细胞大分子合成；晚期转录的作用：主要表达构成子代毒粒所需的结构蛋白。组装：病毒核酸与衣壳装配在一起，形成病毒子。绝大多数 DNA 病毒均在细胞核内组装，RNA 病毒和痘病毒在细胞浆内组装。释放：绝大多数无囊膜病毒
12、释放，一次同步，破坏宿主细胞膜，细胞迅速死亡。绝大多数有囊膜病毒以出芽方式释出时包上细胞核膜或细胞膜而成为成熟病毒。逐个释出，非一次同步，细胞死亡缓慢。病毒的遗传与变异感染比（multiplicity of infection, MOI）一个系统中感染病毒的细胞数与细胞总数之比。基因转移（gene transfer)：外源性遗传物质由供体菌进入受体菌细胞内的过程；重组(recombination)：两个有亲缘关系但生物学性状不同毒株感染同一个宿主细胞从而发生核酸水平上的互换并产生兼有两亲本特性子代的过程。主要方式转化、转导、接合。准种：由一种母序列和来自该序列的大量突变基因组所组成的病毒群体。
13、缺损型干扰（defective interfering， DI）突变株：自身不能复制,只有在亲本野生株作为辅助病毒存在时才能复制,但又干扰亲本病毒的复制,导致后者数量减少（含正常的衣壳蛋白质；只含有正常基因组的一部分；只能在正常同源病毒同时存在时才能繁殖,这时同源病毒成为辅助病毒(helper virus)；特异性地干扰同源病毒的繁殖,经连续传代后,DI 颗粒增多）重配(reassortment)：两个进化相近的毒株感染同一细胞时，两者发生基因交换而产生的稳定或可变的毒株。病毒进化三观点：粘液瘤病毒与宿主的共同进化；甲型流感病毒的抗原性转移以及漂移。毒力变异的分子基础：HA 富含碱性氨基酸，裂
14、解为 HA1 和 HA2，暴露融合肽段，通过融合进入宿主细胞；高致病力毒株 HA 的切割位点有多个氨基端毗连，决定该病毒可被机体大多数组织细胞的蛋白酶裂解。低致病力的裂解位点均只有一个单一的碱性氨基酸精氨酸，只能被胰蛋白酶切割，存在于消化道和呼吸道；NA 26 个氨基酸的缺失及 PB2 蛋白氨基酸的突变也影响病毒的毒力。病毒基因产物间的相互作用：补偿作用（complementation）：感染的细胞中，病毒蛋白质之间由于相互作用的结果，拯救了一种或两种病毒或增加了病毒的产量。表型混合（phenotype mixing）：两种病毒混合感染后，一个病毒的基因组偶尔装入另一病毒的衣壳内，或装入两个病
15、毒成分构成的衣壳内，发生表型混合。基因型混合（Genotype mixing）：两种病毒的核酸偶尔混合装在同一病毒衣壳内，或两种病毒的核衣壳偶尔包在一个囊膜内，但它们的核酸都未重组合，所以没有遗传性。病毒的变异研究方法：点阵图；进化树病毒免疫（细胞免疫为主，体液免疫也存在）物理屏障：皮肤（ 角质蛋白）粘膜(呼吸系统:纤毛，粘液，哨兵细胞；胃肠道:唾液，胃肠道消化酶类，PH；泌尿生殖系统:层状上皮组织；眼:大量高盐分泌液）天然免疫系统: 专职吞噬细胞; 补体系统蛋白;干扰素;自然杀伤细胞。干扰素：由病毒或其他干扰素诱生剂刺激机体细胞所产生的一种具有抗病毒等作用的糖蛋白。干扰素的来源 -干扰素产自
16、人的白细胞，抗病毒性强，在抗肿瘤和免疫调节方面弱-干扰素产自人的成纤维细胞，抗病毒性强，在抗肿瘤和免疫调方面弱-干扰素产自 T 细胞，在抗肿瘤和免疫调节方面强，抗病毒性弱。宿主防卫机制特点：1.识别自身与非自身 2.特异性 3.免疫记忆。 （功能:1.抵抗感染 2.自身稳定 3.免疫监视）NK：位于骨髓的造血干细胞的淋巴样干细胞分泌 非 T 非 B 淋巴细胞，其活化 不需要事先接触抗原 干扰素和抗体刺激 NK 细胞增强其活性 对感染细胞的识别主要依赖于 MHCI 类分子，和结合了 IgG 的受体细胞 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 (ADCC) 获得性免疫缺陷：对病毒的初次感染需要 1-2 周
17、大多数病毒不具备被天然免疫系统细胞受体识别的危险信号获得性免疫系统在幼体和年老动物体内薄弱。病毒的感染病毒感染：在具备病毒成立感染条件下病毒能被易感细胞所接受，并在其中持续或非持续生存。 （分为急性、持续性、继发性和混合性感染）病毒对机体的感染：细胞损伤（杀细胞感染）因免疫系统激活或抑制产生的损伤（抑制非特异性免疫，可使呼吸道粘膜纤毛清除能力及巨噬细胞吞噬能力下降，使体液中补体、溶菌酶等抗菌物质减少，降低机体抵抗力；抑制特异性免疫，造成淋巴器官萎缩、周围淋巴细胞减少及功能抑制、抗体形成抑制；抑制免疫监视功能，动物实验表明免疫抑制物可使植入肿瘤细胞的成瘤率增加。 ）病毒感染引起的细胞转化（细胞发
18、生遗传性改变而导致细胞永生化的转变方式，直接涉及细胞 DNA 或基因发生改变，这种变化可稳定的遗传下去，可代代相传，致使细胞的一系列生物学特性、生长特点都随之发生改变）细胞损伤的类型：1.形态的改变（疱疹病毒，痘病毒感染细胞，微丝数量明显减少；呼肠孤病毒引起微毛细小血管壁的中间纤维解聚）2.细胞的脱落，裂解（痘病毒、小 RNA 病毒）3.膜的融合 4.膜通透性变化，过量的钠离子的流入 5.合胞体和包涵体 6.激发细胞凋亡（细胞内部程序激活而发生的自杀性死亡） 。细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)：由病毒感染导致的细胞损伤。CPE 能在光学显微镜下观察。常见的细胞形态学变
19、化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。半数组织细胞感染量（tissue culture infectious dose 50, TCID50）能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力。分子模拟（molecular mimicry）是指宿主细胞成分与病毒蛋白质之间存在分子结构的线性或者构象的同源性。判断病毒对宿主动物的杀伤性：依照病毒的受体细胞的类型以及病毒本身的生物合成过程来综合判断。感染种类：持续性感染（persistent infections） ；潜伏感染（latent ） ；长程感染（slow ） ；迟发性临床症状的急性感染（a
20、cute with late clinical manifestiations） 。细胞的凋亡：由于细胞内部程序激活而发生的自杀性死亡。细胞坏死是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，最后细胞破裂。另外坏死的细胞裂解要释放出内含物，并常引起炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。病毒的检测分离与鉴定：标本采集杀灭杂菌(青链霉素) 接种(易感动物出现病状鸡胚病变或死亡细胞培养细胞病变)鉴定病毒种型(大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感（结核杆菌对青霉素不敏感）
21、 ；而革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中的流行性脑膜炎双球菌和淋病双球菌对青霉素敏感） ，而对链霉素、氯霉素等敏感)。病料的采集与准备 采集部位：一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪便等，采样因动物及病毒的种类而异。犬细小病毒或轮状病毒腹泻的幼犬或犊牛: 粪便；口蹄疫的猪或牛:水泡液及水泡皮；流感病毒: 拭子 肺脏。处理：采集的器官或组织样本如肺脏、脑、肝、脾、淋巴结等，可取一小块进行充分研磨，加入含青、链霉素的Hanks 液，离心取上清液作为接种物。病毒的分离与培养：病毒严格细胞内寄生，培养病毒必须使用细胞。实验动物、鸡胚都拥有大量活的细胞，可用于病毒培养。尤其是 SPF
22、动物或 SPF 鸡胚，目前仍然经常供培养病毒之用，但是发展最快的技术是细胞培养。细胞培养的类型：原代细胞（primary cell）对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。 二倍体细胞株（diploid cell strain）将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。传代细胞系（established cell line）来源于肿瘤组织或转化的细胞，染色体数目不正常，为异倍体。HeLa（人子宫癌细胞） 、Vero（非洲绿猴肾细胞） 、BHK-21（乳仓鼠肾细胞） 、PK-15（猪肾细胞）等，并有专门机构负责鉴定和保管，如 ATCC 等
23、。细胞培养的一般流程：取动物的组织将组织剪碎胰蛋白酶消化剪碎的组织细胞培养。细胞培养器材：细胞培养瓶、细胞培养板；液氮罐、冰箱、冰柜；酸缸；超净台；co2 培养箱；不锈钢滤器及滤膜。培养基的状态：液体培养液（动物细胞生活的液体环境） 。成分：葡萄糖（满足能量需求、作为细胞碳源） ；氨基酸（合成蛋白质） ；无机盐（重要的细胞组成物质） ；维生素、动物血清等 （生长调节作用）条件：恒温（ 动物细胞生长温度） ；无菌条件（防止微生物污染） ；一般还需要一定浓度的二氧化碳。血清的作用：（1）提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。 （2）提供可识别金属、激素、维生素
24、和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而起到稳定和调节上述物质的作用。此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。 （3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子。 （4）提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。 （5）提供 PH 缓冲物质，调节培养基 PH。 （6）影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、渗透压和气体传递速度等。培养的方法：静置培养（stationary culture） 封闭，静置于恒温箱内，数天后细胞可生成贴壁的单层细胞。旋转培养（roller culture）不同之处是要培养的细胞不是静置，而是使之不断缓慢旋转（510r/h） ，经过一段
25、时间，细胞可在培养瓶（管）的四壁长满单层。悬浮培养（suspensive culture）通过搅拌使细胞处于悬浮状态生长或维持存活。 （适用于某些不需要贴壁生长的细胞系，如 NS-1（一种骨髓瘤细胞系） ，或作某种特殊研究之用。 ）微载体培养（micro-carrier culture）是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。 （微载体是直径 10035m 微小颗粒，对细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常规方法大为增加，对规模化的细胞或疫苗生产很有吸引力，虽则增高了生产成本。 ）细胞培养的应用范畴：（1）生产有重要价值的蛋白质产品分泌性的蛋白
26、质产品（2）培养皮肤细胞用于移植形成组织（3）检测有毒物质致癌致畸引起染色体目和结构改变（4）理论研究:培养正常或异常细胞用于生理、病理、药理研究(5) 病毒的分离鉴定。 （猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或二倍体细胞等培养；PRRSV 仅在猪肺巨噬细胞、Marc-145 细胞及非洲绿猴肾细胞系 MA-104 生长；PCV 常用 PK15 细胞培养）鸡胚接种：依据不同的病毒种类，选择适当的接种途径，通常接种尿囊腔（如新城疫病毒等）特殊情况可接种包括卵黄囊、绒毛尿囊膜和羊膜腔等（如鸡痘病毒接种绒尿膜）病毒的理化特性测定：病毒核酸型鉴定是病毒理化特性测定的最主要指标；代谢抑制法，即添加
27、氟脱氧尿核苷（FUDR）病毒复制被抑制者，即为 DNA 病毒，否则为 RNA 病毒； DNA 酶或RNA 酶分别作用，以判定核酸的性质；绿豆芽酶（Mung bean nuclease）可降解单股核酸，用它可进一步鉴定核酸是单股或双股；直接用纯化的病毒核酸通过电子显微镜观察；PCR 核酸测序技术。脂溶性试验：用乙醚或氯仿处理待检病毒液，而后与未处理者比较其 TCID50的变化，以判断是否敏感,从而判定是否为有囊膜病毒。空斑试验：病毒样本接种吸附于单层细胞；细胞上覆盖一层含营养液的琼脂；感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞形成空斑或蚀斑（plaque） ；空斑形成单位（PFU） ；仅计数含 20-1
28、00 个空斑的培养板。 终点稀释法（Endpoint dilution assay）用于测定几乎所有种类的病毒滴度，包括某些不能形成空斑的病毒，并可用以确定病毒对动物的毒力或毒价。使用细胞培养，可通过 CPE 来判定组织培养半数感染量（TCID50） 。病毒颗粒的检测：直观的方法是用电子显微镜（扫描、透视） （Electron microscopy，EM）观察病毒颗粒。一些含毒量高的病毒样本，如粪样、鼻拭子浸液或组织匀浆液，可用 EM 检出病毒。可用磷钨酸盐等重金属盐直接作负染而后观察，器官组织样本则须作超薄切片后再作负染观察。前者适用于观察病毒的表面结构如口疮病毒等，后者则可观察细胞内的病毒
29、结构，如冠状病毒、反录病毒在组织中出芽的病毒颗粒等。血凝试验（Hemagglutination assay）：许多动物病毒，如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成员，能够凝集某些种类动物（如鸡、小鼠、豚鼠、人）的红细胞。这些病毒含有可与红细胞结合的蛋白质，如禽流感病毒的囊膜上有一种称为血凝素的糖蛋白，可与红细胞表面的 N 乙酰神经氨酸糖蛋白结合，引起红细胞凝集。利用这种特性，可作血凝试验来检测这些病毒的存在。血清学检测：病毒中和试验（Virus neutralization）：针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗体与病毒结合后可以中和病毒的感染性。（中和抗体：可与细菌毒素、病原体(如病毒)及
30、其产物特异性结合并发挥中和作用的抗体。能中和毒素的毒性作用或阻断病毒感染靶细胞。 ）病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或动物上进行，一般将抗体作稀释，与一定量的病毒混合，然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的残余感染性。终点是以抑制细胞病变（细胞培养）或病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀释度来表示。中和试验具有很强的特异性，是检测病毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法，也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体。补体结合试验（Complement fixation）：补体结合试验可以用于检测动物血清中的病毒抗体。病毒抗原与抗体的相互反应可以引起补体结合，最终可导致膜溶解。在补体结合试验中，利用红细胞作为
31、靶细胞，溶血系统作为指示系统，因红细胞膜的溶解易于观察到。如果存在抗体抗体结合反应，补体结合将发生，后者利用加入结合红细胞抗体（溶血素）的绵羊红细胞可以检测到。如果补体被病毒抗原抗体复合物结合，则红细胞仍然是完整的；相反，如果补体未被结合，红细胞将在游离的补体的作用下被溶解。酶联免疫吸附试验（ELISA）：酶联免疫吸附试验可用于样本中病毒的检测和动物血清中病毒特异性抗体的检测，检测病毒抗原可采用夹心法和双夹心法，检测抗体可采用间接法。病毒核酸的检测：PCR 原理：设计 PCR 引物，检测目的片段的大小，DNA 测序，比对已知病毒序列。RT-PCR：主要适用于 RNA 病毒的检测，也可用于对 D
32、NA 病毒等的转录水平的检测。核酸杂交（Nucleic acid hybridization）包括 DNA 杂交和 RNA 杂交。前者即Southern blot hybridization，用于检测病毒 DNA。RNA 杂交 即 Northern blot hybridization，用于病毒 RNA 的检测，基本过程与DNA 杂交相似。核酸杂交技术可用于细胞、组织中病毒基因组或转录本的定位检测，称为原位杂交（in situ hybridization） 。DNA 芯片（DNA microarray chip）：将病毒 DNA 片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片）的表面，组成密集二维分子排
33、列，然后与已标记的待测样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而可检测样品中靶分子的数量。病毒感染的预防和治疗抗病毒药物产生过程：确定某一病毒靶点(了解其作用机制)检测化合物的抗病毒效应(细胞培养)治疗效果(动物实验)生产试制 (核算成本)抗病毒药物。分类：抗病毒类化合物；干扰素和免疫增强剂；中草药(黄芪)。 （金刚烷胺（Amantadine ）：能特异性地抑制甲型流感病毒，干扰病毒进入细胞，阻止病毒核酸的释放和抑制病毒装配，从而影响病毒的复制。利巴韦林（病毒唑，Ribavirin, Virazole ）：为鸟苷类似
34、物，进入细胞后磷酸化为三氮唑核苷单磷酸，能竞争性的抑制多种细胞酶，阻断鸟苷单磷酸的合成，因而抑制多种RNA、DNA 病毒的复制。原理：以合成的异常嘧啶（嘌呤）取代病毒 DNA 前体的胸腺嘧啶，病毒 DNA 合成时，异常嘧啶即参入到子代DNA 中，阻止子代病毒基因结构的合成和表达，从而抑制病毒的复制或复制出失去感染性的病毒） 疫苗分类：减毒活疫苗；灭活疫苗；基因工程疫苗；核酸疫苗（DNA 和 RNA 疫苗） ；其他类型疫苗。活苗：病原微生物毒力减弱或丧失，但仍保持良好的免疫原性，用该种活的、变异的病原微生物制成的疫苗，称为活苗或弱毒苗。优点：体内短期繁殖，使用剂量小，免疫力强，成本低，不需佐剂。
35、缺点：有排毒危险或组织反应，难以制成联苗，运输和贮存较困难，冷冻保存。灭活苗（死苗）：选用免疫原性强的细菌、病毒等经人工培养后用理化方法将其杀死（灭活）后制成的疫苗。优点：安全易保存，容易制成联苗和多价苗。缺点：不能在体内增殖，产生免疫速度慢。常需多次免疫，使用剂量大，可能有毒性，引起局部肿胀。核酸疫苗（DNA 和 RNA 疫苗）：由载体（质粒 DNA）和编码病原体某种抗原的cDNA 或 mRNA 组成。优点：便于制备、储存与运输，可诱生细胞免疫和体液免疫且维持时间长。不足：效果不很稳定，用于人体，需较极大剂量，且需考虑安全性。其他类型疫苗：模拟病毒表位的合成肽疫苗、表达多种抗原表位的联合多价
36、疫苗等。噬菌体与阮病毒感染周期：噬菌体从吸附细菌到子代噬菌体从宿主细菌细胞中放出来的过程。T-系噬菌体：T-系噬菌体是研究的最广泛而又深入的细菌噬菌体，按发现的先后顺序进行从 T1-T7编号。烈性噬菌体（virulent phage）：感染细胞后,能在寄主细胞内增殖，产生大量子代噬菌体并引起细菌裂解的噬菌体。温和噬菌体（temperate phrage）：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（插入）到宿主的核 DNA 上，并且可以随宿主 DNA 的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。病毒的核心是核酸，决定病毒遗传、变异和复制；衣壳和囊膜的作用是保护、介导、抗原性。溶源性细菌
37、重要特性：免疫性：由于溶源性细菌产生一种阻遏蛋白（ I ） 。这种阻遏蛋白不但可抑制原噬菌体 DNA 复制。也可抑制再度感染的同类噬菌体 DNA 的复制。故能抵抗同类噬菌体的超感染。可诱导性：原噬菌体的自发诱导，每一代可能有 1/10000 溶源性细菌被裂解，释放出大量噬菌体（裂解周期）噬菌现象：液体培养基：混浊、澄清；固体培养基中，出现噬斑（plaque） ；一定体积内的噬斑形成单位数目（pfu）亚病毒是比真病毒更小更简单的一类单分子病毒的总称。类病毒：至今所知的最小、最简单的病毒；仅含一种成分 单链环状 RNA；能在敏感细胞内自我复制，不需要辅助病毒。卫星病毒是指一些必须依赖辅助病毒进行复
38、制的病毒；含小分子单链 RNA 片段 ；本身对辅助病毒的复制不是必须的；存在卫星病毒和拟病毒两种类型。朊病毒：可以引起同种或异种蛋白质构象改变而致病或功能改变的呈杆状颗粒的蛋白质。 （潜伏期长） 。病例：瘙痒病、疯牛病。为何对紫外线敏感：紫外线可使核算周围碱基形成二聚体。四个方面：能侵染动物宿主细胞：疾病局限于一种宿主在宿主细胞内复制：“蛋白质构象致病假说”：朊病毒蛋白有两种构象：细胞型（正常型 PrPc）和瘙痒型（致病型 PrPsc） 。两者的主要区别在于其空间构象上的差异。PrPc 仅存在 a 螺旋，而 PrPsc 有多个 折叠存在，后者溶解度低，且抗蛋白酶解；Prpsc 可胁迫 PrPc
39、 转化为 Prpsc，实现自我复制，并产生病理效应；基因突变可导致细胞型 PrPc 中的 螺旋结构不稳定，至一定量时产生自发性转化， 片层增加，最终变为Prpsc 型，并通过多米诺效应倍增致病。小分子量、无免疫性：比已知的最小的常规病毒还小得多（约 3050nm） 。电镜下观察不到病毒粒子的结构，且不呈现免疫效应，不诱发干扰素产生，也不受干扰作用。疏水蛋白质：紧密地与细胞膜的脂类相结合。化学特性：对蛋白酶、氨基酸化学修饰剂( 碳酸二乙酯) 、变性剂 (尿素、十二烷其硫酞钠等)敏感；蛋白质越纯 其侵染性越强；分子量：2730 kDa；电镜下呈杆状直径为 25nm 长为 100200nm 丛状排列
40、(达 100 个)。结构：电镜下呈杆状颗粒，直径 25nm，长 125150nm；杆状颗粒呈丛状排列，每丛从几十至上百；蛋白质分子量为 2.7 万3 万，无免疫原性。致病性：导致动物中枢神经系统退化、紊乱等疾病；使动物出现 脱毛、皮肤骚痒、失去平衡和后肢麻痹等症状；可以传染给人类。引起的人的疾病：Kuru 病(人海绵状脑病)：进行性小脑退行性疾病。本病以寒战样震颠为突出的临床表现而得名。 各论 口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease viruses, FMDV）概述：最早发现的人和动物病毒；偶蹄兽易感，口、鼻、蹄部和乳房皮肤出现水疱和溃烂；通过消化道和呼吸道均可感染，空气是一
41、种重要的传播媒介。绵羊是 FMDV 的储存器，猪是感染的放大器，牛是发病的指示灯。牛、猪、羊感染后，症状最明显的是牛、最不明显的是羊，而感染后排毒最强的是猪。类属：属微 RNA 病毒科口蹄疫病毒属成员，有 7 个血清型和 65 个以上的亚型。是引起多种动物发生口蹄疫的病原。结构：病毒颗粒呈球形，二十面体对称，无囊膜，核酸类型为单股正链 RNA，长 2.62um，呈细丝状，有感染性，并能起rRNA 作用。病毒在胞浆内增殖。感染：对上皮细胞有极强的组织嗜性。自然感染初期上呼吸道，复制发生咽和软鄂背部的上皮，次级位点在体内上皮细胞。受体的介导的吞噬模型：粒子表面识别位点和受体位点结合-邻近多个受体，
42、胞膜内陷，吞噬-吞噬小泡与核内体结合-融合溶酶体-衣壳膨胀-VP1 伸展-颗粒形成孔状结构-RNA 溢出。致病：病毒进入后维持细胞凋亡的动态平衡和逃避宿主的免疫系统。致病机理：抑制宿主细胞蛋白的合成；降解多聚蛋白；病毒合成相关酶；与胞膜的结合相关,引导复制开始，包装信号。抵抗力：病毒对酚类、酒精等消毒剂抵抗力较强，但对碱类消毒剂极敏感。12%氢氧化钠或氢氧化钾、30%草木灰、4%碳酸钠、12%甲醛可用于环境消毒；紫外线能杀灭病毒，但仍保持其抗原性和吸附细胞的能力。直接阳光照射和于燥能很快杀死病毒，但在组织块和污染的饲料、垫草、被毛及土壤中能保存感染性达数周至数月之久；病毒在低温下可长期保存，在
43、冰冻情况下，骨髓中病毒能存活 70d，血中病毒能存活 4-5个月，肉中病毒能存活 3040d。传播途径：直接接触和间接接触传播均。主要经消化道传播；可经损伤的粘膜（口、鼻、眼、乳腺）和皮肤；呼吸道传播：呼吸入受污染的空气。症状：良性口蹄疫：口蹄疫一般取良性经过，约经 1-3 周即可痊愈，病死率很低，一般不超过 1-3%恶性口蹄疫：该型病例 FMDV 可侵害心肌、病畜全身症状明显、全身虚弱、肌肉发抖、特别是心跳加快、心律不齐、心肌麻痹、站立不稳、行走摇晃、倒地死亡，成年动物病死率高达 40-100%。其他病变特点：虎斑心：恶性口蹄疫的病例心肌变性、麻痹，剖检可见色泽似虎皮的病变，其以左、右心室平
44、切面最明显；心内膜、心外膜、真胃有出血小点。诊断：病毒分离：采集病舌面或蹄部水泡皮或水泡液。甘油、抗生素、缓冲液以及病料-离心-接种 实验动物：乳鼠敏感。 细胞培养：BHK-21（幼仓鼠肾细胞）高度敏感血清学试验：ELISA：抗血清（酶标记兔抗豚鼠血清）-筛选-中和试验 （时程长，细胞培养设备以及实验室）琼脂凝胶免疫扩散试验检测聚合酶 3D 抗体（不敏感）/多聚蛋白 3AB 抗体通用 RT-PCR：病毒 5非编码区、VP1、3D 作为目的片段基因芯片。防制：1. 严格检疫，上报疫情； 2. 疫区周边畜群采取免疫接种措施。猪繁殖与呼吸综合征病毒（又名蓝耳病 Porcine reproductiv
45、e and respirotory syndrome virus，PRRSV）病毒感染和致病的分子机制：靶细胞：具有显著的单核/巨噬细胞嗜性。尤其是肺泡巨噬细胞通过内嗜作用进入细胞，受体为猪唾液酸粘附素，推测另一共受体为硫酸乙酰肝素推测病毒与硫酸乙酰肝素结合促进其定植，促进与唾液酸粘附素结合，引起相互作用，增加病毒的浓度，到达一定的浓度引起感染和内化，后通过网格蛋白介导的内嗜途径侵入，在巨噬细胞内部因子的促进下发生细胞间膜融合，病毒脱壳释放基因，启动复制。致病机理及症状：侵入方式通过呼吸道以及生殖道，在肺部巨噬细胞大量复制，随细胞的崩解进入血液和淋巴循环导致病毒血症和全身的淋巴感染PRRSV
46、一个重要免疫学特征是抗体依赖性增强作用(antibody dependentenhancement，ADE)。指某些病毒用相应抗体处理后，其复制或感染能力显著增强病毒可穿过胎盘感染猪崽，导致脐带出血性病变，组织学检查可见坏死性脐带动脉炎病毒感染单核细胞及巨噬细胞，造成免疫抑制临床常见继发感染，例如继发感染链球菌和副猪嗜血杆菌出现化脓性脑膜炎、心包炎、胸膜炎以及腹膜炎。诊断：在流产猪崽中的病毒很快失活，应尽可能迅速采样分离病毒可采肺脏、脾脏、淋巴结等，病毒培养较困难，仅在猪肺巨噬细胞、Marc-145 细胞及非洲绿猴肾细胞系 MA-104 生长可用中和试验进行诊断，加入适量豚鼠补体可提高试验的敏
47、感性RT-PCR、ELISA、荧光抗体等亦用于诊断。 RT-PCR 常规技术，常检测核衣壳蛋白ORF7。可用作设计通用引物。套式 PCR，根据 ORF1b 和 ORF7 设计，比 RT-PCR 敏感 100 倍，样本检出率高。预防和控制：目前虽有弱毒活疫苗和灭活疫苗可用于免疫接种，前者的安全性仍存在隐患，后者的免疫效果不确实对种猪应加强检疫，建立无病猪场是根本性的措施。感染猪场加强饲养管理、控制继发感染是重要手段。 猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea PED)引起以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病.结构与其它冠状病毒相似，位
48、于病毒粒子表面的是纤突糖蛋白（S） 、膜糖蛋白（M）和包膜糖蛋白（E） 。在病毒粒子内部的是核衣壳蛋白（N） ，N 蛋白与病毒基因组 RNA 相互缠绕形成病毒的核衣壳。病毒感染和致病的分子机制：主要在小肠和结肠的绒毛上皮细胞浆中复制.小肠膨胀，内充满大量黄色液体，绒毛上皮细胞空泡化、脱落，绒毛变短利用其表面的 S 蛋白与猪肠道细胞表面受体结合，通过膜融合侵入细胞内，集中在猪小肠绒毛上皮细胞中复制，新生病毒通过粪便和呕吐物排出体外PEDV 具有肠道组织嗜性的特点，在抗 PEDV 感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。流行病学：病猪是本病的主要传染源，通过病
49、猪排泄的粪便散播病毒，污染饲料、饮水和环境，健康猪经口接种了含 PEDV 的粪便即可发生自然感染，粪口途径可能是传播的主要方式。各年龄的猪均可感染，仔猪和育成猪的发病率通常为 100%，母猪为 15%90%。病毒传入猪群的途径主要是通过运输病猪或者被污染的饲料、车辆，以及被病毒污染的靴、鞋或其它携带病毒的污染物。症状：1 周龄内仔猪常常腹泻 3 d4 d 后因脱水而死，病死率平均为 50%，但有时高 80%，日龄较大的仔猪约一周后康复。暴发过急性腹泻的猪场，在断奶后 2 周3 周可能出现持续性腹泻，新引进的猪只也可能相继发病。诊断：PED 与猪传染性胃肠炎（TGE）的临床症状极其相似病毒分离、病毒中和试验和免疫荧光试验.PCR:M 基因和 N 基因为靶基因建立了 RT-PCR 方法 ELISA:M 蛋白的单克隆
