1、生物化学与分子生物学专业优秀论文 低剂量活骨髓瘤、转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导的抗肿瘤免疫及胸腺肽 的原核表达纯化与活性鉴定关键词：骨髓瘤 肿瘤细胞 抗肿瘤免疫 胸腺肽 1 原核表达摘要：根据世界卫生组织和我国卫生部的统计，恶性肿瘤正严重的威胁着人类的健康，我国的情况也不容乐观。尽管健康的生活方式被倡导以及一些有效的治疗手段被研发出来，但是现状距离人类攻克肿瘤的目标还很遥远。 通过对癌基因的研究，人们发现肿瘤细胞衍生于正常细胞。它们与正常细胞相比有很多共同点，同时也有其独特的特征，比如自足的生长信号、对生长抑制信号脱敏、逃避细胞凋亡、具有无限的增殖潜力、可持续的血管生成、组织侵入
2、和转移等。正是这些特征使得肿瘤细胞能够快速生长、躲避机体监视并进一步威胁宿主的生命。 但是，这些特征同时也为科研工作者们提供了攻击肿瘤的思路。许多针对这些特征的治疗方案被广泛探讨，比如抑制肿瘤血管生成、用射线或化学药物杀伤增生旺盛的细胞等等。本文则重点讨论了利用免疫学手段针对肿瘤的生物疗法。在 Coley 第一次利用大肠杆菌的提取物诱导抗肿瘤免疫后，大量的免疫方式被尝试。肿瘤裂解物疫苗的摸索、细胞因子的发现和使用、转染细胞因子的灭活肿瘤细胞的探索以及基于树突细胞基础上的肿瘤疫苗的制备都从不同的方向推动了抗肿瘤疫苗的发展。在这些前人工作的基础上，本论文分为以下三个部分对抗肿瘤免疫的诱导做了一些讨
3、论。 在低剂量骨髓瘤诱导抗肿瘤免疫课题中我们探讨了一种利用未修饰的低剂量骨髓瘤细胞诱导肿瘤特异性免疫反应的方法。BALB/c 小鼠被 10lt;#39;4gt;活的树突-骨髓瘤的融合细胞或 10lt;#39;3gt;活的骨髓瘤细胞免疫。结果表明，80的免疫小鼠在接种了 110lt;#39;6gt;骨髓瘤细胞后避免了肿瘤发生，而对照组小鼠则全部形成肿瘤。此外，用低剂量活骨髓瘤细胞免疫 C57BL/6 小鼠未见引起保护性免疫。同时，进一步的实验证明细胞免疫在抗肿瘤反应中起着主要作用。在过继免疫实验中，尾静脉注射免疫小鼠的淋巴细胞可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，而尾静脉注射免疫小鼠的血清则未引起显著差异
4、。在 CTL 实验中，免疫小鼠的 T 淋巴细胞展现出裂解骨髓瘤细胞的能力。在与骨髓瘤细胞保温后，免疫小鼠的 Th 细胞分泌 IFN- 的量提升了 10 倍多，而 IL-4 则未见显著改变。这些现象表明，用低剂量未修饰的活骨髓瘤细胞可以安全的免疫小鼠并且能够诱导抗肿瘤的保护性免疫。在转染 GM-CSF 基因骨髓瘤冻干粉课题中我们探讨了转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导的抗肿瘤效果。本课题采用荧光标记的抗体对肿瘤细胞内染色，鉴定重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染效率，并采用夹心 ELISA 测定转染后骨髓瘤 GM-CSF 的分泌量。采用了 BALB/c 小鼠骨髓瘤预防免疫的模型比较转染与
5、未转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉的抗肿瘤效果，并通过免疫血清抗体滴度的检测和 CTL 实验探讨了该冻干粉产生抗肿瘤效果的机制。细胞内荧光染色表明，骨髓瘤细胞被重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染，且夹心 ELISA 测定其 GM-CSF 分泌量达到了240ng/24h 每 10lt;#39;6gt;个细胞。在小鼠骨髓瘤预防免疫模型中，单独的骨髓瘤冻干粉并未引起针对骨髓瘤的保护作用，而转染 GM-CSF基因的骨髓瘤冻干粉则将小鼠存活率提升至 60。FACS 实验检测出免疫小鼠血清中存在针对骨髓瘤的抗体，而 CTL 实验则未见淋巴细胞诱导的骨髓瘤裂解。上述结果证明，转染 GM-CSF 基因
6、的骨髓瘤冻干粉诱导了针对骨髓瘤抗体的产生，并具有抗肿瘤效果。 胸腺肽 lt;,1gt;是一种免疫增强剂，在抗病毒和抗肿瘤方面都有一定的疗效。在胸腺肽 lt;,1gt;课题中我们探讨了胸腺肽 lt;,1gt;的原核表达、纯化和活性测定。本课题用 PCR 将化学合成的人胸腺肽 lt;,1gt;基因扩增并克隆到pMD18-T 载体中，经过 KpnI/SacI 酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体pET32b 中硫氧还蛋白下游。将重组质粒转化至表达宿主 BL21(DE3)中，经 IPTG诱导，Zn-Sepharose 亲和层析纯化以及复性处理，从每升菌液中可获得 35mg硫氧还蛋白-胸腺肽 lt;,1
7、gt;融合蛋白。经凝血因子 Xa 酶切、Zn-Sepharose 亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得 38mg 重组人胸腺肽。小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。正文内容根据世界卫生组织和我国卫生部的统计，恶性肿瘤正严重的威胁着人类的健康，我国的情况也不容乐观。尽管健康的生活方式被倡导以及一些有效的治疗手段被研发出来，但是现状距离人类攻克肿瘤的目标还很遥远。 通过对癌基因的研究，人们发现肿瘤细胞衍生于正常细胞。它们与正常细胞相比有很多共同点，同时也有其独特的特征，比如自足的生长信号、对生长抑制信号
8、脱敏、逃避细胞凋亡、具有无限的增殖潜力、可持续的血管生成、组织侵入和转移等。正是这些特征使得肿瘤细胞能够快速生长、躲避机体监视并进一步威胁宿主的生命。 但是，这些特征同时也为科研工作者们提供了攻击肿瘤的思路。许多针对这些特征的治疗方案被广泛探讨，比如抑制肿瘤血管生成、用射线或化学药物杀伤增生旺盛的细胞等等。本文则重点讨论了利用免疫学手段针对肿瘤的生物疗法。在 Coley 第一次利用大肠杆菌的提取物诱导抗肿瘤免疫后，大量的免疫方式被尝试。肿瘤裂解物疫苗的摸索、细胞因子的发现和使用、转染细胞因子的灭活肿瘤细胞的探索以及基于树突细胞基础上的肿瘤疫苗的制备都从不同的方向推动了抗肿瘤疫苗的发展。在这些前
9、人工作的基础上，本论文分为以下三个部分对抗肿瘤免疫的诱导做了一些讨论。 在低剂量骨髓瘤诱导抗肿瘤免疫课题中我们探讨了一种利用未修饰的低剂量骨髓瘤细胞诱导肿瘤特异性免疫反应的方法。BALB/c 小鼠被 10lt;#39;4gt;活的树突-骨髓瘤的融合细胞或 10lt;#39;3gt;活的骨髓瘤细胞免疫。结果表明，80的免疫小鼠在接种了 110lt;#39;6gt;骨髓瘤细胞后避免了肿瘤发生，而对照组小鼠则全部形成肿瘤。此外，用低剂量活骨髓瘤细胞免疫 C57BL/6 小鼠未见引起保护性免疫。同时，进一步的实验证明细胞免疫在抗肿瘤反应中起着主要作用。在过继免疫实验中，尾静脉注射免疫小鼠的淋巴细胞可以
10、抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，而尾静脉注射免疫小鼠的血清则未引起显著差异。在 CTL 实验中，免疫小鼠的 T 淋巴细胞展现出裂解骨髓瘤细胞的能力。在与骨髓瘤细胞保温后，免疫小鼠的 Th 细胞分泌 IFN- 的量提升了 10倍多，而 IL-4 则未见显著改变。这些现象表明，用低剂量未修饰的活骨髓瘤细胞可以安全的免疫小鼠并且能够诱导抗肿瘤的保护性免疫。在转染 GM-CSF 基因骨髓瘤冻干粉课题中我们探讨了转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导的抗肿瘤效果。本课题采用荧光标记的抗体对肿瘤细胞内染色，鉴定重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染效率，并采用夹心 ELISA 测定转染后骨髓瘤 GM-CSF 的
11、分泌量。采用了 BALB/c 小鼠骨髓瘤预防免疫的模型比较转染与未转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉的抗肿瘤效果，并通过免疫血清抗体滴度的检测和 CTL 实验探讨了该冻干粉产生抗肿瘤效果的机制。细胞内荧光染色表明，骨髓瘤细胞被重组 GM-CSF基因的腺病毒转染，且夹心 ELISA 测定其 GM-CSF 分泌量达到了 240ng/24h 每10lt;#39;6gt;个细胞。在小鼠骨髓瘤预防免疫模型中，单独的骨髓瘤冻干粉并未引起针对骨髓瘤的保护作用，而转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉则将小鼠存活率提升至 60。FACS 实验检测出免疫小鼠血清中存在针对骨髓瘤的抗体，而 CTL 实验则未见
12、淋巴细胞诱导的骨髓瘤裂解。上述结果证明，转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导了针对骨髓瘤抗体的产生，并具有抗肿瘤效果。 胸腺肽 lt;,1gt;是一种免疫增强剂，在抗病毒和抗肿瘤方面都有一定的疗效。在胸腺肽 lt;,1gt;课题中我们探讨了胸腺肽 lt;,1gt;的原核表达、纯化和活性测定。本课题用 PCR 将化学合成的人胸腺肽 lt;,1gt;基因扩增并克隆到 pMD18-T 载体中，经过 KpnI/SacI 酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体 pET32b 中硫氧还蛋白下游。将重组质粒转化至表达宿主 BL21(DE3)中，经 IPTG 诱导，Zn-Sepharose亲和层析纯化以及
13、复性处理，从每升菌液中可获得 35mg 硫氧还蛋白-胸腺肽lt;,1gt;融合蛋白。经凝血因子 Xa 酶切、Zn-Sepharose 亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得 38mg 重组人胸腺肽。小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。根据世界卫生组织和我国卫生部的统计，恶性肿瘤正严重的威胁着人类的健康，我国的情况也不容乐观。尽管健康的生活方式被倡导以及一些有效的治疗手段被研发出来，但是现状距离人类攻克肿瘤的目标还很遥远。 通过对癌基因的研究，人们发现肿瘤细胞衍生于正常细胞。它们与正常细胞相比有很多共同
14、点，同时也有其独特的特征，比如自足的生长信号、对生长抑制信号脱敏、逃避细胞凋亡、具有无限的增殖潜力、可持续的血管生成、组织侵入和转移等。正是这些特征使得肿瘤细胞能够快速生长、躲避机体监视并进一步威胁宿主的生命。但是，这些特征同时也为科研工作者们提供了攻击肿瘤的思路。许多针对这些特征的治疗方案被广泛探讨，比如抑制肿瘤血管生成、用射线或化学药物杀伤增生旺盛的细胞等等。本文则重点讨论了利用免疫学手段针对肿瘤的生物疗法。在 Coley 第一次利用大肠杆菌的提取物诱导抗肿瘤免疫后，大量的免疫方式被尝试。肿瘤裂解物疫苗的摸索、细胞因子的发现和使用、转染细胞因子的灭活肿瘤细胞的探索以及基于树突细胞基础上的肿
15、瘤疫苗的制备都从不同的方向推动了抗肿瘤疫苗的发展。在这些前人工作的基础上，本论文分为以下三个部分对抗肿瘤免疫的诱导做了一些讨论。 在低剂量骨髓瘤诱导抗肿瘤免疫课题中我们探讨了一种利用未修饰的低剂量骨髓瘤细胞诱导肿瘤特异性免疫反应的方法。BALB/c 小鼠被 10lt;#39;4gt;活的树突-骨髓瘤的融合细胞或 10lt;#39;3gt;活的骨髓瘤细胞免疫。结果表明，80的免疫小鼠在接种了 110lt;#39;6gt;骨髓瘤细胞后避免了肿瘤发生，而对照组小鼠则全部形成肿瘤。此外，用低剂量活骨髓瘤细胞免疫 C57BL/6 小鼠未见引起保护性免疫。同时，进一步的实验证明细胞免疫在抗肿瘤反应中起着主
16、要作用。在过继免疫实验中，尾静脉注射免疫小鼠的淋巴细胞可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，而尾静脉注射免疫小鼠的血清则未引起显著差异。在 CTL 实验中，免疫小鼠的 T 淋巴细胞展现出裂解骨髓瘤细胞的能力。在与骨髓瘤细胞保温后，免疫小鼠的 Th 细胞分泌 IFN- 的量提升了 10 倍多，而 IL-4 则未见显著改变。这些现象表明，用低剂量未修饰的活骨髓瘤细胞可以安全的免疫小鼠并且能够诱导抗肿瘤的保护性免疫。在转染 GM-CSF 基因骨髓瘤冻干粉课题中我们探讨了转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导的抗肿瘤效果。本课题采用荧光标记的抗体对肿瘤细胞内染色，鉴定重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染效率
17、，并采用夹心 ELISA 测定转染后骨髓瘤 GM-CSF 的分泌量。采用了BALB/c 小鼠骨髓瘤预防免疫的模型比较转染与未转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉的抗肿瘤效果，并通过免疫血清抗体滴度的检测和 CTL 实验探讨了该冻干粉产生抗肿瘤效果的机制。细胞内荧光染色表明，骨髓瘤细胞被重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染，且夹心 ELISA 测定其 GM-CSF 分泌量达到了 240ng/24h 每10lt;#39;6gt;个细胞。在小鼠骨髓瘤预防免疫模型中，单独的骨髓瘤冻干粉并未引起针对骨髓瘤的保护作用，而转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉则将小鼠存活率提升至 60。FACS 实验检测
18、出免疫小鼠血清中存在针对骨髓瘤的抗体，而 CTL 实验则未见淋巴细胞诱导的骨髓瘤裂解。上述结果证明，转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导了针对骨髓瘤抗体的产生，并具有抗肿瘤效果。 胸腺肽 lt;,1gt;是一种免疫增强剂，在抗病毒和抗肿瘤方面都有一定的疗效。在胸腺肽 lt;,1gt;课题中我们探讨了胸腺肽 lt;,1gt;的原核表达、纯化和活性测定。本课题用 PCR 将化学合成的人胸腺肽 lt;,1gt;基因扩增并克隆到 pMD18-T 载体中，经过 KpnI/SacI 酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体 pET32b 中硫氧还蛋白下游。将重组质粒转化至表达宿主 BL21(DE3)中，
19、经 IPTG 诱导，Zn-Sepharose亲和层析纯化以及复性处理，从每升菌液中可获得 35mg 硫氧还蛋白-胸腺肽lt;,1gt;融合蛋白。经凝血因子 Xa 酶切、Zn-Sepharose 亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得 38mg 重组人胸腺肽。小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。根据世界卫生组织和我国卫生部的统计，恶性肿瘤正严重的威胁着人类的健康，我国的情况也不容乐观。尽管健康的生活方式被倡导以及一些有效的治疗手段被研发出来，但是现状距离人类攻克肿瘤的目标还很遥远。 通过对癌基因的研究，
20、人们发现肿瘤细胞衍生于正常细胞。它们与正常细胞相比有很多共同点，同时也有其独特的特征，比如自足的生长信号、对生长抑制信号脱敏、逃避细胞凋亡、具有无限的增殖潜力、可持续的血管生成、组织侵入和转移等。正是这些特征使得肿瘤细胞能够快速生长、躲避机体监视并进一步威胁宿主的生命。但是，这些特征同时也为科研工作者们提供了攻击肿瘤的思路。许多针对这些特征的治疗方案被广泛探讨，比如抑制肿瘤血管生成、用射线或化学药物杀伤增生旺盛的细胞等等。本文则重点讨论了利用免疫学手段针对肿瘤的生物疗法。在 Coley 第一次利用大肠杆菌的提取物诱导抗肿瘤免疫后，大量的免疫方式被尝试。肿瘤裂解物疫苗的摸索、细胞因子的发现和使用
21、、转染细胞因子的灭活肿瘤细胞的探索以及基于树突细胞基础上的肿瘤疫苗的制备都从不同的方向推动了抗肿瘤疫苗的发展。在这些前人工作的基础上，本论文分为以下三个部分对抗肿瘤免疫的诱导做了一些讨论。 在低剂量骨髓瘤诱导抗肿瘤免疫课题中我们探讨了一种利用未修饰的低剂量骨髓瘤细胞诱导肿瘤特异性免疫反应的方法。BALB/c 小鼠被 10lt;#39;4gt;活的树突-骨髓瘤的融合细胞或 10lt;#39;3gt;活的骨髓瘤细胞免疫。结果表明，80的免疫小鼠在接种了 110lt;#39;6gt;骨髓瘤细胞后避免了肿瘤发生，而对照组小鼠则全部形成肿瘤。此外，用低剂量活骨髓瘤细胞免疫 C57BL/6 小鼠未见引起保
22、护性免疫。同时，进一步的实验证明细胞免疫在抗肿瘤反应中起着主要作用。在过继免疫实验中，尾静脉注射免疫小鼠的淋巴细胞可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，而尾静脉注射免疫小鼠的血清则未引起显著差异。在 CTL 实验中，免疫小鼠的 T 淋巴细胞展现出裂解骨髓瘤细胞的能力。在与骨髓瘤细胞保温后，免疫小鼠的 Th 细胞分泌 IFN- 的量提升了 10 倍多，而 IL-4 则未见显著改变。这些现象表明，用低剂量未修饰的活骨髓瘤细胞可以安全的免疫小鼠并且能够诱导抗肿瘤的保护性免疫。在转染 GM-CSF 基因骨髓瘤冻干粉课题中我们探讨了转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导的抗肿瘤效果。本课题采用荧光标记的抗体对
23、肿瘤细胞内染色，鉴定重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染效率，并采用夹心 ELISA 测定转染后骨髓瘤 GM-CSF 的分泌量。采用了BALB/c 小鼠骨髓瘤预防免疫的模型比较转染与未转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉的抗肿瘤效果，并通过免疫血清抗体滴度的检测和 CTL 实验探讨了该冻干粉产生抗肿瘤效果的机制。细胞内荧光染色表明，骨髓瘤细胞被重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染，且夹心 ELISA 测定其 GM-CSF 分泌量达到了 240ng/24h 每10lt;#39;6gt;个细胞。在小鼠骨髓瘤预防免疫模型中，单独的骨髓瘤冻干粉并未引起针对骨髓瘤的保护作用，而转染 GM-CSF 基因
24、的骨髓瘤冻干粉则将小鼠存活率提升至 60。FACS 实验检测出免疫小鼠血清中存在针对骨髓瘤的抗体，而 CTL 实验则未见淋巴细胞诱导的骨髓瘤裂解。上述结果证明，转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导了针对骨髓瘤抗体的产生，并具有抗肿瘤效果。 胸腺肽 lt;,1gt;是一种免疫增强剂，在抗病毒和抗肿瘤方面都有一定的疗效。在胸腺肽 lt;,1gt;课题中我们探讨了胸腺肽 lt;,1gt;的原核表达、纯化和活性测定。本课题用 PCR 将化学合成的人胸腺肽 lt;,1gt;基因扩增并克隆到 pMD18-T 载体中，经过 KpnI/SacI 酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体 pET32b 中硫氧
25、还蛋白下游。将重组质粒转化至表达宿主 BL21(DE3)中，经 IPTG 诱导，Zn-Sepharose亲和层析纯化以及复性处理，从每升菌液中可获得 35mg 硫氧还蛋白-胸腺肽lt;,1gt;融合蛋白。经凝血因子 Xa 酶切、Zn-Sepharose 亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得 38mg 重组人胸腺肽。小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。根据世界卫生组织和我国卫生部的统计，恶性肿瘤正严重的威胁着人类的健康，我国的情况也不容乐观。尽管健康的生活方式被倡导以及一些有效的治疗手段被研发出来，但
26、是现状距离人类攻克肿瘤的目标还很遥远。 通过对癌基因的研究，人们发现肿瘤细胞衍生于正常细胞。它们与正常细胞相比有很多共同点，同时也有其独特的特征，比如自足的生长信号、对生长抑制信号脱敏、逃避细胞凋亡、具有无限的增殖潜力、可持续的血管生成、组织侵入和转移等。正是这些特征使得肿瘤细胞能够快速生长、躲避机体监视并进一步威胁宿主的生命。但是，这些特征同时也为科研工作者们提供了攻击肿瘤的思路。许多针对这些特征的治疗方案被广泛探讨，比如抑制肿瘤血管生成、用射线或化学药物杀伤增生旺盛的细胞等等。本文则重点讨论了利用免疫学手段针对肿瘤的生物疗法。在 Coley 第一次利用大肠杆菌的提取物诱导抗肿瘤免疫后，大量
27、的免疫方式被尝试。肿瘤裂解物疫苗的摸索、细胞因子的发现和使用、转染细胞因子的灭活肿瘤细胞的探索以及基于树突细胞基础上的肿瘤疫苗的制备都从不同的方向推动了抗肿瘤疫苗的发展。在这些前人工作的基础上，本论文分为以下三个部分对抗肿瘤免疫的诱导做了一些讨论。 在低剂量骨髓瘤诱导抗肿瘤免疫课题中我们探讨了一种利用未修饰的低剂量骨髓瘤细胞诱导肿瘤特异性免疫反应的方法。BALB/c 小鼠被 10lt;#39;4gt;活的树突-骨髓瘤的融合细胞或 10lt;#39;3gt;活的骨髓瘤细胞免疫。结果表明，80的免疫小鼠在接种了 110lt;#39;6gt;骨髓瘤细胞后避免了肿瘤发生，而对照组小鼠则全部形成肿瘤。此
28、外，用低剂量活骨髓瘤细胞免疫 C57BL/6 小鼠未见引起保护性免疫。同时，进一步的实验证明细胞免疫在抗肿瘤反应中起着主要作用。在过继免疫实验中，尾静脉注射免疫小鼠的淋巴细胞可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，而尾静脉注射免疫小鼠的血清则未引起显著差异。在 CTL 实验中，免疫小鼠的 T 淋巴细胞展现出裂解骨髓瘤细胞的能力。在与骨髓瘤细胞保温后，免疫小鼠的 Th 细胞分泌 IFN- 的量提升了 10 倍多，而 IL-4 则未见显著改变。这些现象表明，用低剂量未修饰的活骨髓瘤细胞可以安全的免疫小鼠并且能够诱导抗肿瘤的保护性免疫。在转染 GM-CSF 基因骨髓瘤冻干粉课题中我们探讨了转染 GM-CSF 基
29、因的骨髓瘤冻干粉诱导的抗肿瘤效果。本课题采用荧光标记的抗体对肿瘤细胞内染色，鉴定重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染效率，并采用夹心 ELISA 测定转染后骨髓瘤 GM-CSF 的分泌量。采用了BALB/c 小鼠骨髓瘤预防免疫的模型比较转染与未转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉的抗肿瘤效果，并通过免疫血清抗体滴度的检测和 CTL 实验探讨了该冻干粉产生抗肿瘤效果的机制。细胞内荧光染色表明，骨髓瘤细胞被重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染，且夹心 ELISA 测定其 GM-CSF 分泌量达到了 240ng/24h 每10lt;#39;6gt;个细胞。在小鼠骨髓瘤预防免疫模型中，单独的骨髓瘤冻
30、干粉并未引起针对骨髓瘤的保护作用，而转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉则将小鼠存活率提升至 60。FACS 实验检测出免疫小鼠血清中存在针对骨髓瘤的抗体，而 CTL 实验则未见淋巴细胞诱导的骨髓瘤裂解。上述结果证明，转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导了针对骨髓瘤抗体的产生，并具有抗肿瘤效果。 胸腺肽 lt;,1gt;是一种免疫增强剂，在抗病毒和抗肿瘤方面都有一定的疗效。在胸腺肽 lt;,1gt;课题中我们探讨了胸腺肽 lt;,1gt;的原核表达、纯化和活性测定。本课题用 PCR 将化学合成的人胸腺肽 lt;,1gt;基因扩增并克隆到 pMD18-T 载体中，经过 KpnI/SacI
31、 酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体 pET32b 中硫氧还蛋白下游。将重组质粒转化至表达宿主 BL21(DE3)中，经 IPTG 诱导，Zn-Sepharose亲和层析纯化以及复性处理，从每升菌液中可获得 35mg 硫氧还蛋白-胸腺肽lt;,1gt;融合蛋白。经凝血因子 Xa 酶切、Zn-Sepharose 亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得 38mg 重组人胸腺肽。小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。根据世界卫生组织和我国卫生部的统计，恶性肿瘤正严重的威胁着人类的健康，我国的情况也不容乐观。
32、尽管健康的生活方式被倡导以及一些有效的治疗手段被研发出来，但是现状距离人类攻克肿瘤的目标还很遥远。 通过对癌基因的研究，人们发现肿瘤细胞衍生于正常细胞。它们与正常细胞相比有很多共同点，同时也有其独特的特征，比如自足的生长信号、对生长抑制信号脱敏、逃避细胞凋亡、具有无限的增殖潜力、可持续的血管生成、组织侵入和转移等。正是这些特征使得肿瘤细胞能够快速生长、躲避机体监视并进一步威胁宿主的生命。但是，这些特征同时也为科研工作者们提供了攻击肿瘤的思路。许多针对这些特征的治疗方案被广泛探讨，比如抑制肿瘤血管生成、用射线或化学药物杀伤增生旺盛的细胞等等。本文则重点讨论了利用免疫学手段针对肿瘤的生物疗法。在
33、Coley 第一次利用大肠杆菌的提取物诱导抗肿瘤免疫后，大量的免疫方式被尝试。肿瘤裂解物疫苗的摸索、细胞因子的发现和使用、转染细胞因子的灭活肿瘤细胞的探索以及基于树突细胞基础上的肿瘤疫苗的制备都从不同的方向推动了抗肿瘤疫苗的发展。在这些前人工作的基础上，本论文分为以下三个部分对抗肿瘤免疫的诱导做了一些讨论。 在低剂量骨髓瘤诱导抗肿瘤免疫课题中我们探讨了一种利用未修饰的低剂量骨髓瘤细胞诱导肿瘤特异性免疫反应的方法。BALB/c 小鼠被 10lt;#39;4gt;活的树突-骨髓瘤的融合细胞或 10lt;#39;3gt;活的骨髓瘤细胞免疫。结果表明，80的免疫小鼠在接种了 110lt;#39;6gt
34、;骨髓瘤细胞后避免了肿瘤发生，而对照组小鼠则全部形成肿瘤。此外，用低剂量活骨髓瘤细胞免疫 C57BL/6 小鼠未见引起保护性免疫。同时，进一步的实验证明细胞免疫在抗肿瘤反应中起着主要作用。在过继免疫实验中，尾静脉注射免疫小鼠的淋巴细胞可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，而尾静脉注射免疫小鼠的血清则未引起显著差异。在 CTL 实验中，免疫小鼠的 T 淋巴细胞展现出裂解骨髓瘤细胞的能力。在与骨髓瘤细胞保温后，免疫小鼠的 Th 细胞分泌 IFN- 的量提升了 10 倍多，而 IL-4 则未见显著改变。这些现象表明，用低剂量未修饰的活骨髓瘤细胞可以安全的免疫小鼠并且能够诱导抗肿瘤的保护性免疫。在转染 GM-C
35、SF 基因骨髓瘤冻干粉课题中我们探讨了转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导的抗肿瘤效果。本课题采用荧光标记的抗体对肿瘤细胞内染色，鉴定重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染效率，并采用夹心 ELISA 测定转染后骨髓瘤 GM-CSF 的分泌量。采用了BALB/c 小鼠骨髓瘤预防免疫的模型比较转染与未转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉的抗肿瘤效果，并通过免疫血清抗体滴度的检测和 CTL 实验探讨了该冻干粉产生抗肿瘤效果的机制。细胞内荧光染色表明，骨髓瘤细胞被重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染，且夹心 ELISA 测定其 GM-CSF 分泌量达到了 240ng/24h 每10lt;#39
36、;6gt;个细胞。在小鼠骨髓瘤预防免疫模型中，单独的骨髓瘤冻干粉并未引起针对骨髓瘤的保护作用，而转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉则将小鼠存活率提升至 60。FACS 实验检测出免疫小鼠血清中存在针对骨髓瘤的抗体，而 CTL 实验则未见淋巴细胞诱导的骨髓瘤裂解。上述结果证明，转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导了针对骨髓瘤抗体的产生，并具有抗肿瘤效果。 胸腺肽 lt;,1gt;是一种免疫增强剂，在抗病毒和抗肿瘤方面都有一定的疗效。在胸腺肽 lt;,1gt;课题中我们探讨了胸腺肽 lt;,1gt;的原核表达、纯化和活性测定。本课题用 PCR 将化学合成的人胸腺肽 lt;,1gt;基因扩
37、增并克隆到 pMD18-T 载体中，经过 KpnI/SacI 酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体 pET32b 中硫氧还蛋白下游。将重组质粒转化至表达宿主 BL21(DE3)中，经 IPTG 诱导，Zn-Sepharose亲和层析纯化以及复性处理，从每升菌液中可获得 35mg 硫氧还蛋白-胸腺肽lt;,1gt;融合蛋白。经凝血因子 Xa 酶切、Zn-Sepharose 亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得 38mg 重组人胸腺肽。小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。根据世界卫生组织和我国卫生部的统
38、计，恶性肿瘤正严重的威胁着人类的健康，我国的情况也不容乐观。尽管健康的生活方式被倡导以及一些有效的治疗手段被研发出来，但是现状距离人类攻克肿瘤的目标还很遥远。 通过对癌基因的研究，人们发现肿瘤细胞衍生于正常细胞。它们与正常细胞相比有很多共同点，同时也有其独特的特征，比如自足的生长信号、对生长抑制信号脱敏、逃避细胞凋亡、具有无限的增殖潜力、可持续的血管生成、组织侵入和转移等。正是这些特征使得肿瘤细胞能够快速生长、躲避机体监视并进一步威胁宿主的生命。但是，这些特征同时也为科研工作者们提供了攻击肿瘤的思路。许多针对这些特征的治疗方案被广泛探讨，比如抑制肿瘤血管生成、用射线或化学药物杀伤增生旺盛的细胞
39、等等。本文则重点讨论了利用免疫学手段针对肿瘤的生物疗法。在 Coley 第一次利用大肠杆菌的提取物诱导抗肿瘤免疫后，大量的免疫方式被尝试。肿瘤裂解物疫苗的摸索、细胞因子的发现和使用、转染细胞因子的灭活肿瘤细胞的探索以及基于树突细胞基础上的肿瘤疫苗的制备都从不同的方向推动了抗肿瘤疫苗的发展。在这些前人工作的基础上，本论文分为以下三个部分对抗肿瘤免疫的诱导做了一些讨论。 在低剂量骨髓瘤诱导抗肿瘤免疫课题中我们探讨了一种利用未修饰的低剂量骨髓瘤细胞诱导肿瘤特异性免疫反应的方法。BALB/c 小鼠被 10lt;#39;4gt;活的树突-骨髓瘤的融合细胞或 10lt;#39;3gt;活的骨髓瘤细胞免疫。
40、结果表明，80的免疫小鼠在接种了 110lt;#39;6gt;骨髓瘤细胞后避免了肿瘤发生，而对照组小鼠则全部形成肿瘤。此外，用低剂量活骨髓瘤细胞免疫 C57BL/6 小鼠未见引起保护性免疫。同时，进一步的实验证明细胞免疫在抗肿瘤反应中起着主要作用。在过继免疫实验中，尾静脉注射免疫小鼠的淋巴细胞可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，而尾静脉注射免疫小鼠的血清则未引起显著差异。在 CTL 实验中，免疫小鼠的 T 淋巴细胞展现出裂解骨髓瘤细胞的能力。在与骨髓瘤细胞保温后，免疫小鼠的 Th 细胞分泌 IFN- 的量提升了 10 倍多，而 IL-4 则未见显著改变。这些现象表明，用低剂量未修饰的活骨髓瘤细胞可以安
41、全的免疫小鼠并且能够诱导抗肿瘤的保护性免疫。在转染 GM-CSF 基因骨髓瘤冻干粉课题中我们探讨了转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导的抗肿瘤效果。本课题采用荧光标记的抗体对肿瘤细胞内染色，鉴定重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染效率，并采用夹心 ELISA 测定转染后骨髓瘤 GM-CSF 的分泌量。采用了BALB/c 小鼠骨髓瘤预防免疫的模型比较转染与未转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉的抗肿瘤效果，并通过免疫血清抗体滴度的检测和 CTL 实验探讨了该冻干粉产生抗肿瘤效果的机制。细胞内荧光染色表明，骨髓瘤细胞被重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染，且夹心 ELISA 测定其 GM-
42、CSF 分泌量达到了 240ng/24h 每10lt;#39;6gt;个细胞。在小鼠骨髓瘤预防免疫模型中，单独的骨髓瘤冻干粉并未引起针对骨髓瘤的保护作用，而转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉则将小鼠存活率提升至 60。FACS 实验检测出免疫小鼠血清中存在针对骨髓瘤的抗体，而 CTL 实验则未见淋巴细胞诱导的骨髓瘤裂解。上述结果证明，转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导了针对骨髓瘤抗体的产生，并具有抗肿瘤效果。 胸腺肽 lt;,1gt;是一种免疫增强剂，在抗病毒和抗肿瘤方面都有一定的疗效。在胸腺肽 lt;,1gt;课题中我们探讨了胸腺肽 lt;,1gt;的原核表达、纯化和活性测定。本
43、课题用 PCR 将化学合成的人胸腺肽 lt;,1gt;基因扩增并克隆到 pMD18-T 载体中，经过 KpnI/SacI 酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体 pET32b 中硫氧还蛋白下游。将重组质粒转化至表达宿主 BL21(DE3)中，经 IPTG 诱导，Zn-Sepharose亲和层析纯化以及复性处理，从每升菌液中可获得 35mg 硫氧还蛋白-胸腺肽lt;,1gt;融合蛋白。经凝血因子 Xa 酶切、Zn-Sepharose 亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得 38mg 重组人胸腺肽。小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人
44、胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。根据世界卫生组织和我国卫生部的统计，恶性肿瘤正严重的威胁着人类的健康，我国的情况也不容乐观。尽管健康的生活方式被倡导以及一些有效的治疗手段被研发出来，但是现状距离人类攻克肿瘤的目标还很遥远。 通过对癌基因的研究，人们发现肿瘤细胞衍生于正常细胞。它们与正常细胞相比有很多共同点，同时也有其独特的特征，比如自足的生长信号、对生长抑制信号脱敏、逃避细胞凋亡、具有无限的增殖潜力、可持续的血管生成、组织侵入和转移等。正是这些特征使得肿瘤细胞能够快速生长、躲避机体监视并进一步威胁宿主的生命。但是，这些特征同时也为科研工作者们提供了攻击肿瘤的思路。许多针对这些特征的治疗方案被广泛探
45、讨，比如抑制肿瘤血管生成、用射线或化学药物杀伤增生旺盛的细胞等等。本文则重点讨论了利用免疫学手段针对肿瘤的生物疗法。在 Coley 第一次利用大肠杆菌的提取物诱导抗肿瘤免疫后，大量的免疫方式被尝试。肿瘤裂解物疫苗的摸索、细胞因子的发现和使用、转染细胞因子的灭活肿瘤细胞的探索以及基于树突细胞基础上的肿瘤疫苗的制备都从不同的方向推动了抗肿瘤疫苗的发展。在这些前人工作的基础上，本论文分为以下三个部分对抗肿瘤免疫的诱导做了一些讨论。 在低剂量骨髓瘤诱导抗肿瘤免疫课题中我们探讨了一种利用未修饰的低剂量骨髓瘤细胞诱导肿瘤特异性免疫反应的方法。BALB/c 小鼠被 10lt;#39;4gt;活的树突-骨髓瘤
46、的融合细胞或 10lt;#39;3gt;活的骨髓瘤细胞免疫。结果表明，80的免疫小鼠在接种了 110lt;#39;6gt;骨髓瘤细胞后避免了肿瘤发生，而对照组小鼠则全部形成肿瘤。此外，用低剂量活骨髓瘤细胞免疫 C57BL/6 小鼠未见引起保护性免疫。同时，进一步的实验证明细胞免疫在抗肿瘤反应中起着主要作用。在过继免疫实验中，尾静脉注射免疫小鼠的淋巴细胞可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，而尾静脉注射免疫小鼠的血清则未引起显著差异。在 CTL 实验中，免疫小鼠的 T 淋巴细胞展现出裂解骨髓瘤细胞的能力。在与骨髓瘤细胞保温后，免疫小鼠的 Th 细胞分泌 IFN- 的量提升了 10 倍多，而 IL-4 则未
47、见显著改变。这些现象表明，用低剂量未修饰的活骨髓瘤细胞可以安全的免疫小鼠并且能够诱导抗肿瘤的保护性免疫。在转染 GM-CSF 基因骨髓瘤冻干粉课题中我们探讨了转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导的抗肿瘤效果。本课题采用荧光标记的抗体对肿瘤细胞内染色，鉴定重组 GM-CSF 基因的腺病毒转染效率，并采用夹心 ELISA 测定转染后骨髓瘤 GM-CSF 的分泌量。采用了BALB/c 小鼠骨髓瘤预防免疫的模型比较转染与未转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉的抗肿瘤效果，并通过免疫血清抗体滴度的检测和 CTL 实验探讨了该冻干粉产生抗肿瘤效果的机制。细胞内荧光染色表明，骨髓瘤细胞被重组 GM-
48、CSF 基因的腺病毒转染，且夹心 ELISA 测定其 GM-CSF 分泌量达到了 240ng/24h 每10lt;#39;6gt;个细胞。在小鼠骨髓瘤预防免疫模型中，单独的骨髓瘤冻干粉并未引起针对骨髓瘤的保护作用，而转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉则将小鼠存活率提升至 60。FACS 实验检测出免疫小鼠血清中存在针对骨髓瘤的抗体，而 CTL 实验则未见淋巴细胞诱导的骨髓瘤裂解。上述结果证明，转染 GM-CSF 基因的骨髓瘤冻干粉诱导了针对骨髓瘤抗体的产生，并具有抗肿瘤效果。 胸腺肽 lt;,1gt;是一种免疫增强剂，在抗病毒和抗肿瘤方面都有一定的疗效。在胸腺肽 lt;,1gt;课题中我们
49、探讨了胸腺肽 lt;,1gt;的原核表达、纯化和活性测定。本课题用 PCR 将化学合成的人胸腺肽 lt;,1gt;基因扩增并克隆到 pMD18-T 载体中，经过 KpnI/SacI 酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体 pET32b 中硫氧还蛋白下游。将重组质粒转化至表达宿主 BL21(DE3)中，经 IPTG 诱导，Zn-Sepharose亲和层析纯化以及复性处理，从每升菌液中可获得 35mg 硫氧还蛋白-胸腺肽lt;,1gt;融合蛋白。经凝血因子 Xa 酶切、Zn-Sepharose 亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得 38mg 重组人胸腺肽。小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。根据世界卫生组织和我国卫生部的统计，恶性肿瘤正严重的威胁着人类的健康，我国的情况也不容乐观。尽管健康的生活方式被倡导以及一些有效的治疗手段被研发出来，但是现状距离人类攻克肿瘤的目标还很遥远。 通过对癌基因的研究，人们发现肿瘤细胞衍生于正常细胞。它们与正常细胞相比有很多共同点，同时也有其独特的特
