1、内科学(血液学)专业优秀论文 伴 t(11;21)(q12;q22)的急性髓系白血病融合基因的克隆及初步功能研究关键词：急性髓系白血病 染色体易位 融合基因 转录因子摘要：急性白血病（acute leukemia，AL）是一组造血系统恶性克隆性疾病，常伴有获得性、再现性染色体异常，它们是 AL 诊断分型、制定治疗方案及微小残留病（minimal residual disease，MRD）监测的重要依据。大约 55%的 AL患者可检测到再现性染色体异常，其中最常见的是染色体易位。一些编码转录因子的基因常因染色体易位被破坏，并与其伙伴基因一起转录翻译成新的融合蛋白，干扰造血细胞增殖、分化及凋亡的正
2、常调控途径，从而促使 AL 发病或病情进展。参与编码转录因子 CBF 的基因 RUNX1（别名：AML1）是 AL 相关染色体易位中最常受累的基因之一，且能与多种基因发生易位，迄今报道涉及 AML1的平衡易位已达 30 余种，近 20 种伙伴基因被成功克隆，其伙伴基因的种类还在不断被丰富。本研究拟从一例伴 t（11；21） （q12；q22）的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的遗传学特点入手，定位克隆 AML1 的新伙伴基因及融合基因，并对其进行初步功能研究，以深化我们对 AML1 相关融合基因致白血病发生、发展机制的认识，从而有助于指导该类疾病的诊断、治
3、疗和预后评估。 方法： 1.通过 R 显带和 G 显带技术对一例 AMLM2 患者骨髓标本及 PHA 刺激的外周血标本进行核型分析；采用染色体涂染（chromosome painting，CP）及多色荧光原位杂交（multiplexfluorescence in situ hybridization，MFISH）验证核型分析结果；采用 AML1ETO 双色双融合探针单独或联合 11 号染色体涂染探针进行双色 FISH 初步检测位于 21q22 的受累基因；利用 RTPCR 检测 AML1ETO 融合基因的表达以初步排除 t（8；21）变异易位。随访 10 个月后对其临床特征进行总结。所有实验均
4、获得患者知情同意。2.采用 3cDNA 末端快速扩增（3Rapid Amplification of cDNA Ends，3RACE）技术克隆该易位中 AML1 的新伙伴基因（位于 11q12 的 LPXN基因） ；通过 RTPCR 以 AML1 和 LPXN 基因特异性引物从患者骨髓标本扩增融合基因 AML1LPXN 及 LPXNAML1 转录本；设计同一基因位于易位断裂点两侧的引物以 RTPCR 检测患者未被累及的 AML1 及 LPXN 等位基因的表达；根据后续功能研究的需要分别将 AML1B、LPXN、AML1LPXN（代表转录本 AL、ALs）及LPXNAML1 的全长编码区（cod
5、ing sequence，CDS）克隆到真核表达载体pEGFPN1 及 pcDNA3.1/mychis B，将 CBF 全长 CDS 分别克隆到 pDsRed2C1 及 pcDNA3.1/mychis B 载体。所构建的全部克隆均送测序鉴定。 3.采用瞬时转染观察野生型 AML1B、CBF、LPXN 及融合基因 AL、ALs、LPXNAML1翻译成的蛋白在 NIH3T3 细胞中的亚定位。 4.利用电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）观察融合蛋白 AL、ALs 与含 AML1 核心序列的 DNA 探针的结合；采用荧光素酶报告基因实验
6、观察融合蛋白对野生型 AML1B 转录活性的影响。 5.筛选稳定高表达 LPXN 基因及融合基因AL、ALs、LPXNAML1 的 NIH3T3 细胞，通过绘制生长曲线、软琼脂集落形成实验和 BALB/c 裸鼠皮下成瘤实验观察这些基因对正常 NIH3T3 细胞的恶性转化能力。 结果： 1.常规核型分析从该例患者骨髓标本检测到一种新的染色体异常：t（11；21） （q1?3；q22） ，其经 PHA 刺激的外周血标本为正常核型。染色体涂染及 MFISH 证实 11 号、21 号染色体发生相互易位。AML1ETO 双色双融合探针 FISH 检测发现该易位中 21q22 上受累的基因是 AML1，而
7、位于 8 号染色体的 ETO 基因未被累及。AML1ETO 探针联合 11 号染色体涂染探针双色 FISH结果证实一条 AML1 基因发生断裂，并与 11 号染色体来源的 DNA 片段并置。RTPCR 未检测到 AML1ETO 融合基因。该患者对化疗不敏感，生存期仅 10 个月，预后较差。 2.3RACE 结果显示该易位中 AML1 的伙伴基因是位于11q12 的 LPXN，RTPCR 检测到 4 种 AML1LPXN 转录本及 1 种 LPXNAML1 交叉转录本，并将该易位基因组水平的断裂点定位至 AML1 第 6 内含子、LPXN 第8 外显子第 835、836 个碱基之间及第 9 外显
8、子第 984、985 个碱基之间。该易位中未被累及的 AML1 及 LPXN 等位基因仍正常表达。各种真核表达载体中插入片段的序列、方向均正确，各目的基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）均未改变。 3.目的蛋白亚细胞定位结果显示：和文献报道的一致，AMLIB 蛋白定位于细胞核；CBF 蛋白在整个细胞均有表达，但以胞浆为主；LPXN 蛋白定位于细胞浆；AML1LPXN 代表性转录本 AL 及 ALs 表达的蛋白均定位于细胞核；LPXNAML1 蛋白定位于细胞浆；当分别与不同剂量AMLIB、AL、ALs 共转染时，CBFp 蛋白从主要定位于胞浆变为完全定位于细胞核。4.
9、 EMSA 结果表明：AML1LPXN 的转录本 AL 及 ALs 能与含 AML1 核心序列的DNA 探针发生特异性结合，CBF 与之共转染能增强这一结合。荧光素酶报告基因结果显示：AML1LPXN 的转录本 AL 及 ALs 呈剂量依赖性抑制 AML1B 对巨噬细胞集落刺激因子受体（macrophage colony stimulating factor receptor，MCSFR）启动子的转录激活作用。 5.稳定高表达转录本AL、ALs、LPXNAML1 及 LPXN 基因的 NIH3T3 细胞较仅表达 pEGFPN1 空载体的 NIH3T3 细胞增殖迅速，能在软琼脂上呈克隆性生长，并
10、能在 BALB/c 裸鼠皮下成瘤。 结论： 1.发现一种累及 AML1 基因的新获得性染色体易位：t（11；21） （q1?3；q22） 。 2.该易位中 AML1 的伙伴基因是位于 11q12 的LPXN，故其核型应重新描述为 t（11；21） （q12；q22） 。易位形成 4 种 AML1LPXN 转录本及 1 种 LPXNAML1 转录本。该易位基因组水平的断裂点分别位于AML1 第 6 内含子、LPXN 第 8 外显子第 835、836 个碱基之间及第 9 外显子第984、985 个碱基之间。 3.与野生型 AMLIB 蛋白一样，AML1LPXN 的转录本AL 及 ALs 表达的蛋白
11、位于细胞核内，且能与 CBF 发生亚细胞水平共定位，因而可能会与野生型 AML1B 蛋白竞争性结合 CBFp 并抑制其转录活性。而 LPXNAML1 蛋白定位于细胞浆，对 AML1B 蛋白的转录活性可能无明显影响。 4.AML1LPXN 可能通过竞争性结合 AML1B 特异性靶 DNA 序列抑制 AML1B 对 MCSFR 启动子的转录激活作用。 5.AML1LPXN 的转录本 AL 和 ALs、LPXNAML1 及 LPXN 表达的蛋白能使 NIH3T3 细胞获得增殖优势及恶性转化能力。正文内容急性白血病（acute leukemia，AL）是一组造血系统恶性克隆性疾病，常伴有获得性、再现性
12、染色体异常，它们是 AL 诊断分型、制定治疗方案及微小残留病（minimal residual disease，MRD）监测的重要依据。大约 55%的 AL 患者可检测到再现性染色体异常，其中最常见的是染色体易位。一些编码转录因子的基因常因染色体易位被破坏，并与其伙伴基因一起转录翻译成新的融合蛋白，干扰造血细胞增殖、分化及凋亡的正常调控途径，从而促使 AL 发病或病情进展。参与编码转录因子 CBF 的基因 RUNX1（别名：AML1）是 AL 相关染色体易位中最常受累的基因之一，且能与多种基因发生易位，迄今报道涉及 AML1 的平衡易位已达 30 余种，近 20 种伙伴基因被成功克隆，其伙伴基
13、因的种类还在不断被丰富。本研究拟从一例伴 t（11；21） （q12；q22）的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的遗传学特点入手，定位克隆 AML1 的新伙伴基因及融合基因，并对其进行初步功能研究，以深化我们对 AML1 相关融合基因致白血病发生、发展机制的认识，从而有助于指导该类疾病的诊断、治疗和预后评估。 方法： 1.通过 R 显带和 G 显带技术对一例 AMLM2 患者骨髓标本及 PHA 刺激的外周血标本进行核型分析；采用染色体涂染（chromosome painting，CP）及多色荧光原位杂交（multiplexfluorescence in s
14、itu hybridization，MFISH）验证核型分析结果；采用 AML1ETO 双色双融合探针单独或联合 11 号染色体涂染探针进行双色 FISH 初步检测位于 21q22 的受累基因；利用 RTPCR 检测 AML1ETO 融合基因的表达以初步排除 t（8；21）变异易位。随访 10 个月后对其临床特征进行总结。所有实验均获得患者知情同意。2.采用 3cDNA 末端快速扩增（3Rapid Amplification of cDNA Ends，3RACE）技术克隆该易位中 AML1 的新伙伴基因（位于 11q12 的 LPXN基因） ；通过 RTPCR 以 AML1 和 LPXN 基因
15、特异性引物从患者骨髓标本扩增融合基因 AML1LPXN 及 LPXNAML1 转录本；设计同一基因位于易位断裂点两侧的引物以 RTPCR 检测患者未被累及的 AML1 及 LPXN 等位基因的表达；根据后续功能研究的需要分别将 AML1B、LPXN、AML1LPXN（代表转录本 AL、ALs）及LPXNAML1 的全长编码区（coding sequence，CDS）克隆到真核表达载体pEGFPN1 及 pcDNA3.1/mychis B，将 CBF 全长 CDS 分别克隆到 pDsRed2C1 及 pcDNA3.1/mychis B 载体。所构建的全部克隆均送测序鉴定。 3.采用瞬时转染观察野
16、生型 AML1B、CBF、LPXN 及融合基因 AL、ALs、LPXNAML1翻译成的蛋白在 NIH3T3 细胞中的亚定位。 4.利用电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）观察融合蛋白 AL、ALs 与含 AML1 核心序列的 DNA 探针的结合；采用荧光素酶报告基因实验观察融合蛋白对野生型 AML1B 转录活性的影响。 5.筛选稳定高表达 LPXN 基因及融合基因AL、ALs、LPXNAML1 的 NIH3T3 细胞，通过绘制生长曲线、软琼脂集落形成实验和 BALB/c 裸鼠皮下成瘤实验观察这些基因对正常 NIH3T3 细胞的恶性
17、转化能力。 结果： 1.常规核型分析从该例患者骨髓标本检测到一种新的染色体异常：t（11；21） （q1?3；q22） ，其经 PHA 刺激的外周血标本为正常核型。染色体涂染及 MFISH 证实 11 号、21 号染色体发生相互易位。AML1ETO 双色双融合探针 FISH 检测发现该易位中 21q22 上受累的基因是 AML1，而位于 8 号染色体的 ETO 基因未被累及。AML1ETO 探针联合 11 号染色体涂染探针双色 FISH结果证实一条 AML1 基因发生断裂，并与 11 号染色体来源的 DNA 片段并置。RTPCR 未检测到 AML1ETO 融合基因。该患者对化疗不敏感，生存期仅
18、 10 个月，预后较差。 2.3RACE 结果显示该易位中 AML1 的伙伴基因是位于11q12 的 LPXN，RTPCR 检测到 4 种 AML1LPXN 转录本及 1 种 LPXNAML1 交叉转录本，并将该易位基因组水平的断裂点定位至 AML1 第 6 内含子、LPXN 第8 外显子第 835、836 个碱基之间及第 9 外显子第 984、985 个碱基之间。该易位中未被累及的 AML1 及 LPXN 等位基因仍正常表达。各种真核表达载体中插入片段的序列、方向均正确，各目的基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）均未改变。 3.目的蛋白亚细胞定位结果显示：和文献报
19、道的一致，AMLIB 蛋白定位于细胞核；CBF 蛋白在整个细胞均有表达，但以胞浆为主；LPXN 蛋白定位于细胞浆；AML1LPXN 代表性转录本 AL 及 ALs 表达的蛋白均定位于细胞核；LPXNAML1 蛋白定位于细胞浆；当分别与不同剂量AMLIB、AL、ALs 共转染时，CBFp 蛋白从主要定位于胞浆变为完全定位于细胞核。4. EMSA 结果表明：AML1LPXN 的转录本 AL 及 ALs 能与含 AML1 核心序列的DNA 探针发生特异性结合，CBF 与之共转染能增强这一结合。荧光素酶报告基因结果显示：AML1LPXN 的转录本 AL 及 ALs 呈剂量依赖性抑制 AML1B 对巨噬
20、细胞集落刺激因子受体（macrophage colony stimulating factor receptor，MCSFR）启动子的转录激活作用。 5.稳定高表达转录本AL、ALs、LPXNAML1 及 LPXN 基因的 NIH3T3 细胞较仅表达 pEGFPN1 空载体的 NIH3T3 细胞增殖迅速，能在软琼脂上呈克隆性生长，并能在 BALB/c 裸鼠皮下成瘤。 结论： 1.发现一种累及 AML1 基因的新获得性染色体易位：t（11；21） （q1?3；q22） 。 2.该易位中 AML1 的伙伴基因是位于 11q12 的LPXN，故其核型应重新描述为 t（11；21） （q12；q22）
21、 。易位形成 4 种 AML1LPXN 转录本及 1 种 LPXNAML1 转录本。该易位基因组水平的断裂点分别位于AML1 第 6 内含子、LPXN 第 8 外显子第 835、836 个碱基之间及第 9 外显子第984、985 个碱基之间。 3.与野生型 AMLIB 蛋白一样，AML1LPXN 的转录本AL 及 ALs 表达的蛋白位于细胞核内，且能与 CBF 发生亚细胞水平共定位，因而可能会与野生型 AML1B 蛋白竞争性结合 CBFp 并抑制其转录活性。而 LPXNAML1 蛋白定位于细胞浆，对 AML1B 蛋白的转录活性可能无明显影响。 4.AML1LPXN 可能通过竞争性结合 AML1
22、B 特异性靶 DNA 序列抑制 AML1B 对 MCSFR 启动子的转录激活作用。 5.AML1LPXN 的转录本 AL 和 ALs、LPXNAML1 及 LPXN 表达的蛋白能使 NIH3T3 细胞获得增殖优势及恶性转化能力。急性白血病（acute leukemia，AL）是一组造血系统恶性克隆性疾病，常伴有获得性、再现性染色体异常，它们是 AL 诊断分型、制定治疗方案及微小残留病（minimal residual disease，MRD）监测的重要依据。大约 55%的 AL 患者可检测到再现性染色体异常，其中最常见的是染色体易位。一些编码转录因子的基因常因染色体易位被破坏，并与其伙伴基因一
23、起转录翻译成新的融合蛋白，干扰造血细胞增殖、分化及凋亡的正常调控途径，从而促使 AL 发病或病情进展。参与编码转录因子 CBF 的基因 RUNX1（别名：AML1）是 AL 相关染色体易位中最常受累的基因之一，且能与多种基因发生易位，迄今报道涉及 AML1 的平衡易位已达 30 余种，近 20 种伙伴基因被成功克隆，其伙伴基因的种类还在不断被丰富。本研究拟从一例伴 t（11；21） （q12；q22）的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的遗传学特点入手，定位克隆 AML1 的新伙伴基因及融合基因，并对其进行初步功能研究，以深化我们对 AML1 相关融合基因致
24、白血病发生、发展机制的认识，从而有助于指导该类疾病的诊断、治疗和预后评估。方法： 1.通过 R 显带和 G 显带技术对一例 AMLM2 患者骨髓标本及 PHA刺激的外周血标本进行核型分析；采用染色体涂染（chromosome painting，CP）及多色荧光原位杂交（multiplexfluorescence in situ hybridization，MFISH）验证核型分析结果；采用 AML1ETO 双色双融合探针单独或联合 11 号染色体涂染探针进行双色 FISH 初步检测位于 21q22 的受累基因；利用 RTPCR 检测 AML1ETO 融合基因的表达以初步排除 t（8；21）变异
25、易位。随访 10 个月后对其临床特征进行总结。所有实验均获得患者知情同意。2.采用 3cDNA 末端快速扩增（3Rapid Amplification of cDNA Ends，3RACE）技术克隆该易位中 AML1 的新伙伴基因（位于 11q12 的 LPXN基因） ；通过 RTPCR 以 AML1 和 LPXN 基因特异性引物从患者骨髓标本扩增融合基因 AML1LPXN 及 LPXNAML1 转录本；设计同一基因位于易位断裂点两侧的引物以 RTPCR 检测患者未被累及的 AML1 及 LPXN 等位基因的表达；根据后续功能研究的需要分别将 AML1B、LPXN、AML1LPXN（代表转录本
26、 AL、ALs）及LPXNAML1 的全长编码区（coding sequence，CDS）克隆到真核表达载体pEGFPN1 及 pcDNA3.1/mychis B，将 CBF 全长 CDS 分别克隆到 pDsRed2C1 及 pcDNA3.1/mychis B 载体。所构建的全部克隆均送测序鉴定。 3.采用瞬时转染观察野生型 AML1B、CBF、LPXN 及融合基因 AL、ALs、LPXNAML1翻译成的蛋白在 NIH3T3 细胞中的亚定位。 4.利用电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）观察融合蛋白 AL、ALs 与含 AML1
27、核心序列的 DNA 探针的结合；采用荧光素酶报告基因实验观察融合蛋白对野生型 AML1B 转录活性的影响。 5.筛选稳定高表达 LPXN 基因及融合基因AL、ALs、LPXNAML1 的 NIH3T3 细胞，通过绘制生长曲线、软琼脂集落形成实验和 BALB/c 裸鼠皮下成瘤实验观察这些基因对正常 NIH3T3 细胞的恶性转化能力。 结果： 1.常规核型分析从该例患者骨髓标本检测到一种新的染色体异常：t（11；21） （q1?3；q22） ，其经 PHA 刺激的外周血标本为正常核型。染色体涂染及 MFISH 证实 11 号、21 号染色体发生相互易位。AML1ETO 双色双融合探针 FISH 检
28、测发现该易位中 21q22 上受累的基因是 AML1，而位于 8 号染色体的 ETO 基因未被累及。AML1ETO 探针联合 11 号染色体涂染探针双色 FISH结果证实一条 AML1 基因发生断裂，并与 11 号染色体来源的 DNA 片段并置。RTPCR 未检测到 AML1ETO 融合基因。该患者对化疗不敏感，生存期仅 10 个月，预后较差。 2.3RACE 结果显示该易位中 AML1 的伙伴基因是位于11q12 的 LPXN，RTPCR 检测到 4 种 AML1LPXN 转录本及 1 种 LPXNAML1 交叉转录本，并将该易位基因组水平的断裂点定位至 AML1 第 6 内含子、LPXN
29、第8 外显子第 835、836 个碱基之间及第 9 外显子第 984、985 个碱基之间。该易位中未被累及的 AML1 及 LPXN 等位基因仍正常表达。各种真核表达载体中插入片段的序列、方向均正确，各目的基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）均未改变。 3.目的蛋白亚细胞定位结果显示：和文献报道的一致，AMLIB 蛋白定位于细胞核；CBF 蛋白在整个细胞均有表达，但以胞浆为主；LPXN 蛋白定位于细胞浆；AML1LPXN 代表性转录本 AL 及 ALs 表达的蛋白均定位于细胞核；LPXNAML1 蛋白定位于细胞浆；当分别与不同剂量AMLIB、AL、ALs 共转染时，
30、CBFp 蛋白从主要定位于胞浆变为完全定位于细胞核。4. EMSA 结果表明：AML1LPXN 的转录本 AL 及 ALs 能与含 AML1 核心序列的DNA 探针发生特异性结合，CBF 与之共转染能增强这一结合。荧光素酶报告基因结果显示：AML1LPXN 的转录本 AL 及 ALs 呈剂量依赖性抑制 AML1B 对巨噬细胞集落刺激因子受体（macrophage colony stimulating factor receptor，MCSFR）启动子的转录激活作用。 5.稳定高表达转录本AL、ALs、LPXNAML1 及 LPXN 基因的 NIH3T3 细胞较仅表达 pEGFPN1 空载体的
31、NIH3T3 细胞增殖迅速，能在软琼脂上呈克隆性生长，并能在 BALB/c 裸鼠皮下成瘤。 结论： 1.发现一种累及 AML1 基因的新获得性染色体易位：t（11；21） （q1?3；q22） 。 2.该易位中 AML1 的伙伴基因是位于 11q12 的LPXN，故其核型应重新描述为 t（11；21） （q12；q22） 。易位形成 4 种 AML1LPXN 转录本及 1 种 LPXNAML1 转录本。该易位基因组水平的断裂点分别位于AML1 第 6 内含子、LPXN 第 8 外显子第 835、836 个碱基之间及第 9 外显子第984、985 个碱基之间。 3.与野生型 AMLIB 蛋白一样
32、，AML1LPXN 的转录本AL 及 ALs 表达的蛋白位于细胞核内，且能与 CBF 发生亚细胞水平共定位，因而可能会与野生型 AML1B 蛋白竞争性结合 CBFp 并抑制其转录活性。而 LPXNAML1 蛋白定位于细胞浆，对 AML1B 蛋白的转录活性可能无明显影响。 4.AML1LPXN 可能通过竞争性结合 AML1B 特异性靶 DNA 序列抑制 AML1B 对 MCSFR 启动子的转录激活作用。 5.AML1LPXN 的转录本 AL 和 ALs、LPXNAML1 及 LPXN 表达的蛋白能使 NIH3T3 细胞获得增殖优势及恶性转化能力。急性白血病（acute leukemia，AL）是
33、一组造血系统恶性克隆性疾病，常伴有获得性、再现性染色体异常，它们是 AL 诊断分型、制定治疗方案及微小残留病（minimal residual disease，MRD）监测的重要依据。大约 55%的 AL 患者可检测到再现性染色体异常，其中最常见的是染色体易位。一些编码转录因子的基因常因染色体易位被破坏，并与其伙伴基因一起转录翻译成新的融合蛋白，干扰造血细胞增殖、分化及凋亡的正常调控途径，从而促使 AL 发病或病情进展。参与编码转录因子 CBF 的基因 RUNX1（别名：AML1）是 AL 相关染色体易位中最常受累的基因之一，且能与多种基因发生易位，迄今报道涉及 AML1 的平衡易位已达 30
34、 余种，近 20 种伙伴基因被成功克隆，其伙伴基因的种类还在不断被丰富。本研究拟从一例伴 t（11；21） （q12；q22）的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的遗传学特点入手，定位克隆 AML1 的新伙伴基因及融合基因，并对其进行初步功能研究，以深化我们对 AML1 相关融合基因致白血病发生、发展机制的认识，从而有助于指导该类疾病的诊断、治疗和预后评估。方法： 1.通过 R 显带和 G 显带技术对一例 AMLM2 患者骨髓标本及 PHA刺激的外周血标本进行核型分析；采用染色体涂染（chromosome painting，CP）及多色荧光原位杂交（mult
35、iplexfluorescence in situ hybridization，MFISH）验证核型分析结果；采用 AML1ETO 双色双融合探针单独或联合 11 号染色体涂染探针进行双色 FISH 初步检测位于 21q22 的受累基因；利用 RTPCR 检测 AML1ETO 融合基因的表达以初步排除 t（8；21）变异易位。随访 10 个月后对其临床特征进行总结。所有实验均获得患者知情同意。2.采用 3cDNA 末端快速扩增（3Rapid Amplification of cDNA Ends，3RACE）技术克隆该易位中 AML1 的新伙伴基因（位于 11q12 的 LPXN基因） ；通过
36、RTPCR 以 AML1 和 LPXN 基因特异性引物从患者骨髓标本扩增融合基因 AML1LPXN 及 LPXNAML1 转录本；设计同一基因位于易位断裂点两侧的引物以 RTPCR 检测患者未被累及的 AML1 及 LPXN 等位基因的表达；根据后续功能研究的需要分别将 AML1B、LPXN、AML1LPXN（代表转录本 AL、ALs）及LPXNAML1 的全长编码区（coding sequence，CDS）克隆到真核表达载体pEGFPN1 及 pcDNA3.1/mychis B，将 CBF 全长 CDS 分别克隆到 pDsRed2C1 及 pcDNA3.1/mychis B 载体。所构建的全
37、部克隆均送测序鉴定。 3.采用瞬时转染观察野生型 AML1B、CBF、LPXN 及融合基因 AL、ALs、LPXNAML1翻译成的蛋白在 NIH3T3 细胞中的亚定位。 4.利用电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）观察融合蛋白 AL、ALs 与含 AML1 核心序列的 DNA 探针的结合；采用荧光素酶报告基因实验观察融合蛋白对野生型 AML1B 转录活性的影响。 5.筛选稳定高表达 LPXN 基因及融合基因AL、ALs、LPXNAML1 的 NIH3T3 细胞，通过绘制生长曲线、软琼脂集落形成实验和 BALB/c 裸鼠皮下成瘤实验
38、观察这些基因对正常 NIH3T3 细胞的恶性转化能力。 结果： 1.常规核型分析从该例患者骨髓标本检测到一种新的染色体异常：t（11；21） （q1?3；q22） ，其经 PHA 刺激的外周血标本为正常核型。染色体涂染及 MFISH 证实 11 号、21 号染色体发生相互易位。AML1ETO 双色双融合探针 FISH 检测发现该易位中 21q22 上受累的基因是 AML1，而位于 8 号染色体的 ETO 基因未被累及。AML1ETO 探针联合 11 号染色体涂染探针双色 FISH结果证实一条 AML1 基因发生断裂，并与 11 号染色体来源的 DNA 片段并置。RTPCR 未检测到 AML1E
39、TO 融合基因。该患者对化疗不敏感，生存期仅 10 个月，预后较差。 2.3RACE 结果显示该易位中 AML1 的伙伴基因是位于11q12 的 LPXN，RTPCR 检测到 4 种 AML1LPXN 转录本及 1 种 LPXNAML1 交叉转录本，并将该易位基因组水平的断裂点定位至 AML1 第 6 内含子、LPXN 第8 外显子第 835、836 个碱基之间及第 9 外显子第 984、985 个碱基之间。该易位中未被累及的 AML1 及 LPXN 等位基因仍正常表达。各种真核表达载体中插入片段的序列、方向均正确，各目的基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）均未改变
40、。 3.目的蛋白亚细胞定位结果显示：和文献报道的一致，AMLIB 蛋白定位于细胞核；CBF 蛋白在整个细胞均有表达，但以胞浆为主；LPXN 蛋白定位于细胞浆；AML1LPXN 代表性转录本 AL 及 ALs 表达的蛋白均定位于细胞核；LPXNAML1 蛋白定位于细胞浆；当分别与不同剂量AMLIB、AL、ALs 共转染时，CBFp 蛋白从主要定位于胞浆变为完全定位于细胞核。4. EMSA 结果表明：AML1LPXN 的转录本 AL 及 ALs 能与含 AML1 核心序列的DNA 探针发生特异性结合，CBF 与之共转染能增强这一结合。荧光素酶报告基因结果显示：AML1LPXN 的转录本 AL 及
41、ALs 呈剂量依赖性抑制 AML1B 对巨噬细胞集落刺激因子受体（macrophage colony stimulating factor receptor，MCSFR）启动子的转录激活作用。 5.稳定高表达转录本AL、ALs、LPXNAML1 及 LPXN 基因的 NIH3T3 细胞较仅表达 pEGFPN1 空载体的 NIH3T3 细胞增殖迅速，能在软琼脂上呈克隆性生长，并能在 BALB/c 裸鼠皮下成瘤。 结论： 1.发现一种累及 AML1 基因的新获得性染色体易位：t（11；21） （q1?3；q22） 。 2.该易位中 AML1 的伙伴基因是位于 11q12 的LPXN，故其核型应重新
42、描述为 t（11；21） （q12；q22） 。易位形成 4 种 AML1LPXN 转录本及 1 种 LPXNAML1 转录本。该易位基因组水平的断裂点分别位于AML1 第 6 内含子、LPXN 第 8 外显子第 835、836 个碱基之间及第 9 外显子第984、985 个碱基之间。 3.与野生型 AMLIB 蛋白一样，AML1LPXN 的转录本AL 及 ALs 表达的蛋白位于细胞核内，且能与 CBF 发生亚细胞水平共定位，因而可能会与野生型 AML1B 蛋白竞争性结合 CBFp 并抑制其转录活性。而 LPXNAML1 蛋白定位于细胞浆，对 AML1B 蛋白的转录活性可能无明显影响。 4.A
43、ML1LPXN 可能通过竞争性结合 AML1B 特异性靶 DNA 序列抑制 AML1B 对 MCSFR 启动子的转录激活作用。 5.AML1LPXN 的转录本 AL 和 ALs、LPXNAML1 及 LPXN 表达的蛋白能使 NIH3T3 细胞获得增殖优势及恶性转化能力。急性白血病（acute leukemia，AL）是一组造血系统恶性克隆性疾病，常伴有获得性、再现性染色体异常，它们是 AL 诊断分型、制定治疗方案及微小残留病（minimal residual disease，MRD）监测的重要依据。大约 55%的 AL 患者可检测到再现性染色体异常，其中最常见的是染色体易位。一些编码转录因子
44、的基因常因染色体易位被破坏，并与其伙伴基因一起转录翻译成新的融合蛋白，干扰造血细胞增殖、分化及凋亡的正常调控途径，从而促使 AL 发病或病情进展。参与编码转录因子 CBF 的基因 RUNX1（别名：AML1）是 AL 相关染色体易位中最常受累的基因之一，且能与多种基因发生易位，迄今报道涉及 AML1 的平衡易位已达 30 余种，近 20 种伙伴基因被成功克隆，其伙伴基因的种类还在不断被丰富。本研究拟从一例伴 t（11；21） （q12；q22）的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的遗传学特点入手，定位克隆 AML1 的新伙伴基因及融合基因，并对其进行初步功能
45、研究，以深化我们对 AML1 相关融合基因致白血病发生、发展机制的认识，从而有助于指导该类疾病的诊断、治疗和预后评估。方法： 1.通过 R 显带和 G 显带技术对一例 AMLM2 患者骨髓标本及 PHA刺激的外周血标本进行核型分析；采用染色体涂染（chromosome painting，CP）及多色荧光原位杂交（multiplexfluorescence in situ hybridization，MFISH）验证核型分析结果；采用 AML1ETO 双色双融合探针单独或联合 11 号染色体涂染探针进行双色 FISH 初步检测位于 21q22 的受累基因；利用 RTPCR 检测 AML1ETO
46、融合基因的表达以初步排除 t（8；21）变异易位。随访 10 个月后对其临床特征进行总结。所有实验均获得患者知情同意。2.采用 3cDNA 末端快速扩增（3Rapid Amplification of cDNA Ends，3RACE）技术克隆该易位中 AML1 的新伙伴基因（位于 11q12 的 LPXN基因） ；通过 RTPCR 以 AML1 和 LPXN 基因特异性引物从患者骨髓标本扩增融合基因 AML1LPXN 及 LPXNAML1 转录本；设计同一基因位于易位断裂点两侧的引物以 RTPCR 检测患者未被累及的 AML1 及 LPXN 等位基因的表达；根据后续功能研究的需要分别将 AML
47、1B、LPXN、AML1LPXN（代表转录本 AL、ALs）及LPXNAML1 的全长编码区（coding sequence，CDS）克隆到真核表达载体pEGFPN1 及 pcDNA3.1/mychis B，将 CBF 全长 CDS 分别克隆到 pDsRed2C1 及 pcDNA3.1/mychis B 载体。所构建的全部克隆均送测序鉴定。 3.采用瞬时转染观察野生型 AML1B、CBF、LPXN 及融合基因 AL、ALs、LPXNAML1翻译成的蛋白在 NIH3T3 细胞中的亚定位。 4.利用电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）
48、观察融合蛋白 AL、ALs 与含 AML1 核心序列的 DNA 探针的结合；采用荧光素酶报告基因实验观察融合蛋白对野生型 AML1B 转录活性的影响。 5.筛选稳定高表达 LPXN 基因及融合基因AL、ALs、LPXNAML1 的 NIH3T3 细胞，通过绘制生长曲线、软琼脂集落形成实验和 BALB/c 裸鼠皮下成瘤实验观察这些基因对正常 NIH3T3 细胞的恶性转化能力。 结果： 1.常规核型分析从该例患者骨髓标本检测到一种新的染色体异常：t（11；21） （q1?3；q22） ，其经 PHA 刺激的外周血标本为正常核型。染色体涂染及 MFISH 证实 11 号、21 号染色体发生相互易位。AML1ETO 双色双融合探针 FISH 检测发现该易位中 21q22 上受累的基因是 AML1，而位于 8 号染色体的 ETO 基因未被累及。AML1ETO 探针联合 11 号染色体涂染探针双色 FISH结果证实一条 AML1 基因发生断裂，并与 11 号染色体来源的 DNA 片段并置。RTPCR 未检测到 AML1ETO 融合基因。该患者对化疗不敏感，生存期仅 10 个月，预后较差。 2.3RACE 结果显示该易位中 AML1 的伙伴基因是位于11q12 的 LPXN，RTPCR 检测到 4 种 AML1LPXN 转录本及 1 种 LPXN
