1、外科学专业毕业论文 精品论文 以小耳残耳软骨细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究关键词：小耳畸形 种子细胞 组织工程 小耳残耳软骨细胞 体外培养 蛋白聚糖摘要：第一部分：小耳残耳软骨细胞的体外培养及生物学特性研究 目的：研究人的小耳残耳软骨细胞体外培养的方法及细胞的生物学特性。 方法：取56 岁小耳畸形患者的残耳软骨，采用 0.1的型胶原酶消化后，接种于含有胎牛血清的 Ham F-12 培养基，进行体外培养，同时观察其形态学改变。采用型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定，RT-PCR 检测各代细胞型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达。 结果：体外培养的小耳残耳软骨细胞的原代和早
2、期传代细胞以多角形或者三角形为主，随着传代次数的增加，细胞逐渐变为长梭形，到第 5 代时，几乎全部转变为梭形细胞。而且与正常耳廓软骨细胞相比，小耳残耳软骨细胞去分化的现象更为显著。第 1-3 代软骨细胞的型胶原抗体免疫组化染色阳性。在第 12 代细胞中，型胶原和 Aggrecan 的 mRNA表达水平较强，随传代次数增加，表达逐渐减弱，至第 4 代基本消失。 结论：体外培养的第 12 代小耳畸形患者的残耳软骨细胞可作为组织工程软骨的种子细胞。 第二部分：不同年龄患者的小耳残耳软骨细胞体外培养及其生物学特性研究 目的：观察年龄因素对体外培养的小耳残耳软骨细胞生物学特性的影响。 方法：取不同年龄组
3、小耳畸形患者的残耳软骨，分离出软骨细胞并进行培养，观察其形态学改变，测定细胞群体培增的时间。型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定。采用 RT-PCR 对各年龄组小耳残耳软骨细胞的型胶原和 Aggrecan mRNA 表达进行检测，并进行比较。 结果：各年龄组小耳畸形患者的残耳软骨细胞在细胞形态、细胞倍增时间、型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达方面均无显著差异。体外培养的小耳残耳软骨细胞随着传代次数的增加，从多角形逐渐变为长梭形。到第 5 代时，几乎全部转变成梭形细胞。细胞倍增时间显示，各年龄组的第 13 代细胞有旺盛的增殖力。各年龄组第13 代细胞的免疫组织化学染色均为阳性，1
4、 代和第 2 代细胞的型胶原和Aggrecan 的 mRNA 表达水平相对较高，第 3 代的表达明显下降，第 4 代起均不表达。 结论：体外培养的人小耳残耳软骨细胞的生物学特性不因年龄不同(630 岁)而改变，各年龄段(30 岁)的第 1 和第 2 代小耳残耳软骨细胞可作为软骨组织工程的种子细胞。 第三部分： 碱性成纤维细胞生长因子在小耳残耳软骨细胞体外培养中的作用 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖的影响。 方法：取小耳畸形患者的残耳软骨，用含 5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml4 种浓度 b-FGF 的 Ha
5、m F-12 培养液进行体外培养。采用 MTT 法观察 b-FGF 对细胞增殖的影响，RT-PCR 法检测 b-FGF 对体外培养的小耳残耳软骨细胞型胶原和 Aggrecan 分泌方面影响。结果：在含有 b-FGF 的培养液中培养的小耳残耳软骨细胞呈现成纤维细胞样贴壁生长，细胞的增殖速度明显加快(P0.05)，但在 10 ng/ml、25 ng/ml 和50 ng/ml3 种不同浓度 b-FGF 组之间，细胞增殖无显著差异(P0.05)，RT-PCR结果显示，各组的第 3 代软骨细胞仍存在型胶原和 Aggrecan 的表达。 结论：b-FGF 能够促进体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖，在 2 代
6、之内，细胞的表型和功能并没有改变。10 ng/ml 为 b-FGF 在小耳残耳软骨细胞体外培养中的最佳浓度。 第四部分：小耳残耳软骨细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究 目的：探讨利用小耳畸形患者的残耳软骨细胞为种子细胞，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。 方法：获取小耳畸形患者的残耳软骨，并以正常耳廓软骨作为对照，用含 10 ng/ml b-FGF 的培养液分别进行体外培养。将体外培养扩增的第 2 代小耳残耳软骨细胞以及正常耳廓软骨细胞以 50106/ml 的浓度与 30的 Pluronic F-127 混匀，分别注入到裸鼠的皮下，在 8 周时将标本分离取出，通过大体观察、组织学、免疫组
7、织化学染色等方法对新生成的软骨进行初步的评价。 结果：组织学检测显示，两种类型的软骨细胞均生成了新的软骨组织，该组织中细胞分布均匀，包埋在软骨陷窝内，有同源软骨细胞现象，可视为成熟的软骨组织，免疫组织化学染色显示，有特异性的型胶原分泌。 结论：以体外培养的第 2 代小耳残耳软骨细胞为种子细胞，可注射性生物材料 Pluronic F-127 为支架，能够在裸鼠体内成功地构建出组织工程软骨。正文内容第一部分：小耳残耳软骨细胞的体外培养及生物学特性研究 目的：研究人的小耳残耳软骨细胞体外培养的方法及细胞的生物学特性。 方法：取56 岁小耳畸形患者的残耳软骨，采用 0.1的型胶原酶消化后，接种于含有胎
8、牛血清的 Ham F-12 培养基，进行体外培养，同时观察其形态学改变。采用型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定，RT-PCR 检测各代细胞型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达。 结果：体外培养的小耳残耳软骨细胞的原代和早期传代细胞以多角形或者三角形为主，随着传代次数的增加，细胞逐渐变为长梭形，到第 5 代时，几乎全部转变为梭形细胞。而且与正常耳廓软骨细胞相比，小耳残耳软骨细胞去分化的现象更为显著。第 1-3 代软骨细胞的型胶原抗体免疫组化染色阳性。在第 12 代细胞中，型胶原和 Aggrecan 的 mRNA表达水平较强，随传代次数增加，表达逐渐减弱，至第 4 代基本消失。 结
9、论：体外培养的第 12 代小耳畸形患者的残耳软骨细胞可作为组织工程软骨的种子细胞。 第二部分：不同年龄患者的小耳残耳软骨细胞体外培养及其生物学特性研究 目的：观察年龄因素对体外培养的小耳残耳软骨细胞生物学特性的影响。 方法：取不同年龄组小耳畸形患者的残耳软骨，分离出软骨细胞并进行培养，观察其形态学改变，测定细胞群体培增的时间。型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定。采用 RT-PCR 对各年龄组小耳残耳软骨细胞的型胶原和 Aggrecan mRNA 表达进行检测，并进行比较。 结果：各年龄组小耳畸形患者的残耳软骨细胞在细胞形态、细胞倍增时间、型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达方面
10、均无显著差异。体外培养的小耳残耳软骨细胞随着传代次数的增加，从多角形逐渐变为长梭形。到第 5 代时，几乎全部转变成梭形细胞。细胞倍增时间显示，各年龄组的第 13 代细胞有旺盛的增殖力。各年龄组第13 代细胞的免疫组织化学染色均为阳性，1 代和第 2 代细胞的型胶原和Aggrecan 的 mRNA 表达水平相对较高，第 3 代的表达明显下降，第 4 代起均不表达。 结论：体外培养的人小耳残耳软骨细胞的生物学特性不因年龄不同(630 岁)而改变，各年龄段(30 岁)的第 1 和第 2 代小耳残耳软骨细胞可作为软骨组织工程的种子细胞。 第三部分： 碱性成纤维细胞生长因子在小耳残耳软骨细胞体外培养中的
11、作用 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖的影响。 方法：取小耳畸形患者的残耳软骨，用含 5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml4 种浓度 b-FGF 的 Ham F-12 培养液进行体外培养。采用 MTT 法观察 b-FGF 对细胞增殖的影响，RT-PCR 法检测 b-FGF 对体外培养的小耳残耳软骨细胞型胶原和 Aggrecan 分泌方面影响。结果：在含有 b-FGF 的培养液中培养的小耳残耳软骨细胞呈现成纤维细胞样贴壁生长，细胞的增殖速度明显加快(P0.05)，但在 10 ng/ml、25 ng/ml 和50 n
12、g/ml3 种不同浓度 b-FGF 组之间，细胞增殖无显著差异(P0.05)，RT-PCR结果显示，各组的第 3 代软骨细胞仍存在型胶原和 Aggrecan 的表达。 结论：b-FGF 能够促进体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖，在 2 代之内，细胞的表型和功能并没有改变。10 ng/ml 为 b-FGF 在小耳残耳软骨细胞体外培养中的最佳浓度。 第四部分：小耳残耳软骨细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究 目的：探讨利用小耳畸形患者的残耳软骨细胞为种子细胞，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。 方法：获取小耳畸形患者的残耳软骨，并以正常耳廓软骨作为对照，用含 10 ng/ml b-FGF 的培养
13、液分别进行体外培养。将体外培养扩增的第 2 代小耳残耳软骨细胞以及正常耳廓软骨细胞以 50106/ml 的浓度与 30的 Pluronic F-127 混匀，分别注入到裸鼠的皮下，在 8 周时将标本分离取出，通过大体观察、组织学、免疫组织化学染色等方法对新生成的软骨进行初步的评价。 结果：组织学检测显示，两种类型的软骨细胞均生成了新的软骨组织，该组织中细胞分布均匀，包埋在软骨陷窝内，有同源软骨细胞现象，可视为成熟的软骨组织，免疫组织化学染色显示，有特异性的型胶原分泌。 结论：以体外培养的第 2 代小耳残耳软骨细胞为种子细胞，可注射性生物材料 Pluronic F-127 为支架，能够在裸鼠体内
14、成功地构建出组织工程软骨。第一部分：小耳残耳软骨细胞的体外培养及生物学特性研究 目的：研究人的小耳残耳软骨细胞体外培养的方法及细胞的生物学特性。 方法：取 56 岁小耳畸形患者的残耳软骨，采用 0.1的型胶原酶消化后，接种于含有胎牛血清的 Ham F-12 培养基，进行体外培养，同时观察其形态学改变。采用型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定，RT-PCR 检测各代细胞型胶原和Aggrecan mRNA 的表达。 结果：体外培养的小耳残耳软骨细胞的原代和早期传代细胞以多角形或者三角形为主，随着传代次数的增加，细胞逐渐变为长梭形，到第 5 代时，几乎全部转变为梭形细胞。而且与正常耳廓软骨细胞
15、相比，小耳残耳软骨细胞去分化的现象更为显著。第 1-3 代软骨细胞的型胶原抗体免疫组化染色阳性。在第 12 代细胞中，型胶原和 Aggrecan 的 mRNA 表达水平较强，随传代次数增加，表达逐渐减弱，至第 4 代基本消失。 结论：体外培养的第 12 代小耳畸形患者的残耳软骨细胞可作为组织工程软骨的种子细胞。第二部分：不同年龄患者的小耳残耳软骨细胞体外培养及其生物学特性研究 目的：观察年龄因素对体外培养的小耳残耳软骨细胞生物学特性的影响。 方法：取不同年龄组小耳畸形患者的残耳软骨，分离出软骨细胞并进行培养，观察其形态学改变，测定细胞群体培增的时间。型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定。
16、采用 RT-PCR 对各年龄组小耳残耳软骨细胞的型胶原和Aggrecan mRNA 表达进行检测，并进行比较。 结果：各年龄组小耳畸形患者的残耳软骨细胞在细胞形态、细胞倍增时间、型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达方面均无显著差异。体外培养的小耳残耳软骨细胞随着传代次数的增加，从多角形逐渐变为长梭形。到第 5 代时，几乎全部转变成梭形细胞。细胞倍增时间显示，各年龄组的第 13 代细胞有旺盛的增殖力。各年龄组第 13 代细胞的免疫组织化学染色均为阳性，1 代和第 2 代细胞的型胶原和 Aggrecan 的mRNA 表达水平相对较高，第 3 代的表达明显下降，第 4 代起均不表达。 结论：
17、体外培养的人小耳残耳软骨细胞的生物学特性不因年龄不同(630 岁)而改变，各年龄段(30 岁)的第 1 和第 2 代小耳残耳软骨细胞可作为软骨组织工程的种子细胞。 第三部分： 碱性成纤维细胞生长因子在小耳残耳软骨细胞体外培养中的作用 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖的影响。 方法：取小耳畸形患者的残耳软骨，用含5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml4 种浓度 b-FGF 的 Ham F-12 培养液进行体外培养。采用 MTT 法观察 b-FGF 对细胞增殖的影响，RT-PCR 法检测 b-FGF 对体外培养的小耳残
18、耳软骨细胞型胶原和 Aggrecan 分泌方面影响。 结果：在含有 b-FGF 的培养液中培养的小耳残耳软骨细胞呈现成纤维细胞样贴壁生长，细胞的增殖速度明显加快(P0.05)，但在 10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml3 种不同浓度 b-FGF 组之间，细胞增殖无显著差异(P0.05)，RT-PCR 结果显示，各组的第 3 代软骨细胞仍存在型胶原和 Aggrecan 的表达。 结论：b-FGF 能够促进体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖，在 2 代之内，细胞的表型和功能并没有改变。10 ng/ml 为 b-FGF 在小耳残耳软骨细胞体外培养中的最佳浓度。 第四部分：小耳残耳软骨
19、细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究 目的：探讨利用小耳畸形患者的残耳软骨细胞为种子细胞，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。 方法：获取小耳畸形患者的残耳软骨，并以正常耳廓软骨作为对照，用含 10 ng/ml b-FGF 的培养液分别进行体外培养。将体外培养扩增的第 2 代小耳残耳软骨细胞以及正常耳廓软骨细胞以 50106/ml 的浓度与30的 Pluronic F-127 混匀，分别注入到裸鼠的皮下，在 8 周时将标本分离取出，通过大体观察、组织学、免疫组织化学染色等方法对新生成的软骨进行初步的评价。 结果：组织学检测显示，两种类型的软骨细胞均生成了新的软骨组织，该组织中细胞分布均匀，包
20、埋在软骨陷窝内，有同源软骨细胞现象，可视为成熟的软骨组织，免疫组织化学染色显示，有特异性的型胶原分泌。 结论：以体外培养的第 2 代小耳残耳软骨细胞为种子细胞，可注射性生物材料Pluronic F-127 为支架，能够在裸鼠体内成功地构建出组织工程软骨。第一部分：小耳残耳软骨细胞的体外培养及生物学特性研究 目的：研究人的小耳残耳软骨细胞体外培养的方法及细胞的生物学特性。 方法：取 56 岁小耳畸形患者的残耳软骨，采用 0.1的型胶原酶消化后，接种于含有胎牛血清的 Ham F-12 培养基，进行体外培养，同时观察其形态学改变。采用型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定，RT-PCR 检测各代
21、细胞型胶原和Aggrecan mRNA 的表达。 结果：体外培养的小耳残耳软骨细胞的原代和早期传代细胞以多角形或者三角形为主，随着传代次数的增加，细胞逐渐变为长梭形，到第 5 代时，几乎全部转变为梭形细胞。而且与正常耳廓软骨细胞相比，小耳残耳软骨细胞去分化的现象更为显著。第 1-3 代软骨细胞的型胶原抗体免疫组化染色阳性。在第 12 代细胞中，型胶原和 Aggrecan 的 mRNA 表达水平较强，随传代次数增加，表达逐渐减弱，至第 4 代基本消失。 结论：体外培养的第 12 代小耳畸形患者的残耳软骨细胞可作为组织工程软骨的种子细胞。第二部分：不同年龄患者的小耳残耳软骨细胞体外培养及其生物学特
22、性研究 目的：观察年龄因素对体外培养的小耳残耳软骨细胞生物学特性的影响。 方法：取不同年龄组小耳畸形患者的残耳软骨，分离出软骨细胞并进行培养，观察其形态学改变，测定细胞群体培增的时间。型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定。采用 RT-PCR 对各年龄组小耳残耳软骨细胞的型胶原和Aggrecan mRNA 表达进行检测，并进行比较。 结果：各年龄组小耳畸形患者的残耳软骨细胞在细胞形态、细胞倍增时间、型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达方面均无显著差异。体外培养的小耳残耳软骨细胞随着传代次数的增加，从多角形逐渐变为长梭形。到第 5 代时，几乎全部转变成梭形细胞。细胞倍增时间显示，各年
23、龄组的第 13 代细胞有旺盛的增殖力。各年龄组第 13 代细胞的免疫组织化学染色均为阳性，1 代和第 2 代细胞的型胶原和 Aggrecan 的mRNA 表达水平相对较高，第 3 代的表达明显下降，第 4 代起均不表达。 结论：体外培养的人小耳残耳软骨细胞的生物学特性不因年龄不同(630 岁)而改变，各年龄段(30 岁)的第 1 和第 2 代小耳残耳软骨细胞可作为软骨组织工程的种子细胞。 第三部分： 碱性成纤维细胞生长因子在小耳残耳软骨细胞体外培养中的作用 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖的影响。 方法：取小耳畸形患者的残耳软骨，用含5 ng/ml
24、、10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml4 种浓度 b-FGF 的 Ham F-12 培养液进行体外培养。采用 MTT 法观察 b-FGF 对细胞增殖的影响，RT-PCR 法检测 b-FGF 对体外培养的小耳残耳软骨细胞型胶原和 Aggrecan 分泌方面影响。 结果：在含有 b-FGF 的培养液中培养的小耳残耳软骨细胞呈现成纤维细胞样贴壁生长，细胞的增殖速度明显加快(P0.05)，但在 10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml3 种不同浓度 b-FGF 组之间，细胞增殖无显著差异(P0.05)，RT-PCR 结果显示，各组的第 3 代软骨细胞仍存在型胶原和
25、Aggrecan 的表达。 结论：b-FGF 能够促进体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖，在 2 代之内，细胞的表型和功能并没有改变。10 ng/ml 为 b-FGF 在小耳残耳软骨细胞体外培养中的最佳浓度。 第四部分：小耳残耳软骨细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究 目的：探讨利用小耳畸形患者的残耳软骨细胞为种子细胞，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。 方法：获取小耳畸形患者的残耳软骨，并以正常耳廓软骨作为对照，用含 10 ng/ml b-FGF 的培养液分别进行体外培养。将体外培养扩增的第 2 代小耳残耳软骨细胞以及正常耳廓软骨细胞以 50106/ml 的浓度与30的 Pluronic F
26、-127 混匀，分别注入到裸鼠的皮下，在 8 周时将标本分离取出，通过大体观察、组织学、免疫组织化学染色等方法对新生成的软骨进行初步的评价。 结果：组织学检测显示，两种类型的软骨细胞均生成了新的软骨组织，该组织中细胞分布均匀，包埋在软骨陷窝内，有同源软骨细胞现象，可视为成熟的软骨组织，免疫组织化学染色显示，有特异性的型胶原分泌。 结论：以体外培养的第 2 代小耳残耳软骨细胞为种子细胞，可注射性生物材料Pluronic F-127 为支架，能够在裸鼠体内成功地构建出组织工程软骨。第一部分：小耳残耳软骨细胞的体外培养及生物学特性研究 目的：研究人的小耳残耳软骨细胞体外培养的方法及细胞的生物学特性。
27、 方法：取 56 岁小耳畸形患者的残耳软骨，采用 0.1的型胶原酶消化后，接种于含有胎牛血清的 Ham F-12 培养基，进行体外培养，同时观察其形态学改变。采用型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定，RT-PCR 检测各代细胞型胶原和Aggrecan mRNA 的表达。 结果：体外培养的小耳残耳软骨细胞的原代和早期传代细胞以多角形或者三角形为主，随着传代次数的增加，细胞逐渐变为长梭形，到第 5 代时，几乎全部转变为梭形细胞。而且与正常耳廓软骨细胞相比，小耳残耳软骨细胞去分化的现象更为显著。第 1-3 代软骨细胞的型胶原抗体免疫组化染色阳性。在第 12 代细胞中，型胶原和 Aggrecan
28、 的 mRNA 表达水平较强，随传代次数增加，表达逐渐减弱，至第 4 代基本消失。 结论：体外培养的第 12 代小耳畸形患者的残耳软骨细胞可作为组织工程软骨的种子细胞。第二部分：不同年龄患者的小耳残耳软骨细胞体外培养及其生物学特性研究 目的：观察年龄因素对体外培养的小耳残耳软骨细胞生物学特性的影响。 方法：取不同年龄组小耳畸形患者的残耳软骨，分离出软骨细胞并进行培养，观察其形态学改变，测定细胞群体培增的时间。型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定。采用 RT-PCR 对各年龄组小耳残耳软骨细胞的型胶原和Aggrecan mRNA 表达进行检测，并进行比较。 结果：各年龄组小耳畸形患者的残耳
29、软骨细胞在细胞形态、细胞倍增时间、型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达方面均无显著差异。体外培养的小耳残耳软骨细胞随着传代次数的增加，从多角形逐渐变为长梭形。到第 5 代时，几乎全部转变成梭形细胞。细胞倍增时间显示，各年龄组的第 13 代细胞有旺盛的增殖力。各年龄组第 13 代细胞的免疫组织化学染色均为阳性，1 代和第 2 代细胞的型胶原和 Aggrecan 的mRNA 表达水平相对较高，第 3 代的表达明显下降，第 4 代起均不表达。 结论：体外培养的人小耳残耳软骨细胞的生物学特性不因年龄不同(630 岁)而改变，各年龄段(30 岁)的第 1 和第 2 代小耳残耳软骨细胞可作为软骨组
30、织工程的种子细胞。 第三部分： 碱性成纤维细胞生长因子在小耳残耳软骨细胞体外培养中的作用 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖的影响。 方法：取小耳畸形患者的残耳软骨，用含5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml4 种浓度 b-FGF 的 Ham F-12 培养液进行体外培养。采用 MTT 法观察 b-FGF 对细胞增殖的影响，RT-PCR 法检测 b-FGF 对体外培养的小耳残耳软骨细胞型胶原和 Aggrecan 分泌方面影响。 结果：在含有 b-FGF 的培养液中培养的小耳残耳软骨细胞呈现成纤维细胞样贴壁生长，细胞的
31、增殖速度明显加快(P0.05)，但在 10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml3 种不同浓度 b-FGF 组之间，细胞增殖无显著差异(P0.05)，RT-PCR 结果显示，各组的第 3 代软骨细胞仍存在型胶原和 Aggrecan 的表达。 结论：b-FGF 能够促进体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖，在 2 代之内，细胞的表型和功能并没有改变。10 ng/ml 为 b-FGF 在小耳残耳软骨细胞体外培养中的最佳浓度。 第四部分：小耳残耳软骨细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究 目的：探讨利用小耳畸形患者的残耳软骨细胞为种子细胞，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。 方法：获取小耳
32、畸形患者的残耳软骨，并以正常耳廓软骨作为对照，用含 10 ng/ml b-FGF 的培养液分别进行体外培养。将体外培养扩增的第 2 代小耳残耳软骨细胞以及正常耳廓软骨细胞以 50106/ml 的浓度与30的 Pluronic F-127 混匀，分别注入到裸鼠的皮下，在 8 周时将标本分离取出，通过大体观察、组织学、免疫组织化学染色等方法对新生成的软骨进行初步的评价。 结果：组织学检测显示，两种类型的软骨细胞均生成了新的软骨组织，该组织中细胞分布均匀，包埋在软骨陷窝内，有同源软骨细胞现象，可视为成熟的软骨组织，免疫组织化学染色显示，有特异性的型胶原分泌。 结论：以体外培养的第 2 代小耳残耳软骨
33、细胞为种子细胞，可注射性生物材料Pluronic F-127 为支架，能够在裸鼠体内成功地构建出组织工程软骨。第一部分：小耳残耳软骨细胞的体外培养及生物学特性研究 目的：研究人的小耳残耳软骨细胞体外培养的方法及细胞的生物学特性。 方法：取 56 岁小耳畸形患者的残耳软骨，采用 0.1的型胶原酶消化后，接种于含有胎牛血清的 Ham F-12 培养基，进行体外培养，同时观察其形态学改变。采用型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定，RT-PCR 检测各代细胞型胶原和Aggrecan mRNA 的表达。 结果：体外培养的小耳残耳软骨细胞的原代和早期传代细胞以多角形或者三角形为主，随着传代次数的增加
34、，细胞逐渐变为长梭形，到第 5 代时，几乎全部转变为梭形细胞。而且与正常耳廓软骨细胞相比，小耳残耳软骨细胞去分化的现象更为显著。第 1-3 代软骨细胞的型胶原抗体免疫组化染色阳性。在第 12 代细胞中，型胶原和 Aggrecan 的 mRNA 表达水平较强，随传代次数增加，表达逐渐减弱，至第 4 代基本消失。 结论：体外培养的第 12 代小耳畸形患者的残耳软骨细胞可作为组织工程软骨的种子细胞。第二部分：不同年龄患者的小耳残耳软骨细胞体外培养及其生物学特性研究 目的：观察年龄因素对体外培养的小耳残耳软骨细胞生物学特性的影响。 方法：取不同年龄组小耳畸形患者的残耳软骨，分离出软骨细胞并进行培养，观
35、察其形态学改变，测定细胞群体培增的时间。型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定。采用 RT-PCR 对各年龄组小耳残耳软骨细胞的型胶原和Aggrecan mRNA 表达进行检测，并进行比较。 结果：各年龄组小耳畸形患者的残耳软骨细胞在细胞形态、细胞倍增时间、型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达方面均无显著差异。体外培养的小耳残耳软骨细胞随着传代次数的增加，从多角形逐渐变为长梭形。到第 5 代时，几乎全部转变成梭形细胞。细胞倍增时间显示，各年龄组的第 13 代细胞有旺盛的增殖力。各年龄组第 13 代细胞的免疫组织化学染色均为阳性，1 代和第 2 代细胞的型胶原和 Aggrecan 的
36、mRNA 表达水平相对较高，第 3 代的表达明显下降，第 4 代起均不表达。 结论：体外培养的人小耳残耳软骨细胞的生物学特性不因年龄不同(630 岁)而改变，各年龄段(30 岁)的第 1 和第 2 代小耳残耳软骨细胞可作为软骨组织工程的种子细胞。 第三部分： 碱性成纤维细胞生长因子在小耳残耳软骨细胞体外培养中的作用 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖的影响。 方法：取小耳畸形患者的残耳软骨，用含5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml4 种浓度 b-FGF 的 Ham F-12 培养液进行体外培养。采用 MTT 法观察
37、 b-FGF 对细胞增殖的影响，RT-PCR 法检测 b-FGF 对体外培养的小耳残耳软骨细胞型胶原和 Aggrecan 分泌方面影响。 结果：在含有 b-FGF 的培养液中培养的小耳残耳软骨细胞呈现成纤维细胞样贴壁生长，细胞的增殖速度明显加快(P0.05)，但在 10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml3 种不同浓度 b-FGF 组之间，细胞增殖无显著差异(P0.05)，RT-PCR 结果显示，各组的第 3 代软骨细胞仍存在型胶原和 Aggrecan 的表达。 结论：b-FGF 能够促进体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖，在 2 代之内，细胞的表型和功能并没有改变。10 ng/m
38、l 为 b-FGF 在小耳残耳软骨细胞体外培养中的最佳浓度。 第四部分：小耳残耳软骨细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究 目的：探讨利用小耳畸形患者的残耳软骨细胞为种子细胞，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。 方法：获取小耳畸形患者的残耳软骨，并以正常耳廓软骨作为对照，用含 10 ng/ml b-FGF 的培养液分别进行体外培养。将体外培养扩增的第 2 代小耳残耳软骨细胞以及正常耳廓软骨细胞以 50106/ml 的浓度与30的 Pluronic F-127 混匀，分别注入到裸鼠的皮下，在 8 周时将标本分离取出，通过大体观察、组织学、免疫组织化学染色等方法对新生成的软骨进行初步的评价。 结
39、果：组织学检测显示，两种类型的软骨细胞均生成了新的软骨组织，该组织中细胞分布均匀，包埋在软骨陷窝内，有同源软骨细胞现象，可视为成熟的软骨组织，免疫组织化学染色显示，有特异性的型胶原分泌。 结论：以体外培养的第 2 代小耳残耳软骨细胞为种子细胞，可注射性生物材料Pluronic F-127 为支架，能够在裸鼠体内成功地构建出组织工程软骨。第一部分：小耳残耳软骨细胞的体外培养及生物学特性研究 目的：研究人的小耳残耳软骨细胞体外培养的方法及细胞的生物学特性。 方法：取 56 岁小耳畸形患者的残耳软骨，采用 0.1的型胶原酶消化后，接种于含有胎牛血清的 Ham F-12 培养基，进行体外培养，同时观察
40、其形态学改变。采用型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定，RT-PCR 检测各代细胞型胶原和Aggrecan mRNA 的表达。 结果：体外培养的小耳残耳软骨细胞的原代和早期传代细胞以多角形或者三角形为主，随着传代次数的增加，细胞逐渐变为长梭形，到第 5 代时，几乎全部转变为梭形细胞。而且与正常耳廓软骨细胞相比，小耳残耳软骨细胞去分化的现象更为显著。第 1-3 代软骨细胞的型胶原抗体免疫组化染色阳性。在第 12 代细胞中，型胶原和 Aggrecan 的 mRNA 表达水平较强，随传代次数增加，表达逐渐减弱，至第 4 代基本消失。 结论：体外培养的第 12 代小耳畸形患者的残耳软骨细胞可作为
41、组织工程软骨的种子细胞。第二部分：不同年龄患者的小耳残耳软骨细胞体外培养及其生物学特性研究 目的：观察年龄因素对体外培养的小耳残耳软骨细胞生物学特性的影响。 方法：取不同年龄组小耳畸形患者的残耳软骨，分离出软骨细胞并进行培养，观察其形态学改变，测定细胞群体培增的时间。型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定。采用 RT-PCR 对各年龄组小耳残耳软骨细胞的型胶原和Aggrecan mRNA 表达进行检测，并进行比较。 结果：各年龄组小耳畸形患者的残耳软骨细胞在细胞形态、细胞倍增时间、型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达方面均无显著差异。体外培养的小耳残耳软骨细胞随着传代次数的增加，从
42、多角形逐渐变为长梭形。到第 5 代时，几乎全部转变成梭形细胞。细胞倍增时间显示，各年龄组的第 13 代细胞有旺盛的增殖力。各年龄组第 13 代细胞的免疫组织化学染色均为阳性，1 代和第 2 代细胞的型胶原和 Aggrecan 的mRNA 表达水平相对较高，第 3 代的表达明显下降，第 4 代起均不表达。 结论：体外培养的人小耳残耳软骨细胞的生物学特性不因年龄不同(630 岁)而改变，各年龄段(30 岁)的第 1 和第 2 代小耳残耳软骨细胞可作为软骨组织工程的种子细胞。 第三部分： 碱性成纤维细胞生长因子在小耳残耳软骨细胞体外培养中的作用 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培
43、养的小耳残耳软骨细胞增殖的影响。 方法：取小耳畸形患者的残耳软骨，用含5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml4 种浓度 b-FGF 的 Ham F-12 培养液进行体外培养。采用 MTT 法观察 b-FGF 对细胞增殖的影响，RT-PCR 法检测 b-FGF 对体外培养的小耳残耳软骨细胞型胶原和 Aggrecan 分泌方面影响。 结果：在含有 b-FGF 的培养液中培养的小耳残耳软骨细胞呈现成纤维细胞样贴壁生长，细胞的增殖速度明显加快(P0.05)，但在 10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml3 种不同浓度 b-FGF 组之间，细胞增殖无显著
44、差异(P0.05)，RT-PCR 结果显示，各组的第 3 代软骨细胞仍存在型胶原和 Aggrecan 的表达。 结论：b-FGF 能够促进体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖，在 2 代之内，细胞的表型和功能并没有改变。10 ng/ml 为 b-FGF 在小耳残耳软骨细胞体外培养中的最佳浓度。 第四部分：小耳残耳软骨细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究 目的：探讨利用小耳畸形患者的残耳软骨细胞为种子细胞，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。 方法：获取小耳畸形患者的残耳软骨，并以正常耳廓软骨作为对照，用含 10 ng/ml b-FGF 的培养液分别进行体外培养。将体外培养扩增的第 2 代小耳残耳软
45、骨细胞以及正常耳廓软骨细胞以 50106/ml 的浓度与30的 Pluronic F-127 混匀，分别注入到裸鼠的皮下，在 8 周时将标本分离取出，通过大体观察、组织学、免疫组织化学染色等方法对新生成的软骨进行初步的评价。 结果：组织学检测显示，两种类型的软骨细胞均生成了新的软骨组织，该组织中细胞分布均匀，包埋在软骨陷窝内，有同源软骨细胞现象，可视为成熟的软骨组织，免疫组织化学染色显示，有特异性的型胶原分泌。 结论：以体外培养的第 2 代小耳残耳软骨细胞为种子细胞，可注射性生物材料Pluronic F-127 为支架，能够在裸鼠体内成功地构建出组织工程软骨。第一部分：小耳残耳软骨细胞的体外培
46、养及生物学特性研究 目的：研究人的小耳残耳软骨细胞体外培养的方法及细胞的生物学特性。 方法：取 56 岁小耳畸形患者的残耳软骨，采用 0.1的型胶原酶消化后，接种于含有胎牛血清的 Ham F-12 培养基，进行体外培养，同时观察其形态学改变。采用型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定，RT-PCR 检测各代细胞型胶原和Aggrecan mRNA 的表达。 结果：体外培养的小耳残耳软骨细胞的原代和早期传代细胞以多角形或者三角形为主，随着传代次数的增加，细胞逐渐变为长梭形，到第 5 代时，几乎全部转变为梭形细胞。而且与正常耳廓软骨细胞相比，小耳残耳软骨细胞去分化的现象更为显著。第 1-3 代软
47、骨细胞的型胶原抗体免疫组化染色阳性。在第 12 代细胞中，型胶原和 Aggrecan 的 mRNA 表达水平较强，随传代次数增加，表达逐渐减弱，至第 4 代基本消失。 结论：体外培养的第 12 代小耳畸形患者的残耳软骨细胞可作为组织工程软骨的种子细胞。第二部分：不同年龄患者的小耳残耳软骨细胞体外培养及其生物学特性研究 目的：观察年龄因素对体外培养的小耳残耳软骨细胞生物学特性的影响。 方法：取不同年龄组小耳畸形患者的残耳软骨，分离出软骨细胞并进行培养，观察其形态学改变，测定细胞群体培增的时间。型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定。采用 RT-PCR 对各年龄组小耳残耳软骨细胞的型胶原和Ag
48、grecan mRNA 表达进行检测，并进行比较。 结果：各年龄组小耳畸形患者的残耳软骨细胞在细胞形态、细胞倍增时间、型胶原和 Aggrecan mRNA 的表达方面均无显著差异。体外培养的小耳残耳软骨细胞随着传代次数的增加，从多角形逐渐变为长梭形。到第 5 代时，几乎全部转变成梭形细胞。细胞倍增时间显示，各年龄组的第 13 代细胞有旺盛的增殖力。各年龄组第 13 代细胞的免疫组织化学染色均为阳性，1 代和第 2 代细胞的型胶原和 Aggrecan 的mRNA 表达水平相对较高，第 3 代的表达明显下降，第 4 代起均不表达。 结论：体外培养的人小耳残耳软骨细胞的生物学特性不因年龄不同(630 岁)而改变，各年龄段(30 岁)的第 1 和第 2 代小耳残耳软骨细胞可作为软骨组织工程的种子细胞。 第三部分： 碱性成纤维细胞生长因子在小耳残耳软骨细胞体外培养中的作用 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖的影响。 方法：取小耳畸形患者的残耳软骨，用含5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml 和 50 ng/ml4 种浓度 b-FGF 的 Ham F-12 培养液进行体外培养。采用 MTT 法观察 b-FGF 对细胞增殖的影响，RT-PCR 法检测 b-FGF 对体外培养的小耳残耳软骨细胞
